狗頭赤芍質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提升研究

蔡遠(yuǎn)東 薛朝金 李天佑 何 羽

貴州省畢節(jié)市市場監(jiān)督管理局檢驗(yàn)檢測中心，貴州 畢節(jié) 551700

狗頭赤芍為毛茛科植物美麗芍藥PaeoniamaireiLévl.、草芍藥PaeoniaobovataMaxim.的干燥根。春、秋二季采挖，除去根莖、須根及雜質(zhì)，干燥。其功能為活血化瘀，涼血調(diào)經(jīng)。用于瘀滯胸脅疼痛、腹痛、目赤、痛經(jīng)、經(jīng)閉、衄血、跌撲損傷[1]。美麗芍藥主要分布于貴州畢節(jié)、威寧等地，草芍藥主要分布在貴州麻江、錦屏、威寧、赫章、水城、遵義等地[2-3]。根據(jù)相關(guān)報(bào)道[4]，狗頭赤芍主要化學(xué)成分為芍藥苷、 羥基芍藥苷、苯甲酰芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷(白芍苷)、 芍藥新苷、 芍藥苷元酮等。芍藥苷具有保肝、保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞、保護(hù)缺血性的腦損傷及神經(jīng)損傷的作用，還具有抗抑郁作用、抑制炎癥作用[5]。沒食子酸具有抗炎、抗氧化、抗菌、抗病毒等活性[6]。狗頭赤芍收載于《貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》(2003年版)，標(biāo)準(zhǔn)只對(duì)其粉末進(jìn)行了顯微鑒別，不能全面反映藥材整體質(zhì)量。本文采用HPLC法同時(shí)測定狗頭赤芍中沒食子酸和芍藥苷的含量，為質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提升提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Waters e2695 高效液相色譜儀，2998二極管陣列檢測器。電子天平：MSE3.6P-OCE-DM，由賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司生產(chǎn)；電子天平：AY120、BX420H由梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司生產(chǎn)。潔康超聲波清洗機(jī)(超聲功率：360 W，超聲頻率：40 KHz)由東莞市潔康超聲波設(shè)備有限公司生產(chǎn)。

1.2 試藥 沒食子酸對(duì)照品(批號(hào)：110831-201602，含量以90.8%計(jì))、芍藥苷對(duì)照品(批號(hào)：110736-202044，含量以96.8%計(jì))均由中國食品藥品檢定研究院提供。乙腈為色譜純(美國TEDIA天地試劑公司)，實(shí)驗(yàn)用水為娃哈哈純凈水，稀乙醇：取乙醇(95%，天津市富宇精細(xì)化工有限公司)529 mL，加娃哈哈純凈水稀釋至 1000 mL,即得稀乙醇。

1.3 樣品信息 采集的樣品經(jīng)貴州省中藥研究所陳德媛老師鑒定，為毛茛科植物草芍藥PaeoniaobovataMaxim。樣品詳見表1。

表1 樣品信息表

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：COSMOSIL- Packed- Column 5C18-MS-II 4.6ID×250 mm；流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸溶液，梯度洗脫；流速為1 mL/min；檢測波長為230 nm；柱溫為30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。梯度洗脫程序見表2，色譜圖如圖1，各成分分離度皆大于1.5。

表2 梯度洗脫表

1.沒食子酸；2.芍藥苷；A.試劑空白；B.對(duì)照品溶液；C.供試品溶液

2.2 混合對(duì)照品溶液的制備 精密稱取對(duì)照品沒食子酸、芍藥苷適量，加稀乙醇制成每1 mL含沒食子酸、芍藥苷分別為0.042 mg、0.052 mg的混合對(duì)照品溶液，即得。

2.3 供試品溶液的制備 取本品適量，粉碎，研細(xì)，取約0.5 g，精密稱定，分別置具塞錐形瓶中，精密加入稀乙醇50 mL，稱定重量，超聲處理(功率：360 W，頻率：40 KHz)30 min，放冷，再稱定重量，用稀乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得[7]。

2.4 線性關(guān)系考察 精密量取“2.2”項(xiàng)下的混合對(duì)照品溶液1 mL、2 mL、4 mL、6 mL、8 mL，分別置10 mL容量瓶中，加稀乙醇稀釋至刻度。分別精密吸取10 μL，按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件測定，每個(gè)樣品進(jìn)樣2次。以對(duì)照品濃度(X)為橫坐標(biāo)，峰面積積分值(Y)為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。得到?jīng)]食子酸和芍藥苷線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)，結(jié)果見表3。

