新型冠狀病毒RBD蛋白原核表達及多克隆抗體的制備

彭曉燕 ， 陸盼盼 ， 胡祖權(quán)

貴州醫(yī)科大學生物與工程學院，貴州省免疫細胞與抗體工程研究中心，貴陽 550025

嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2， SARS-CoV-2）簡稱新型冠狀病毒，能夠引起嚴重的急性呼吸道疾病，具有極強的傳染性。該病毒在世界范圍內(nèi)流行并不斷出現(xiàn)新的變異毒株，給全球公共衛(wèi)生安全帶來嚴峻挑戰(zhàn)和威脅，免疫學診斷和治療是目前研究的重點領(lǐng)域［1-2］。

新型冠狀病毒由囊膜和核衣殼組成，囊膜上主要有表面刺突蛋白（spike protein， S）、膜蛋白（membrane protein， M）和包膜蛋白（envelope protein， E）等3種結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)［3］，其中S蛋白與其傳染能力及致病機制密切相關(guān)。在病毒進入宿主細胞的過程中，S蛋白會被宿主細胞的蛋白酶切割為S1亞基和S2亞基，分別負責受體識別和膜融合［4］。S1亞基又分為N末端結(jié)構(gòu)域（N terminal domain， NTD）和C末端結(jié)構(gòu)域（C-terminal domain， CTD），蛋白晶體結(jié)構(gòu)顯示新型冠狀病毒的CTD為 受 體 結(jié) 合 域（receptor binding domain，RBD），主要負責識別細胞表面特異性受體——血管緊張素轉(zhuǎn)化酶Ⅱ（angiotensin converting enzymeⅡ， ACE2），從而介導病毒與宿主細胞的相互作用［4-6］。因此，阻斷RBD與ACE2的結(jié)合能夠阻止新型冠狀病毒進入細胞內(nèi)，以RBD為靶標的特異性抗體或小分子抑制劑是抗新型冠狀病毒藥物研發(fā)的有效策略之一［3，7］。同時，免疫學診斷具有操作簡單、特異性高、重復性好和高效低廉等優(yōu)點，現(xiàn)已成為臨床上最普遍的檢測手段之一［8-10］，優(yōu)化基于抗RBD抗體的免疫診斷方法對于新型冠狀病毒的快速初篩和日常監(jiān)測具有重要意義。

本研究通過基因克隆操作構(gòu)建原核表達系統(tǒng)，在大腸桿菌中大量表達含有不同標簽蛋白的RBD重組蛋白，并驗證其可溶性和免疫原性，以期為通過抗體庫技術(shù)分離抗RBD重組抗體及進一步發(fā)展新型冠狀病毒的免疫診療方法奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

大腸桿菌XL1-Blue、pGEX-6P-1和pET-32a（+）載體由華中農(nóng)業(yè)大學分子生物技術(shù)實驗室饋贈，含RBD基因的pET-32-RBD質(zhì)粒由中國科學院生物化學與細胞生物學研究所蘇州研究院饋贈。6～8周齡Balb/c小鼠由貴州醫(yī)科大學實驗動物中心（許可證號：SCXK（黔）2018-0001）提供，室溫20～25 ℃，光照黑暗周期為12 h，分籠標準飼養(yǎng)，自由采食飼料和水。

1.2 儀器與試劑

酶標儀購自BioTech公司；冷凍高速離心機購自丹麥LaboGene公司；超聲波破碎儀購自寧波新芝生物科技有限公司；恒溫搖床購自蘇州捷美電子有限公司；垂直電泳儀和凝膠成像分析系統(tǒng)購自美國Bio-Rad公司；轉(zhuǎn)印儀、水平和垂直電泳儀購自北京六一生物科技有限公司；PCR儀購自美國ABI公司；純水儀購自英國ELGA公司；Syngene成像系統(tǒng)購自基因有限公司；Tryptone和Yeast extract購自英國OXOID公司；脫脂奶粉購自武漢博士德生物工程有限公司；對硝基苯磷酸二鈉購自上海Sigma-Aldrich公司；質(zhì)粒DNA提取試劑盒購自Omega公司；親和層析柱和Ni-NTA基質(zhì)購自德國Qiagen公司；GST純化基質(zhì)購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；工具酶購自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司；AP標記和HRP標記羊抗鼠抗體購自上海默克公司；ECL發(fā)光液購自大連博格林生物科技有限公司；引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.3 原核表達載體構(gòu)建

培養(yǎng)含pET-32-RBD質(zhì)粒的重組大腸桿菌，用質(zhì)粒DNA提取試劑盒提取質(zhì)粒DNA，通過PCR擴增目的基因，采用EcoR Ⅰ和NotⅠ雙酶切RBD片段、pDEX-6P-1載體和pET-32a（+）載體，制備1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。隨后，利用T4 DNA連接酶連接目的基因和載體，構(gòu)建重組載體pGEX-RBD和pET-RBD。電轉(zhuǎn)化大腸桿菌XL1-Blue感受態(tài)細胞，涂布于LB固體培養(yǎng)基（含100 μg·mL-1氨芐）平板，37 ℃過夜培養(yǎng)12～16 h至長出單克隆菌落。挑取菌落培養(yǎng)，利用基因特異引物進行PCR鑒定，并送公司用載體特異引物測序驗證。

