甲基化芯片技術(shù)檢測糞便DNA甲基化在海南地區(qū)少數(shù)民族人群大腸癌篩查中的應(yīng)用*

劉倩，王振奮，黃平

（海南省人民醫(yī)院 1.胃腸外二科 2.肛腸外科，海南 ?？?570311）

大腸癌包括直腸癌、結(jié)腸癌，早期無特異性癥狀，>60%大腸癌確診時已處于中晚期[1]。因此，早篩查、早診斷是抑制大腸癌病情進(jìn)展、減少不良預(yù)后的關(guān)鍵。目前，臨床針對大腸癌的早期診斷技術(shù)包括腸鏡檢查、大便隱血試驗、基因突變檢測等，雖可一定程度上提升大腸癌的早期檢出率，但仍存在一定不足，如腸鏡檢查屬于侵入性操作、大便隱血試驗特異性低、基因突變的位點(diǎn)不固定等[2-4]。DNA甲基化是表觀遺傳學(xué)中常見的調(diào)節(jié)基因表達(dá)方式，在胚胎發(fā)育、遺傳印記與維持正常細(xì)胞功能等方面發(fā)揮關(guān)鍵作用[5]。SIDRANSKY 等[6]于1992 年在結(jié)直腸癌患者糞便中檢測到突變的KRAS基因，首次證實糞便DNA 甲基化檢測方法的可行性。隨后不斷有研究報道，糞便中基因異常甲基化可有效檢出大腸癌，但理想生物標(biāo)記物的確定尚存在一定爭議[7]。國內(nèi)有研究發(fā)現(xiàn)，少數(shù)民族比漢族更易患大息肉（直徑>9 mm）且更易癌變，少數(shù)民族結(jié)直腸癌的惡性程度比漢族更高、預(yù)后更差，發(fā)病年齡比漢族早[8]。海南省位于中國最南端，是1 個由漢族、黎族、苗族、回族等37 個民族組成的省份，少數(shù)民族人口約164.42 萬，占全省總?cè)丝诘?8.11%（居全國前10位）。少數(shù)民族生活方式、生活環(huán)境與風(fēng)俗習(xí)慣與其他地區(qū)存在很大差異，但目前關(guān)于海南地區(qū)少數(shù)民族大腸癌的篩查與流行病學(xué)數(shù)據(jù)稀缺。本研究通過VAV3、IKZF1、RIMS1基因分析甲基化芯片技術(shù)檢測糞便DNA 甲基化在海南地區(qū)少數(shù)民族人群大腸癌篩查中的應(yīng)用價值，旨在為大腸癌的無創(chuàng)篩查提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2020 年6 月—2022 年6 月海南省人民醫(yī)院就診的大腸癌高危少數(shù)民族人群102 例。其中男性56例，女性46例；年齡43～77歲，平均（59.63±5.82）歲；體質(zhì)量指數(shù)19.62～29.59 kg/m2，平均（23.57±2.75）kg/m2；黎族39 例，苗族30 例，回族25 例，其他8 例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①海南地區(qū)少數(shù)民族人群；②年齡30～80 歲；③符合《中國早期結(jié)直腸癌及癌前病變篩查與診治共識》[9]得大腸癌高危人群標(biāo)準(zhǔn)；④大便潛血陽性或大腸癌危險因素調(diào)查問卷陽性；⑤收集糞便前1 周內(nèi)腸道未接受灌腸、結(jié)腸鏡檢查等侵入性操作；⑥未接受任何抗腫瘤治療；⑦自愿簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①因直腸畸形、肛門畸形或高度狹窄而致結(jié)腸鏡無法插入；②伴有嚴(yán)重下消化道梗阻、切口疝、腹部疝氣或可疑結(jié)腸穿孔；③肝功能急性衰竭或慢性衰竭；④腸鏡檢查禁忌證；⑤精神障礙、認(rèn)知障礙等。另選取同期本院招募30 例健康志愿者作為對照組，腸鏡下所見結(jié)直腸黏膜無明顯病變。對照組中男性17 例，女性13 例；年齡41～80 歲，平均（60.02±4.96）歲；體質(zhì)量指數(shù)18.86～28.42 kg/m2，平均（22.68±2.43）kg/m2；黎族12 例，苗族8 例，回族7 例，其他3 例。兩組一般資料比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），可對比。

