尼古丁促進(jìn)高糖高脂誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡的機(jī)制研究*

趙靜，郭蕊，孟芝君，劉彩紅，謝耀麗，劉晶，曹濟(jì)民，王亞靜

（1.山西醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，山西 太原 030000；2.山西醫(yī)科大學(xué)附屬人民醫(yī)院 檢驗(yàn)科，山西 太原 030012；3.山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院 內(nèi)分泌科，山西 太原 030001）

糖尿病心肌?。╠iabetic cardiomyopathy,DCM）是糖尿病患者的一種特殊心臟表現(xiàn)，其特征是早期的左心室肥大和舒張功能障礙，晚期出現(xiàn)明顯的心力衰竭和收縮功能降低[1]。吸煙是心血管疾病和2 型糖尿病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[2-3]。尼古丁是香煙煙霧的主要成分，是最具藥理活性的成分之一[4]。有研究已證明長期暴露于高水平尼古丁是誘發(fā)和促發(fā)包括心肌病和周圍血管疾病在內(nèi)的心血管疾病的致病因素[5]。目前尼古丁促進(jìn)DCM 的機(jī)制還有待探究。有研究顯示，細(xì)胞色素酶P4501A1（Cyp1a1）和神經(jīng)元乙酰膽堿受體β4 亞基（Chrnb4）的表達(dá)與突變與吸煙密切相關(guān)[6-7]，但這2 個(gè)基因是否促進(jìn)DCM進(jìn)展，目前尚未報(bào)道。本研究擬制備高糖/高脂細(xì)胞模型（糖尿病模型）進(jìn)行細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，旨在探討尼古丁對(duì)DCM 的影響及Cyp1a1 和Chrnb4 在其中的作用機(jī)制，為吸煙人群中DCM 患者的治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 主要材料和儀器

H9C2 細(xì)胞（BNCC353655，商城北納創(chuàng)聯(lián)生物科技有限公司），DMEM 完全高糖培養(yǎng)基（KGM12800S，江蘇凱基生物技術(shù)有限公司），胰蛋白酶消化液（T1300，北京索萊寶科技有限公司），1×磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline,PBS）（0.01 moL，pH 7.4）（KGB5001，江蘇凱基生物技術(shù)有限公司），葡萄糖（G116307，上海阿拉丁生化科技股份有限公司），棕櫚酸酯（HY-N2341，美國MCE 公司），尼古?。?4-11-5，成都德思特生物技術(shù)有限公司），AMPK 抑制劑（P5499-5MG，美國Sigma-Aldrich 公司），DCFHDA（HY-D0940，美國MedChemExpress 公司），Cyp1a1和Chrnb4 干擾質(zhì)粒（上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)公司），凋亡試劑盒（AP105-100kit，杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司），Reactive Oxygen Species Assay Kit（KGT010-1100 assays，江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司），JC-1 線粒體膜電位檢測試劑盒（BB-4105，上海貝博生物科技有限公司），丙二醛（Malondialdehyde,MDA）試劑盒（MM-0385R1，武漢酶免生物科技有限公司），超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）試劑盒（MM-0386R1，武漢酶免生物科技有限公司），ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix（Q711-02，南京諾唯贊生物科技股份有限公司），超純RNA 提取試劑盒（CW0581M）、Trizon Reagent（CW0580S，江蘇康為世紀(jì)生物科技股份有限公司），HiScript Ⅱ Q RT SuperMix（R223-01）、SYBR qPCR Master Mix（Q711-02，南京諾唯贊生物科技股份有限公司），50×TAE 緩沖液（T1060，北京索萊寶科技有限公司），6×DNA Loading Buffer（GH101-01，北京全式金生物技術(shù)股份有限公司），50 bp DNA Ladder[MD108，天根生化科技（北京）有限公 司]，Gsafe Red plus 核酸染料（GK20002，美 國GLPBIO 公司），瓊脂糖粉（75510-019，美國Invitrogen公司），RIPA 細(xì)胞裂解液（C1053，北京普利萊基因技術(shù)有限公司），BCA 蛋白定量試劑盒（CW0014S，江蘇康為世紀(jì)生物科技股份有限公司），GAPDH（TA-09，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，1/2 000），Anti Cyp1a1（DF3565，1/500）、Anti Chrnb4（DF9698，1/500）、Anti p-AMPK（AF3423，1/500）、Anti Casepase-2（DF2908，1/500）、Anti Casepase-3（AF6311，1/500）、Anti Casepase-9（AF6348，美國Affinity 公司，1/500），免疫球蛋白G（H+L）（ZB-2301，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，1/2 000），流式細(xì)胞分析儀[NovoCyte 2060R，艾森生物（杭州）有限公司]，PCR 儀[CFX Connect?，伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司]，蛋白電泳儀（DYY-6C，北京市六一儀器廠），化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)[Chemi DocTM XRS+，伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司]。

