馬鐵菊頭蝠在西藏首次發(fā)現(xiàn)

何敏怡， 鄧汶圃， 李彥男， 謝慧嫻， 梁曉玲， 岳陽， 吳毅 ， 余文華

（廣州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，華南生物多樣性保護(hù)與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州510006）

翼手目Chiroptera是哺乳動物中第二大類群，也是唯一真正適應(yīng)飛翔的哺乳動物（Wilson &Reeder，2005），目前記錄有 18科 202屬 1 401種（Wilson & Mittermeier，2019），我國有 8科 36屬140種，其中菊頭蝠科Rhinolophidae菊頭蝠屬Rhinolophus19種（魏輔文等，2021）。該類群一般棲息于熱帶、亞熱帶和溫帶地區(qū)，為洞穴型常見種類，以昆蟲為食，是生態(tài)系統(tǒng)中重要的成員之一（吳毅等，1997；Csorbaet al.，2003；張成菊，吳毅，2006）。

馬鐵菊頭蝠R. ferrumequinum于1774年由Schreber命名，分布遍及非洲北部、歐洲南部和亞洲南部（Csorbaet al.，2003；Wilson & Mittermeier，2019）。根據(jù)形態(tài)和分子遺傳學(xué)的差異劃分為不同亞種，如指名亞種R. f. ferrumequinum、日本亞種R. f. nippon和尼泊爾亞種R. f. tragatus等（Corbet，1978；Oscar，1995；Benda & Vallo，2012）。在中國，一般認(rèn)為分布有2個亞種：尼泊爾亞種，分布于云南和貴州；日本亞種，分布于吉林、遼寧、河北和北京等地（王應(yīng)祥，2003）。本研究組在西藏自治區(qū)錯那縣與墨脫縣開展翼手目物種多樣性調(diào)查時，使用蝙蝠豎琴網(wǎng)采集到4只菊頭蝠，經(jīng)形態(tài)學(xué)和分子系統(tǒng)學(xué)分析，鑒定為馬鐵菊頭蝠。

1 研究材料與方法

1.1 標(biāo)本采集

2019年7月5日在西藏自治區(qū)錯那縣（91°47′52″E，27°53′42″N，海拔3 108 m）使用蝙蝠豎琴網(wǎng)采集到 3只菊頭蝠（1♂：GZHU 19422，2♀：GZHU 19423和GZHU 19424）；2021年7月27日在西藏自治區(qū)墨脫縣（95°19′8.8″E，29°18′49.8″N，海拔1 263 m）采集到1只菊頭蝠（1♀：GZHU 21206）。以上標(biāo)本均保存于廣州大學(xué)華南生物多樣性保護(hù)與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

1.2 形態(tài)測量

按照哺乳動物測量標(biāo)準(zhǔn)（楊奇森等，2007），使用數(shù)顯游標(biāo)卡尺（MNT-150，上海美耐特實(shí)業(yè)有限公司；精度0.01 mm）對外形和頭骨進(jìn)行測量，電子數(shù)字天平（i2000，永康市艾瑞貿(mào)易有限公司；精度0.1 g）稱量體質(zhì)量。外形測量指標(biāo)包括：體質(zhì)量（body mass，MASS）、頭體長（head and body length，HB）、前臂長（forearm length，F(xiàn)A）、脛骨長（tibia length，TIB）、尾長（tail length，TL）、耳長（ear length，E）和后足長（hindfoot length，HF）。頭骨測量指標(biāo)包括：顱全長（greatest length of skull，GTL）、顱基長（condylobasal length，CBL）、枕犬長（condylo-canine length，CCL）、腭長（palatal length，PL）、腦顱寬（breadth of braincase，BB）、后頭寬（mastoid width，MW）、顴寬（zygomatic width，ZW）、眶間距（interorbital width，IOW）、上齒列長（maxillary tooth length，C1-M3L）、上犬齒寬（upper canine width，C1-C1W）、上臼齒寬（maxillary third molar width，M3-M3W）、下齒列長（mandibular toothrow length，C1-M3L）、下頜長（mandibular length，ML）、下頜高（mandibular height，MH）。