1.2 方法

1.2.1 糞便標(biāo)本采集、保存 首先給予受試者大便潛血定量檢測專用采便管及“長安心”特定試劑盒（廣州市康立明生物科技有限責(zé)任公司），研究人員嚴(yán)格按照產(chǎn)品說明書對受試者進(jìn)行培訓(xùn)。每個受檢者按要求取5～10 g 糞便并置于“長安心”糞便保護(hù)液中常溫保存，標(biāo)本隨機(jī)編號，并進(jìn)行腸鏡檢查，糞便標(biāo)本采集、腸鏡檢查及組織病理檢查，操作標(biāo)準(zhǔn)按照《中國消化內(nèi)鏡活組織檢查與病理學(xué)檢查規(guī)范專家共識（草案）》[10]進(jìn)行。

1.2.2 甲基化芯片技術(shù)檢測糞便DNA甲基化 ①甲基化芯片設(shè)計。通過查閱以往文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)VAV3、SDC2、ITGA4、RIMS1、NDRG4、WIF-1、HPP1、IKZF1、TFPI2等基因啟動子甲基化在檢測大腸癌中均表現(xiàn)出較高的陽性率[11-14]，并篩選出VAV3、RIMS1、IKZF1基因，針對其高甲基化位點(diǎn)設(shè)計探針，制作甲基化芯片。②檢驗芯片工作狀態(tài)。根據(jù)亞硫酸氫鹽修飾試劑盒（廣州市康立明生物科技有限責(zé)任公司）說明書進(jìn)行甲基化修飾，修飾時間為3.5 h 左右，修飾后測序驗證芯片檢測甲基化的敏感性，評估芯片工作狀態(tài)。③提取DNA。取200 mg 左右糞便，按照糞便DNA 提取試劑盒（廣州市康立明生物科技有限責(zé)任公司）說明書提取DNA，用Nano-300 微量分光光度計（廣州市康立明生物科技有限責(zé)任公司）測定DNA 濃度。將DNA 保存在AE 緩沖液（200 μL）中，并置于-20℃冰箱中保存待測。④重亞硫酸氫鹽鈉轉(zhuǎn)化DNA。⑤熒光標(biāo)記、Linker-PCR 擴(kuò)增靶基因。⑥擴(kuò)增靶序列與芯片雜交。⑦檢測雜交結(jié)果，評估甲基化狀態(tài)。

1.2.3 腸鏡檢查 糞便DNA 甲基化篩查后2 周內(nèi)接受腸鏡檢查，由經(jīng)驗豐富的腸胃科醫(yī)師按照《中國消化內(nèi)鏡活組織檢查與病理學(xué)檢查規(guī)范專家共識（草案）》[10]執(zhí)行腸鏡檢查，要求腸鏡進(jìn)入深度達(dá)回盲部，并觀察大腸癌/腺瘤/增生性息肉、腺瘤與病灶的大小、位置等。對所有可見病變進(jìn)行活檢，留取標(biāo)本送至病理科制作切片，進(jìn)一步明確診斷。

1.3 觀察指標(biāo)

①糞便DNA 中VAV3、RIMS1、IKZF1基因甲基化狀態(tài)；②糞便DNA 中VAV3、RIMS1、IKZF1基因單獨(dú)及聯(lián)合檢測甲基化率，評估大腸癌、腺瘤的診斷效能。計算公式：敏感性=a/（a+c）、特異性=d/（b+d）、準(zhǔn)確率=（a+d）/a+c+b+d、陽性預(yù)測值=a/（a+b）、陰性預(yù)測值=d/（c+d）。見表1。

表1 診斷效能評估

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件。計數(shù)資料以率（%）表示，比較用χ2檢驗，P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腸鏡病理結(jié)果

腸鏡病理結(jié)果顯示，102 例患者中大腸癌52 例，腺瘤28 例，增生性息肉22 例，并分別作為大腸癌組、腺瘤組和增生性息肉組。

2.2 各組糞便DNA 中VAV3、IKZF1、RIMS1 基因單獨(dú)及聯(lián)合檢測甲基化率比較

各組糞便DNA 中VAV3、IKZF1、RIMS1基因單獨(dú)及聯(lián)合檢測甲基化率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），大腸癌組高于腺瘤組、增生性息肉組、對照組。腺瘤組與增生性息肉組VAV3、IKZF1、RIMS1基因單獨(dú)及聯(lián)合檢測甲基化率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見表2。