1.2 細(xì)胞分組

根據(jù)不同的方法，將細(xì)胞分為對(duì)照組、尼古丁組、高糖/高脂模型組、尼古丁+高糖高脂模型組。對(duì)照組正常培養(yǎng)，不做處理；尼古丁組在對(duì)照組基礎(chǔ)上添加6 μmoL/L 尼古丁處理26 h；高糖/高脂模型組在對(duì)照組基礎(chǔ)上添加33.3 mmoL/L 葡萄糖和500 μmoL/L 棕櫚酸酯共同處理24 h；尼古丁+高糖高脂模型組在對(duì)照組基礎(chǔ)上添加6 μmoL/L 尼古丁處理2 h 后，用33.3 mmoL/L 葡萄糖和500 μmoL/L 棕櫚酸酯共同處理24 h[8]。

用Cyp1a1基因驗(yàn)證細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分組，將細(xì)胞分為shRNA-NC 組、shRNA-Cyp1a1 組、AMPK 抑制劑組、shRNA-Cyp1a1+AMPK 抑制劑組。shRNA-NC 組采用H9C2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染shRNA-NC 質(zhì)粒48 h；shRNA-Cyp1a1組采用H9C2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染shRNA-Cyp1a1 質(zhì)粒48 h；AMPK 抑制劑組采用AMPK 抑制劑Dorsomorphin-2HCl 處理H9C2 細(xì)胞24 h；shRNA-Cyp1a1+AMPK 抑制劑組采用H9C2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染shRNA-Cyp1a1 質(zhì)粒48 h后，添加AMPK 抑制劑Dorsomorphin-2HCl 處理細(xì)胞24 h。

用Chrnb4基因驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)分組，將細(xì)胞分為shRNA-NC 組、shRNA-Chrnb4 組、AMPK 抑制劑組、shRNA-Chrnb4+AMPK 抑制劑組。shRNA-NC 組采用H9C2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染shRNA-NC 質(zhì)粒48 h；shRNA-Chrnb4組采用H9C2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染shRNA-Chrnb4 質(zhì)粒48 h；AMPK 抑制劑組采用AMPK 抑制劑Dorsomorphin-2HCl 處理H9C2 細(xì) 胞24 h；shRNA-Chrnb4+AMPK 抑制劑組采用H9C2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染shRNA-Chrnb4 質(zhì)粒48 h后，添加AMPK 抑制劑Dorsomorphin-2HCl 處理細(xì)胞24 h。

1.3 方法

1.3.1 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞活性氧（ROS）水平 按照1 ∶1 000 用無血清培養(yǎng)基稀釋DCFH-DA，使其終濃度為10 μmol/L；收集細(xì)胞，加入稀釋好的DCFH-DA，37℃培養(yǎng)箱中孵育20 min；無血清的培養(yǎng)液洗滌，去除多余的DCFH-DA；PBS 洗滌，以1 500 r/min 離心5 min，棄上清液；300 μL PBS 重懸細(xì)胞，上機(jī)，檢測細(xì)胞ROS 水平。