1.3 DNA提取與擴(kuò)增

取約20 mg肝臟或肌肉組織，使用DNA試劑盒（AG通用型基因組AG21009，艾科瑞生物）提取樣品總DNA。在PRIMER 3（Koressaaret al.，2018）中設(shè)計(jì)引物cyt b-F：5’-CCGCCCCATCAAGTATCTCT-3’和cyt b-R：5’-GCGATGCTTGCAAGTGGTAT-3’擴(kuò)增cyt b基因；PCR反應(yīng)總體系為 30 μL：Premix TaqTM15 μL，引物各0.5 μL，DNA模板1 μL，ddH2O 13 μL；PCR 反應(yīng)程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 45 s，54 ℃30 s，72 ℃ 1 min，48個循環(huán)；72 ℃ 10 min，4 ℃保存。應(yīng)用引物（Bakeret al.，2000）Rag2-F1：5’-GGCYG GCCCAARAGATCCTG-3’；Rag2-R1：5’-AACYTG YTTATTGTCTCCTGGTATGC-3’擴(kuò)增Rag2基 因，PCR反應(yīng)總體系為 25 μL：Premix TaqTM12.5 μL，引物各1 μL，DNA模板1 μL，ddH2O 9.5 μL；PCR 反應(yīng)程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，62.5 ℃ 30 s，72 ℃1.5 min，35個循環(huán)；72 ℃ 10 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物送至上海生工生物工程公司進(jìn)行測序。

1.4 系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析

采用 GENEIOUS 9.1.8（Drummondet al.，2016）對測序結(jié)果進(jìn)行人工拼接與校對。從NCBI-nt數(shù)據(jù)庫中下載已有菊頭蝠屬物種的cyt b和Rag2基因部分序列用于后續(xù)分析，將大蹄蝠Hipposideros armiger和中蹄蝠H. larvatus基因序列設(shè)置為外群（表1），使用MUSCLE（Edgar，2004）對序列矩陣進(jìn)行排序比對。應(yīng)用MrModelTest 2.4（Nylander，2004）明確最佳核苷酸替換模型為GTR+I+G（cyt b）和 HKY+G（Rag2）。 MrBayes 3.2（Ronquistet al.，2012）分別構(gòu)建貝葉斯樹，設(shè)置總抽樣代數(shù)為2 000萬代，抽樣頻率為1 000，丟棄前25%數(shù)據(jù)。

表1 用于菊頭蝠屬系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建的cyt b基因序列號Table 1 Sequences of cyt b gene used in phylogenetic analysis of genus Rhinolophus

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)學(xué)特征

本研究的標(biāo)本體型較大，體質(zhì)量17.4～21.8 g，頭體長 56.45～66.61 mm，前臂長 60.13～63.04 mm（表2）。體毛細(xì)密柔軟，背毛棕褐色，腹毛淺棕色。耳殼大且寬闊，尖端稍尖窄，具有對耳屏。正面及側(cè)面觀察頭部前端具發(fā)達(dá)的鼻葉（圖1：A，B），頂葉近三角形；中間突出部分為鞍狀葉和聯(lián)接葉，鞍狀葉兩側(cè)向中部微凹，呈提琴狀，鞍狀葉和聯(lián)接葉幾乎等高，“T”型連接處有一小凹陷；馬蹄葉寬圓。頭骨狹長（圖1：C～E），顱全長25.36～26.11 mm，矢狀嵴發(fā)達(dá)，人字嵴明顯，鼻隆近圓形，眶間距狹窄，顴弓發(fā)達(dá)，顴寬12.75～13.26 mm。齒式為1.1.2.3/2.1.2.3=30，上頜門齒較小，幾乎不見（圖1：C），上下犬齒（C）發(fā)達(dá)，上頜第一前臼齒（P2）極小（圖1：G）位于上犬齒和第二上前臼齒（P4）連接處外側(cè)或缺失（圖1：H）；下門齒的齒冠都具有3個尖端（圖1：F），第一下前臼齒（P2）小于第二下前臼齒（P4），下臼齒齒冠“W”型，且后側(cè)“V”型齒尖略低于前側(cè)。

圖1 西藏地區(qū)馬鐵菊頭蝠外部形態(tài)和頭骨特征Fig. 1 External and craniodental characteristics of Rhinolophus ferrumequinum from Tibet， China

表2 馬鐵菊頭蝠的外形及頭骨特征比較Table 2 Comparison of external and craniodental measurements of Rhinolophus ferrumequinum