表2 各組糞便DNA中VAV3、IKZF1、RIMS1基因單獨(dú)及聯(lián)合檢測甲基化率比較 例（%）

2.3 糞便DNA 中VAV3、IKZF1、RIMS1 基因單獨(dú)及聯(lián)合檢測大腸癌的診斷效能

將腸鏡病理結(jié)果作為金標(biāo)準(zhǔn)，糞便DNA 中VAV3、IKZF1、RIMS1基因聯(lián)合檢測大腸癌的特異性、敏感性、陰性預(yù)測值、陽性預(yù)測值、準(zhǔn)確率最高，分別為 100.00%、92.31%、92.59%、100.00% 和96.08%。見表3、4。

表3 糞便DNA中VAV3、IKZF1、RIMS1基因甲基化單獨(dú)及聯(lián)合檢測與腸鏡病理結(jié)果對比 例

表4 糞便DNA中VAV3、IKZF1、RIMS1基因單獨(dú)及聯(lián)合檢測大腸癌的診斷效能

2.4 糞便DNA 中VAV3、IKZF1、RIMS1 基因單獨(dú)或聯(lián)合檢測腺瘤的診斷效能

將腸鏡病理結(jié)果作為金標(biāo)準(zhǔn)，糞便DNA中VAV3、IKZF1、RIMS1基因聯(lián)合檢測腺瘤的特異性、敏感性、陰性預(yù)測值、陽性預(yù)測值、準(zhǔn)確率最高，分別為97.30%、71.43%、90.00%、90.91%和90.20%。見表5、6。

表5 糞便DNA中VAV3、IKZF1、RIMS1基因單獨(dú)及聯(lián)合檢測甲基化與腸鏡病理結(jié)果對比 例

表6 糞便DNA中VAV3、IKZF1、RIMS1基因單獨(dú)及聯(lián)合檢測腺瘤的診斷效能 %

3 討論

由于糞便樣本的抑制性成分多且成分復(fù)雜，甲基化基因片段含量低，甲基化特異性PCR、甲基化測序等傳統(tǒng)基因甲基化檢測方式可能難以準(zhǔn)確定量、定性檢測糞便中的甲基化基因[15-17]。DNA 甲基化芯片技術(shù)是一種基于二代測序技術(shù)的定量定性檢測技術(shù)，利用雙色熒光分別標(biāo)記擴(kuò)增產(chǎn)物，再在基因芯片上雜交，最后通過熒光密度比值的高低篩選出差異甲基化基因[18-19]。該技術(shù)具有微型性、自動性、高通量性等特點(diǎn)，且可實現(xiàn)對整體甲基化水平的精細(xì)研究。KUHMANN 等[20]利用DNA 甲基化芯片技術(shù)測定大腸癌患者231 個DNA 修復(fù)基因，結(jié)果顯示，不同人種間大腸癌患者的DNA 甲基化轉(zhuǎn)移酶3A 基因及連接酶4 基因、基質(zhì)金屬蛋白酶9 基因等均出現(xiàn)高甲基化，且連接酶4 基因啟動子區(qū)的高甲基化達(dá)60%的患者比例高達(dá)51%。朱慧萍等[21]研究報道，在大腸癌早期篩查中，甲基化芯片技術(shù)檢測糞便DNA 甲基化的檢出率高于大便隱血試驗、血清癌胚抗原檢測。進(jìn)一步證實，甲基化芯片技術(shù)可提高糞便DNA 甲基化的檢出率，其原因可能在于DNA 甲基化芯片技術(shù)通過酶切富集啟動子與CpG 島區(qū)域，并實施Bisulfite 測序，可提高檢測全基因組DNA 甲基化狀態(tài)的分辨率與測序數(shù)據(jù)的利用率，因此該技術(shù)的DNA 甲基化檢出率高于傳統(tǒng)的大便隱血試驗、甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)法。