1.3.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞線粒體膜電位 根據(jù)JC-1 線粒體膜電位檢測試劑盒說明書，配置JC-1 工作液；收集細(xì)胞，加入500 μL JC-1 工作液懸浮細(xì)胞，培養(yǎng)箱孵育15～20 min；以2 000 r/min 離心5 min，收集細(xì)胞，1×Incubation Buffer 洗滌2 次；500 μL 1×Incubation Buffer 懸浮細(xì)胞，上機(jī)。

1.3.3 ELISA 法檢測細(xì)胞內(nèi)SOD 活性和微量MDA含量 根據(jù)試劑盒說明書配置好相關(guān)工作液，設(shè)置空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔和樣品孔。標(biāo)準(zhǔn)孔依次加入0.0 u/mL、12.5 u/mL、25.0 u/mL、50.0 u/mL、100.0 u/mL 和200.0 u/mL 濃度的50 μL 標(biāo)準(zhǔn)品，樣品孔中加入50 μL 樣品混勻，加入100 μL 酶標(biāo)試劑。封板膜封板，37℃孵育60 min；揭封板膜，洗滌液洗滌，棄去液體，拍干；先后加入顯色劑A、B 各50 μL，混勻，37℃，避光顯色15 min；加入50 μL 終止液；450 nm波長測定各孔吸光度值。

1.3.4 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測Cyp1a1、Chrnb4 mRNA 相對(duì)表達(dá)量 提取各組待測細(xì)胞內(nèi)RNA，隨后根據(jù)對(duì)應(yīng)的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA，加入反應(yīng)體系，在PCR 儀上檢測。根據(jù)2-ΔΔCt法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。引物由通用生物系統(tǒng)（安徽）有限公司合成。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.3.5 Western blotting 檢測蛋白表達(dá)水平 將各組細(xì)胞加入裂解液，充分研磨，以12 000 r/min 離心15 min，收集勻漿。取上清液，根據(jù)BCA 試劑盒說明書測定蛋白濃度。配置好濃縮膠和分離膠，加入已變性的蛋白樣品，電泳，轉(zhuǎn)膜。加入一抗，4℃過夜；加入二抗，室溫孵育1～2 h。滴加ECL曝光液曝光。用Image J 軟件分析各條帶灰度值。

1.3.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 收集待測細(xì)胞，PBS 洗滌2 次，以1 500 r/min 離心3 min；加入預(yù)冷的1×Binding Buffer 300 μL，重懸細(xì)胞；分別向每管細(xì)胞中加入3 μL Annexin V-APC 和5 μL 7-AAD，混勻；室溫避光孵育10 min；加入預(yù)冷的1×Binding Buffer 200 μL，混勻，上機(jī)檢測。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，比較用方差分析，進(jìn)一步兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)。P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組SOD、MDA、ROS、線粒體膜電位比較

對(duì)照組、尼古丁組、高糖/高脂模型組與尼古丁+高糖/高脂模型組SOD 水平比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），尼古丁組、高糖/高脂模型組、尼古丁+高糖/高脂模型組較對(duì)照組降低（P<0.05），尼古丁+高糖/高脂模型組較高糖/高脂模型組降低（P<0.05）。各組MDA 水平比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），尼古丁+高糖/高脂模型組較對(duì)照組和高糖/高脂模型組升高（P<0.05）。各組ROS 含量比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），高糖/高脂模型組、尼古丁+高糖/高脂模型組較對(duì)照組升高（P<0.05），尼古丁+高糖/高脂模型組較高糖/高脂模型組升高（P<0.05）。各組線粒體膜電位的比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），尼古丁組、高糖/高脂模型組、尼古丁+高糖/高脂模型組較對(duì)照組降低（P<0.05），尼古丁+高糖/高脂模型組較高糖/高脂模型組降低（P<0.05）。見表1 和圖1、2。