2.2 系統(tǒng)發(fā)育分析

基于982 bp線粒體基因cyt b和683 bp核基因Rag2部分序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹顯示：本研究序列分別與從NCBI-nt數(shù)據(jù)庫中下載的馬鐵菊頭蝠序列聚為高支持度的一支，后驗(yàn)概率分別為0.99（圖2：A）和0.97（圖2：B），且基于cyt b基因的貝葉斯樹顯示，本研究標(biāo)本與歐洲地區(qū)（保加利亞、西班牙、斯洛伐克）馬鐵菊頭蝠指名亞種具有一定差異。另外，本研究標(biāo)本與印度尼西亞和中國地區(qū)（貴州、江西、云南）的中菊頭蝠R. affinis位于不同分支。

3 討論

在形態(tài)上，馬鐵菊頭蝠與中菊頭蝠鼻葉結(jié)構(gòu)相似，但在體型及遺傳上存在差異，中菊頭蝠體型比較?。厚R鐵菊頭蝠前臂長一般大于56 mm，中菊頭蝠則小于56 mm（劉延德等，2006；Smith，解焱，2009；劉少英等，2020）。本研究標(biāo)本的前臂長均大于56 mm（表2）；系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果顯示，該批標(biāo)本與中菊頭蝠處于不同分支，且與馬鐵菊頭蝠聚為一支（圖2）。因此，外部形態(tài)和分子結(jié)果均提示為馬鐵菊頭蝠。

圖2 基于cyt b （A）和Rag2 （B）基因構(gòu)建的菊頭蝠屬Rhinolophus貝葉斯樹Fig. 2 Bayesian trees of genus Rhinolophus based on cyt b （A） and Rag2 （B）genes

在外形和頭骨特征上，本研究標(biāo)本的頭體長、脛骨長和上齒列長均與四川和貴州標(biāo)本基本吻合，前臂長、尾長、顱全長、顴寬、眶間距稍大于四川和貴州標(biāo)本，而耳長、腦顱寬小于四川和貴州標(biāo)本（表2）。本研究標(biāo)本前臂長（67.70 mm vs.貴州56.32 mm）和顱全長（25.85 mm vs.四川23.67 mm）等與四川和貴州的標(biāo)本存在一定差異，但該差異是否源于遺傳差異或標(biāo)本量不足仍有待核實(shí)。同時，本研究中的部分標(biāo)本（GZHU 19422和GZHU 19424）上頜第一前臼齒缺失，與Csorba等（2003）報(bào)道的一致。

基于cyt b基因構(gòu)建的貝葉斯樹顯示，本研究序列與NCBI-nt數(shù)據(jù)庫中的馬鐵菊頭蝠序列聚為一支的支持度較高，后驗(yàn)概率為0.99，然而亞洲地區(qū)（中國吉林、河南、云南和日本、韓國）的馬鐵菊頭蝠單系性存疑（支持度較低，后驗(yàn)概率為0.76）。由于該系統(tǒng)發(fā)生樹為單基因樹，因此有待進(jìn)一步增加分子標(biāo)記來探討該拓?fù)潢P(guān)系和開展更為細(xì)致的親緣地理學(xué)分析。

馬鐵菊頭蝠主要分布于歐洲南部、非洲北部、大多數(shù)地中海地區(qū)和東南亞地區(qū)，在中國分布有日本亞種和尼泊爾亞種（王應(yīng)祥，2003），由于樣本量和數(shù)據(jù)的局限性，本研究難以明確西藏標(biāo)本的亞種歸屬。值得注意的是，Wilson和Mittermeier（2019）將馬鐵菊頭蝠日本亞種提升為種，即日本馬鐵菊頭蝠R. nippon，其內(nèi)設(shè)置2個亞種，即指名亞種和尼泊爾亞種。由于該分類設(shè)置仍有待基因組學(xué)及其他證據(jù)的核實(shí)，故本研究采用魏輔文等（2021）的分類設(shè)置，但不排除后續(xù)學(xué)名變動的可能。

馬鐵菊頭蝠為廣布種，迄今為止，在中國記錄于云南、貴州、吉林、遼寧、河北、北京、河南、山東、山西、江蘇、上海、浙江、安徽、福建、湖南、廣西、四川、湖北、陜西、甘肅、寧夏、江西、重慶（王應(yīng)祥，2003；Smith & 解焱，2009；蔣志剛等，2015）。本次馬鐵菊頭蝠在西藏自治區(qū)的發(fā)現(xiàn)為該區(qū)域翼手目分布新記錄，豐富了西藏地區(qū)哺乳動物物種多樣性，為西藏野生動物管理部門提供了基礎(chǔ)生物學(xué)數(shù)據(jù)。