表3 沒食子酸和芍藥苷線性范圍及回歸方程 (n=5)

2.5 精密度試驗(yàn) 取“2.2”項(xiàng)下的混合對(duì)照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件重復(fù)測定5次，分別計(jì)算2種成分的峰面積積分值。結(jié)果沒食子酸、芍藥苷峰面積的RSD值分別為0.5%、0.6%，表明儀器精密度良好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取畢節(jié)市赫章縣鐵匠鄉(xiāng)采集的狗頭赤芍藥材，粉碎，研細(xì)，取粉末5份，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，每份平行測定2次，按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件測定并計(jì)算各成分的含量。結(jié)果顯示狗頭赤芍中沒食子酸、芍藥苷的平均值分別為0.31%，2.28%；RSD值分別為1.33%、1.84%。表明方法重復(fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取畢節(jié)市赫章縣鐵匠鄉(xiāng)采集的狗頭赤芍藥材，粉碎，研細(xì)，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別在0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h、48 h進(jìn)樣，按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件測定并計(jì)算各組分峰面積的RSD值，結(jié)果沒食子酸、芍藥苷峰面積的RSD值分別為0.50%、1.60%。說明供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 加樣回收試驗(yàn) 取畢節(jié)市赫章縣鐵匠鄉(xiāng)采集的狗頭赤芍藥材，粉碎，研細(xì)，稱取粉末6份，每份約0.25 g，加入沒食子酸、芍藥苷濃度分別為0.7258 mg/mL、5.4015 mg/mL的混合對(duì)照品溶液1 mL，按“2.3”項(xiàng)下制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下測定并計(jì)算回收率。回收率平均值分別為99.58%、99.84%，RSD分別為1.17%、0.45%。結(jié)果見表4。

表4 狗頭赤芍中兩種成分的回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.9 樣品含量的測定 取不同產(chǎn)地的狗頭赤芍樣品適量，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，每份平行測定2次，按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件測定并計(jì)算各成分的含量。測定結(jié)果見表5。

表5 不同產(chǎn)地狗頭赤芍中沒食子酸和芍藥苷的含量 (%)

結(jié)果按干燥品計(jì)算，樣品中沒食子酸的含量為0.30%～0.47%，平均值為0.4%；芍藥苷的含量為2.28%～3.24%，平均值為2.7%。從含量測定的結(jié)果看出，芍藥苷的含量均高于《中國藥典》(2020版)“赤芍”的含量限度1.8%，本品可以作為赤芍的替代品使用。沒食子酸含量較高的樣品，芍藥苷含量也相對(duì)較高，如產(chǎn)于畢節(jié)市赫章縣和威寧縣的樣品，含量的高低是否與地域和植物的生長周期有關(guān)，還待進(jìn)一步的研究。

3 討論

本研究分別采用甲醇-0.05 moL/L磷酸二氫鉀溶液和乙腈-0.1%磷酸溶液為流動(dòng)相，梯度洗脫，結(jié)果用甲醇-0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液時(shí)，芍藥苷色譜峰拖尾較嚴(yán)重，選用乙腈-0.1%磷酸溶液時(shí)，目標(biāo)峰峰形較好，且與相鄰雜質(zhì)峰達(dá)到完全分離，取得了滿意的效果。

采用稀乙醇為溶劑，分別考察了超聲處理15 min、30 min和45 min，結(jié)果超聲處理15 min時(shí)，樣品含量較低，超聲處理30 min和45 min時(shí)樣品含量相差不大，說明超聲處理15 min時(shí)，目標(biāo)成分未提取完全，超聲處理30 min和45 min時(shí)目標(biāo)物提取較完全，為保證充分提取完全和縮短實(shí)驗(yàn)室操作時(shí)間，本次研究選擇超聲處理30 min。分別取稀乙醇、甲醇和50%甲醇作為溶劑，超聲處理30 min，結(jié)果發(fā)現(xiàn)稀乙醇提取時(shí)目標(biāo)物含量較高，故本研究采用稀乙醇為提取溶劑。

本實(shí)驗(yàn)采用HPLC法分別同時(shí)測定了5個(gè)不同產(chǎn)地的狗頭赤芍中的沒食子酸和芍藥苷的含量，取得了較為滿意的結(jié)果。該方法較為簡便，重復(fù)性較好，可用于狗頭赤芍的含量測定及質(zhì)量評(píng)價(jià)，為狗頭赤芍質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提升提供方法依據(jù)。