表1 各組SOD、MDA、ROS、線粒體膜電位水平比較（）

表1 各組SOD、MDA、ROS、線粒體膜電位水平比較（）

圖1 各組ROS含量比較圖

圖2 各組H9C2細(xì)胞流式細(xì)胞圖

2.2 尼古丁對(duì)高糖/高脂H9C2 細(xì)胞內(nèi)Cyp1a1、Chrnb4 mRNA、蛋白及p-AMPK、Caspase-2凋亡途徑相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響

對(duì)照組、尼古丁組、高糖/高脂模型組與尼古丁+高糖/高脂模型組Cyp1a1 和Chrnb4 mRNA 表達(dá)比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），尼古丁組、高糖/高脂模型組、尼古丁+高糖/高脂模型組較對(duì)照組升高（P<0.05），尼古丁+高糖/高脂模型組較高糖/高脂模型組升高（P<0.05）。各組Caspase-2、Caspase-3、Caspase-9、p-AMPK、Cyp1a1、Chrnb4 蛋白相對(duì)表達(dá)量比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），尼古丁組和尼古丁+高糖/高脂模型組Caspase-2、Caspase-3、Caspase-9、Cyp1a1、Chrnb4 蛋白相對(duì)表達(dá)量較對(duì)照組升高（P<0.05），p-AMPK 蛋白相對(duì)表達(dá)量較對(duì)照組降低（P<0.05），高糖/高脂模型組p-AMPK 蛋白相對(duì)表達(dá)量較對(duì)照組降低（P<0.05），Caspase-9、Cyp1a1、Chrnb4 蛋白相對(duì)表達(dá)量較對(duì)照組升高（P<0.05），尼古丁+高糖/高脂模型組Caspase-2、Caspase-3、Caspase-9、Cyp1a1、Chrnb4 蛋白相對(duì)表達(dá)量較高糖/高脂模型組升高（P<0.05），p-AMPK 蛋白相對(duì)表達(dá)量較高糖/高脂模型組降低（P<0.05）。見表2、3 和圖3。

圖3 各組蛋白相對(duì)表達(dá)量

表2 各組Cyp1a1、Chrnb4 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較（）

表2 各組Cyp1a1、Chrnb4 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較（）

2.3 各組H9C2 細(xì)胞凋亡率和Caspase-2、Caspase-3、Caspase-9、p-AMPK、Cyp1a1 蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

shRNA-NC 組、shRNA-Cyp1a1 組、AMPK 抑制劑組與shRNA-Cyp1a1+AMPK 抑制劑組H9C2 細(xì)胞凋亡率分別為（15.90±1.77）%、（2.38±0.74）%、（35.90±4.16）%、（27.97±2.30）%，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=97.790，P=0.000），shRNA-Cyp1a1 組較shRNA-NC 組降低（P<0.05），AMPK 抑制劑組和shRNA-Cyp1a1+AMPK 抑制劑組較shRNA-NC 組升高（P<0.05），shRNA-Cyp1a1+AMPK 抑制劑組較AMPK抑制劑組降低（P<0.05）。各組Caspase-2、Caspase-3、Caspase-9、p-AMPK 和Cyp1a1 蛋白相對(duì)表達(dá)量比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），shRNA-Cyp1a1 組Caspase-2、Caspase-3、Caspase-9、Cyp1a1 蛋白水平較shRNA-NC 組降低（P<0.05），p-AMPK 蛋白水平較shRNA-NC 組升高（P<0.05），AMPK 抑制劑組Caspase-2、Caspase-3、Caspase-9、Cyp1a1 蛋白水平較shRNA-Cyp1a1+AMPK 抑制劑組升高（P<0.05），p-AMPK 蛋白水平較shRNA-Cyp1a1+AMPK 抑制劑組降低（P<0.05），shRNA-Cyp1a1+AMPK 抑制劑組Cyp1a1 蛋白水平與shRNA-Cyp1a1 組比較無差異（P>0.05）。見表4 和圖4、5。