通過查閱以往文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)VAV3、SDC2、ITGA4、RIMS1、NDRG4、WIF-1、HPP1、IKZF1、TFPI2等基因啟動子甲基化在檢測大腸癌中均表現(xiàn)出較高的陽性率[11-14]，并篩選出VAV3、RIMS1、IKZF1基因納入本研究。其中VAV3 蛋白具有多個功能域，可參與細(xì)胞轉(zhuǎn)化、細(xì)胞骨架組織與癌基因等調(diào)控過程中。ZHANG 等[22]研究發(fā)現(xiàn)，KCNJ12、VAV3-AS1、EVC 聯(lián)合診斷大腸癌分期的AUC、敏感性、特異性分別為0.87、83.0%和71.2%。IKZF1基因?qū)儆阡\指DNA 結(jié)合蛋白家族，其主要功能在于調(diào)節(jié)細(xì)胞分化。YOUNG 等[23]采用實時熒光聚合酶鏈反應(yīng)測定184 例大腸癌與616 例腺瘤患者血漿IKZF1、BCAT1甲基化表達(dá)，結(jié)果顯示，IKZF1聯(lián)合BCAT1甲基化診斷大腸癌、腺瘤的敏感性分別為71.2%和22.9%。楊葳等[24]研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌患者血液中IKZF1單基因甲基化陽性率為46.00%，與IRF4、SEPT9、BCAT1基因聯(lián)合可有效提升結(jié)直腸癌檢出率。RIMS1基因?qū)儆赗AS基因超家族成員之一，該基因突變可造成直腸癌、肺癌等惡性腫瘤細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移。夏晨靜[12]研究發(fā)現(xiàn)，IKZF1、RIMS1基因啟動子甲基化在結(jié)直腸癌中具有較高的特異性與陽性率，有助于發(fā)現(xiàn)癌前病變。本研究結(jié)果顯示，52 例大腸癌糞便中VAV3、IKZF1、RIMS1基因甲基化分別檢出41 例、42 例和41 例，甲基化率均超過75.00%。28 例腺瘤患者糞便中上述3 個基因啟動子DNA 甲基化率分別為32.14%、17.86%、46.43%，對照組中僅檢出1 例RIMS1基因甲基化，表明VAV3、IKZF1、RIMS1基因甲基化狀態(tài)改變與大腸癌發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，有望作為大腸癌檢測的新型篩查指標(biāo)。大腸癌的發(fā)生、發(fā)展屬于一種多階段、多步驟、多基因參與的過程，是由正常結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞通過表觀遺傳學(xué)、遺傳學(xué)的異常積累后形成[25-26]。因此，沒有一種基因在所有大腸癌癌變過程中是通用的，單個基因檢測存在敏感性低等缺點(diǎn)。諸多學(xué)者致力于研究糞便多基因聯(lián)合檢測，以尋找1 個檢測大腸癌性能理想、消耗低的生物標(biāo)記組合。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，VAV3、IKZF1、RIMS1基因聯(lián)合檢出大腸癌、腺瘤、增生性息肉的陽性率分別為92.31%、71.43%和45.45%，且診斷大腸癌、腺瘤的敏感性、準(zhǔn)確率均較高，但特異性未見明顯提高，提示聯(lián)合檢測可提升大腸癌篩查準(zhǔn)確率，但可能不是最優(yōu)的基因組合方式。因此后期需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，并篩選不同的基因組合，以保障特異性、敏感性均處于較高水平。

綜上所述，甲基化芯片技術(shù)提示海南地區(qū)少數(shù)民族人群大腸癌患者糞便中VAV3、IKZF1、RIMS1基因表現(xiàn)出較高的甲基化水平，且聯(lián)合檢測可提升大腸癌、腺瘤的診斷效能。相信隨著基因測序技術(shù)尤其是甲基化芯片技術(shù)的發(fā)展與成本降低，使得大規(guī)模測序與檢測成為可能。但本研究仍存在一定不足，如本研究屬于橫斷面研究，缺乏時效性驗證，結(jié)果可能存在一定偏倚；未對比海南地區(qū)少數(shù)民族人群與漢族人群的大腸癌篩查結(jié)果、病理特征；未分析其他基因甲基化的篩查結(jié)果等，故后期需將上述不足作為重點(diǎn)，進(jìn)一步展開研究。