1.4 RBD蛋白的原核表達及純化

取測序正確的pGEX-RBD和pET-RBD重組質(zhì)粒菌液分別接種于含100 μg·mL-1氨芐的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃，200 r·min-1振蕩培養(yǎng)12～16 h。將培養(yǎng)菌液按1∶100接種于新鮮培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r·min-1振蕩培養(yǎng)至OD600達到0.4～0.6時，加入終濃度為1 mmol·L-1的IPTG，置16 ℃、200 r·min-1恒溫搖床誘導培養(yǎng)20 h，離心收集菌體。PBS懸浮菌體，超聲波破碎處理后收集上清液，利用GST純化柱純化GST-RBD融合蛋白，以及Ni-NTA基質(zhì)純化RBD-His融合蛋白，SDS-PAGE凝膠電泳檢測蛋白的表達情況。

1.5 多克隆抗體的制備

用GST-RBD融合蛋白作為免疫抗原，取3只6周齡Balb/c小鼠進行免疫，共進行4次免疫，每次免疫間隔時間為10 d，抗原劑量為每只小鼠25 μg。初次免疫用等量弗氏完全佐劑乳化，第2次和第3次免疫用等量弗氏不完全佐劑乳化，第4次免疫用等量生理鹽水混合。完成4次免疫后7 d取小鼠靜脈血制備抗血清。

1.6 間接ELISA法測定抗血清滴度

用PBS稀釋RBD-His融合蛋白至1 μg·mL-1，取100 μL加入96孔酶標板，并設置PBS空白對照，于37 ℃包被2 h，用200 μL PBS洗滌3次。加入150 μL封閉液，37 ℃水浴2 h，用200 μL PBS洗滌3次。將待測抗血清以100、200、400、800、1 600、3 200倍比梯度稀釋，每孔加入100 μL，于37℃孵育1 h后，用200 μL PBST和PBS分別洗滌3次。加入100 μL按1∶5 000稀釋的AP標記羊抗鼠二抗，37 ℃孵育1 h，用200 μL PBST和PBS分別洗滌3次。加入100 μL 0.2% pNPP顯色液，黑暗條件下反應30 min，用酶標儀測OD450讀值。

1.7 Western blot分析

取20 μL RBD-His融合蛋白，經(jīng)SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)印至PVDF膜。將膜裁剪后用封閉液（含5%脫脂奶粉的TBST溶液）封閉2 h，再分別用1∶2 000稀釋的抗血清于37 ℃孵育1.5 h。用TBST洗滌3次，加入1∶5 000稀釋的HRP標記羊抗鼠抗體，37 ℃孵育1 h。TBST和TBS分別洗滌5次后，加入ECL發(fā)光液，SynGene成像系統(tǒng)曝光顯色。

2 結(jié)果與分析

2.1 原核表達載體構(gòu)建

根據(jù)RBD基因序列設計特異引物，PCR擴增目的基因，凝膠電泳檢測結(jié)果（圖1）顯示，獲得的RBD基因片段大小約為700 bp，與預期大小相一致。利用EcoRⅠ和NotⅠ雙酶切目的基因以及載體pGEX-6P-1和pET-32a（+），通過酶連接獲得pGEX-RBD和pET-RBD重組載體。

圖1 PCR擴增RBD基因片段Fig. 1 PCR amplification of RBD gene fragment

2.2 陽性轉(zhuǎn)化子鑒定

重組載體通過電轉(zhuǎn)化至大腸桿菌XL1-Blue感受態(tài)細胞中，隨機挑取10個單克隆菌落培養(yǎng)后進行PCR鑒定，結(jié)果顯示均擴增出大小約為750 bp的基因片段（圖2），與預期大小相符。然后，利用載體特異性引物測序，比對結(jié)果顯示，目的基因與RBD基因（GenBank登錄號：BC032538.1）的序列相同，表明重組表達載體構(gòu)建成功。

圖2 PCR鑒定陽性轉(zhuǎn)化子Fig. 2 PCR identification of the positive transformants

2.3 重組蛋白原核表達及純化

重組菌株XL1-Blue/pGEX-RBD和XL1-Blue/pET-RBD的菌液經(jīng)IPTG誘導表達及超聲波破碎處理后，取上清液分別用GST和His基質(zhì)純化GST-RBD和RBD-His融合蛋白。SDS-PAGE結(jié)果（圖3）顯示，GST-RBD融合蛋白大小約為53 kD，RBD-His融合蛋白大小約為33 kD，與預期結(jié)果相符合，表明原核表達獲得了可溶性的GST-RBD和RBD-His融合蛋白。

圖3 SDS-PAGE檢測純化的融合蛋白Fig. 3 SDS-PAGE detection of the purified fusion proteins

2.4 多克隆抗體效價分析

用GST-RBD融合蛋白作為免疫抗原免疫3只Balb/c小鼠，用RBD-His融合蛋白作為檢測抗原分析多克隆抗體的效價。ELISA檢測結(jié)果（圖4）顯示，3只小鼠均產(chǎn)生了多克隆抗體，效價達到約1∶3 000，其中1號和3號小鼠產(chǎn)生了較高親和力的多克隆抗體。