圖4 各組H9C2細(xì)胞流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果

表3 各組Caspase-2、Caspase-3、Caspase-9、p-AMPK、Cyp1a1、Chrnb4蛋白相對(duì)表達(dá)量比較（）

表3 各組Caspase-2、Caspase-3、Caspase-9、p-AMPK、Cyp1a1、Chrnb4蛋白相對(duì)表達(dá)量比較（）

表4 各組Caspase-2、Caspase-3、Caspase-9、p-AMPK、Cyp1a1蛋白相對(duì)表達(dá)量比較（）

表4 各組Caspase-2、Caspase-3、Caspase-9、p-AMPK、Cyp1a1蛋白相對(duì)表達(dá)量比較（）

2.4 Chrnb4 對(duì)心肌細(xì)胞凋亡及Caspase-2 凋亡途徑的影響

shRNA-NC 組、shRNA-Chrnb4 組、AMPK 抑 制劑組和shRNA-Chrnb4+AMPK 抑制劑組心肌細(xì)胞凋亡率分別為（15.01±2.46）%、（1.89±0.58）%、（37.12±2.85）%、（28.24±3.13）%，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=117.200，P=0.000），shRNA-Chrnb4 組 較 shRNA-NC 組降低（P<0.05），AMPK 抑制劑組和shRNA-Chrnb4+AMPK抑制劑組較對(duì)照組增加（P<0.05），shRNAChrnb4+AMPK 抑制劑組較AMPK 抑制劑組降低（P<0.05）。各組Caspase-2、Caspase-3、Caspase-9、p-AMPK 和Chrnb4 蛋白相對(duì)表達(dá)量比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），shRNAChrnb4 組Caspase-2、Caspase-3、Caspase-9、Chrnb4蛋白相對(duì)表達(dá)量較shRNA-NC 組降低（P<0.05），p-AMPK 蛋白相對(duì)表達(dá)量較shRNA-NC 組升高（P<0.05），AMPK 抑制劑組和shRNA-Chrnb4+AMPK 抑制劑組Caspase-2、Caspase-3、Caspase-9 相對(duì)表達(dá)量較shRNA-NC 組升高，p-AMPK 蛋白相對(duì)表達(dá)量較shRNA-NC 組降低（P<0.05），shRNAChrnb4+AMPK 抑制劑組Chrnb4 蛋白較shRNA-NC組降低，shRNA-Chrnb4+AMPK 抑制劑組Caspase-2、Caspase-3、Caspase-9、Chrnb4 蛋白相對(duì)表達(dá)量較AMPK 抑制劑組降低（P<0.05），p-AMPK 蛋白相對(duì)表達(dá)量較AMPK 抑制劑組升高（P<0.05）。shRNAChrnb4+AMPK 抑制劑組Chrnb4 蛋白相對(duì)表達(dá)量與shRNA-Chrnb4 組比較無差異（P>0.05）。見表5 和圖6、7。

圖5 各組蛋白相對(duì)表達(dá)量

表5 各組Caspase-2、Caspase-3、Caspase-9、p-AMPK、Chrnb4蛋白相對(duì)表達(dá)量比較（）

表5 各組Caspase-2、Caspase-3、Caspase-9、p-AMPK、Chrnb4蛋白相對(duì)表達(dá)量比較（）

圖6 各組H9C2細(xì)胞流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果

圖7 各組蛋白相對(duì)表達(dá)量

3 討論

心肌細(xì)胞凋亡是DCM 發(fā)展機(jī)制之一。有研究表明，低凋亡水平心肌細(xì)胞可導(dǎo)致致命的擴(kuò)張型心肌病，抑制心肌細(xì)胞凋亡可阻礙該疾病的進(jìn)展[9]。因此抑制心肌細(xì)胞凋亡可能是預(yù)防DCM 的新療法。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，尼古丁誘導(dǎo)且加重高糖高脂心肌細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能是通過上調(diào)Cyp1a1、Chrnb4 表達(dá)，抑制AMPK 活性，導(dǎo)致線粒體功能障礙，氧化應(yīng)激增加，進(jìn)一步激活Caspase-2 凋亡途徑。

ROS 是在心臟生理和病理中具有重要作用的信號(hào)分子[10]。在生理?xiàng)l件下，心臟ROS 信號(hào)調(diào)節(jié)心臟發(fā)育和心肌細(xì)胞成熟、心臟鈣處理、興奮收縮耦合和血管張力；然而，導(dǎo)致ROS 水平升高時(shí)產(chǎn)生不受調(diào)節(jié)的病理狀況可通過對(duì)DNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)的氧化損傷以及線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔的激活、線粒體功能障礙等導(dǎo)致氧化應(yīng)激[11]。氧化應(yīng)激與各種細(xì)胞類型的凋亡信號(hào)有關(guān)，包括心肌細(xì)胞[12-13]。本研究中發(fā)現(xiàn)尼古丁及高糖/高脂均會(huì)導(dǎo)致心肌細(xì)胞線粒體功能障礙，氧化應(yīng)激增加，而尼古丁會(huì)放大高糖/高脂培養(yǎng)條件下的心肌細(xì)胞的線粒體功能障礙和氧化應(yīng)激效應(yīng)，與ZHANG 等[14]和RAMALINGAM等[15]的研究結(jié)果一致。

AMPK 是一種主要的細(xì)胞能量傳感器和代謝穩(wěn)態(tài)的主調(diào)節(jié)器，在調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞凋亡中發(fā)揮著重要作用[16]。AMPK 與尼古丁的一些作用直接相關(guān)[17]。有研究證明敲除Cyp1a1 可抑制細(xì)胞增殖，阻斷與Cyclin D1 減少相關(guān)的Go-G 細(xì)胞周期，并增加與AMPK 和Akt 磷酸化減少相關(guān)的凋亡[18]，與本研究結(jié)果一致。這些結(jié)果表明Cyp1a1 參與細(xì)胞增殖和存活途徑，其機(jī)制可能與AMPK 通路有關(guān)。編碼nAChRβ4 亞基的Chrnb4基因廣泛存在于氣道上皮細(xì)胞，并形成異質(zhì)nAchR 來調(diào)節(jié)尼古丁受體的親和力。有研究證明激動(dòng)劑1,1-二甲基-4-苯基哌嗪碘化選擇性靶向α3β4 nAChr，通過增加棕色脂肪、心臟和骨骼肌中的葡萄糖攝取，顯著改善了糖耐量[19]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Chrnb4 表達(dá)與AMPK 活性呈負(fù)相關(guān)，即干擾Chrnb4 后AMPK 活性上調(diào)。故筆者推測，尼古丁上調(diào)Cyp1a1、Chrnb4 表達(dá)，抑制AMPK 活性，進(jìn)而導(dǎo)致線粒體功能障礙，氧化應(yīng)激增加，最終導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡。

本研究結(jié)果進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，H9C2 細(xì)胞內(nèi)Caspase-2、Caspase-3、Caspase-9 蛋白水平顯著增加，干擾Cyp1a1 或Chrnb4 后，H9C2 細(xì)胞內(nèi)Caspase-2、Caspase-3、Caspase-9 蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著下調(diào)。越來越多的證據(jù)表明，具有半胱氨酸酶招募結(jié)構(gòu)域的凋亡抑制因子是一種內(nèi)源性蛋白，在心臟組織中高度表達(dá)，能夠通過靶向多點(diǎn)激活來抑制缺血-再灌注誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡[20]。SINHA-HIKIM 等[21]的研究結(jié)果顯示，Caspase-2 介導(dǎo)的內(nèi)在通路信號(hào)是尼古丁加高脂肪飲食誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡的機(jī)制之一。

綜上所述，尼古丁誘導(dǎo)高糖、高脂心肌細(xì)胞凋亡率增加，其機(jī)制可能是上調(diào)Cyp1a1、Chrnb4 表達(dá)，抑制AMPK 活性，導(dǎo)致線粒體功能障礙，氧化應(yīng)激增加，并進(jìn)一步激活Caspase-2 凋亡途徑，上調(diào)Caspase-3、Caspase-9 表達(dá)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。