圖4 ELISA檢測多克隆抗體的效價Fig. 4 ELISA detection of the titers of polyclonal antibodies

2.4 多克隆抗體特異性分析

將RBD-His融合蛋白進行SDS-PAGE凝膠電泳，再分別用不同免疫小鼠產(chǎn)生的多克隆抗體進行Western blot分析。結(jié)果（圖5）顯示，3只免疫小鼠產(chǎn)生的多克隆抗體均出現(xiàn)蛋白雜交條帶，而對照組無條帶出現(xiàn)，表明獲得的多克隆抗體可特異性識別RBD蛋白。

圖5 Western blot檢測多克隆抗體特異性Fig. 5 Western blot detection of the specificities of polyclonal antibodies

3 討論

新型冠狀病毒肺炎（corona virus disease 2019，COVID-19）疫情給全球公共衛(wèi)生安全和經(jīng)濟社會發(fā)展帶來了嚴重威脅。目前，在廣泛推行疫苗接種和核酸檢測基礎上，眾多科學家正在竭力研發(fā)更有效的防治手段和診療方法。目前的檢測方法主要包括核酸檢測、抗原檢測和抗體檢測［8-9］，前2種方法主要是針對病毒本身的檢測，在感染初期即可有效篩查，而抗體檢測則是檢測機體針對病毒免疫應答產(chǎn)生的IgM或IgG抗體。核酸檢測靈敏度高、特異性好，但對實驗室、設備和人員的要求較高，而且操作繁鎖；抗原檢測操作簡便、快捷，但靈敏度稍差，僅能作為核酸檢測的補充；抗體檢測可評價抗體藥物和疫苗的臨床效果，但不適用于感染初期的檢測，而且存在一定的誤判率［8-10］。因此，核酸檢測是確診的標準方法，但發(fā)展免疫學檢測方法仍具有良好的應用價值，其便捷高效性使其在大規(guī)模篩查時可作為快速初篩工具或家庭日常自測方法。

基于免疫學的新冠預防和治療是眾多科研團隊的另一個研究重點［11-13］。目前在全世界普及的新冠疫苗主要包括病毒滅活疫苗、腺病毒載體疫苗和重組蛋白疫苗，接種疫苗對于病毒的防治效果起到非常重要的作用［13-14］。國家衛(wèi)生健康委員會發(fā)布的《新型冠狀病毒肺炎診療方案（試行第九版）》將2種特異性抗新型冠狀病毒藥物增加到診療方案中，包括美國輝瑞公司生產(chǎn)的PF-07321332/利托那韋片（paxlovid）以及我國首個自主研發(fā)的單克隆抗體藥物（安巴韋單抗/羅米司韋單抗注射液）。安巴韋單抗的靶標是S蛋白的RBD結(jié)構(gòu)域，能夠促進S1亞基快速從新型冠狀病毒上脫落，阻止病毒進入細胞內(nèi)［15-17］。因此，RBD被認為是抗體中和治療和疫苗開發(fā)的理想靶標。

本研究以新型冠狀病毒S蛋白的RBD結(jié)構(gòu)域為實驗對象，分別構(gòu)建了含有GST和His標簽的重組蛋白表達載體，原核表達獲得大量可溶性的GST-RBD和RBD-His融合蛋白，并通過動物免疫和抗血清滴度檢測證實重組蛋白能夠誘導機體的免疫反應。眾所周知，原核表達系統(tǒng)是最常用的蛋白表達體系，具有生產(chǎn)周期短、操作簡單、成本低廉等特點。但是，在原核生物中表達真核基因時，由于缺乏糖基化、乙酰化等蛋白翻譯后修飾功能，使表達的蛋白不能正確折疊而形成包涵體，通過變性和復性獲得大量可溶性的具有生物活性功能的蛋白質(zhì)仍是當前研究的技術(shù)難點［18］?，F(xiàn)有研究表明基因自身的特性是決定蛋白表達情況的決定性因素，但通過優(yōu)化IPTG濃度、誘導表達的溫度和時間以及與標簽蛋白融合表達等策略可以顯著改善蛋白質(zhì)的表達水平和活性［19-22］。本實驗通過優(yōu)化表達條件，成功在大腸桿菌中獲得了大量的GST-RBD和RBD-His融合蛋白。由于GSTRBD融合蛋白的分子量較大，以該蛋白作為免疫原能夠刺激機體產(chǎn)生更強烈的免疫反應，以RBDHis蛋白作為檢測抗原可以鑒別是否產(chǎn)生了針對RBD的多克隆抗體，可以有效地避免GST標簽蛋白的干擾?？傊狙芯客ㄟ^原核表達體系獲得了RBD融合蛋白，并驗證其具有良好的免疫原性，為后續(xù)制備抗RBD的基因工程抗體以及研發(fā)以RBD為靶標的新冠診療方法提供了數(shù)據(jù)支撐。