藥用植物分子農(nóng)場(chǎng)研究進(jìn)展

孫卉 ， 張春義 ， 姜凌

中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，北京 100081

分子農(nóng)場(chǎng)這個(gè)概念最早于1986年提出，指以微生物和動(dòng)植物為載體，外源表達(dá)具有藥物功能的蛋白質(zhì)（例如疫苗、抗體、激素或細(xì)胞因子）和各類化合物（酚類、黃酮類、莨菪堿類）［1］。其中利用轉(zhuǎn)基因植物為載體的植物分子農(nóng)場(chǎng)產(chǎn)品具有廣泛的化學(xué)多樣性，可以應(yīng)用于食品、飼料、醫(yī)藥和生物材料等領(lǐng)域。以較低成本表達(dá)藥物用途的蛋白質(zhì)和生物功能化合物是當(dāng)前的熱點(diǎn)研究領(lǐng)域和新興科研前沿，在明確藥用成分分子積累機(jī)制的基礎(chǔ)上，綜合考慮目標(biāo)蛋白的性質(zhì)、目標(biāo)基因的表達(dá)和其他因素，選擇適合的底盤植物和表達(dá)系統(tǒng)，能夠較快獲得轉(zhuǎn)基因植物材料并進(jìn)行擴(kuò)繁；然后通過藥用成分的提取和純化，或者直接采收食用，可以獲得對(duì)人體健康有益的疫苗與抗體、藥用蛋白和藥用功能的其他化合物；最后通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和轉(zhuǎn)基因安全評(píng)價(jià)，將藥用的植物分子農(nóng)場(chǎng)產(chǎn)品應(yīng)用于市場(chǎng)（圖1）［2］。與基于細(xì)菌、真菌、昆蟲或哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的傳統(tǒng)系統(tǒng)相比，植物分子無法進(jìn)行哺乳動(dòng)物病毒的復(fù)制，不會(huì)讓人們感染人畜共患病或者動(dòng)物病毒，而且還能確保非天然蛋白質(zhì)的正確組裝、折疊和糖基化，具有更靈活的可擴(kuò)展性［3-4］。植物分子農(nóng)場(chǎng)的底盤植物選擇和遺傳改造方式選擇一直是研究者面臨的挑戰(zhàn)，同時(shí)如何提高植物制藥產(chǎn)量與品質(zhì)也是植物分子農(nóng)場(chǎng)體系構(gòu)建過程中面臨的關(guān)鍵科學(xué)問題之一。本文綜述了藥物植物分子農(nóng)場(chǎng)的構(gòu)建過程進(jìn)展，著重介紹分子設(shè)計(jì)和基因編輯等新興技術(shù)在植物分子農(nóng)場(chǎng)的應(yīng)用，提出了建立植物分子農(nóng)場(chǎng)的最新策略，以期為提高人為設(shè)計(jì)藥用植物分子農(nóng)場(chǎng)產(chǎn)出效率提供新的研究思路。

圖1 藥用植物分子農(nóng)場(chǎng)基本框架Fig. 1 Basic framework for pharmaceutical plant molecular farm

1 分子農(nóng)場(chǎng)中的底盤植物

植物是食品和藥品的天然制造農(nóng)場(chǎng)。植物分子農(nóng)場(chǎng)可以大規(guī)?？焖偾覘l件可控地生產(chǎn)藥物，因此成為應(yīng)對(duì)突發(fā)疫情危機(jī)的良好技術(shù)措施。選擇合適的底盤類型，僅需6～8周就可以應(yīng)用于治療藥物或疫苗的生產(chǎn)，而常規(guī)動(dòng)物疫苗制備需要6個(gè)月（表1）［1］。用于植物分子農(nóng)場(chǎng)的材料可以是整株植物，如煙草、大米和大豆，也可以是其他基于植物的系統(tǒng)，例如懸浮植物細(xì)胞或者特定的組織培養(yǎng)、水生植物、苔蘚、藻類，甚至是來自植物細(xì)胞的體外轉(zhuǎn)錄和翻譯系統(tǒng)［5］。

1.1 整株植物

使用整個(gè)植物作為植物分子農(nóng)場(chǎng)底盤材料時(shí)，通常是以葉片或者種子作為存儲(chǔ)組織。煙草、萵苣、苜蓿和大豆葉片由于其生物量大和高含量的可溶性蛋白質(zhì)，目前已被廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)高水平的重組蛋白質(zhì)（表1），例如埃博拉病毒抗體、艾滋病抗體和胰島素原等［6-9］。種子也是產(chǎn)生藥用蛋白質(zhì)的重要來源，特別是在發(fā)展中國(guó)家，可以增加窮人獲得關(guān)鍵藥物的機(jī)會(huì)，減少對(duì)發(fā)酵罐和冷鏈儲(chǔ)存和分銷的限制，進(jìn)一步降低了植物分子農(nóng)場(chǎng)的總體成本。目前玉米、大麥、水稻和小麥等谷物是積累高水平蛋白質(zhì)的重要糧食作物，其中玉米可用于生產(chǎn)艾滋病病毒抗體，大麥可用于生產(chǎn)細(xì)胞生長(zhǎng)因子，大豆可用于生產(chǎn)疫苗和凝血因子，水稻可用于生產(chǎn)溶菌酶和乳鐵蛋白等［10-15］。

表1 不同類型分子農(nóng)場(chǎng)的優(yōu)缺點(diǎn)Table 1 Advantages and disadvantages cons of different types of molecular farms

1.2 毛狀根與懸浮細(xì)胞系

毛狀根是一種不定根的腫瘤性增殖，由植物細(xì)胞與革蘭氏陰性土壤細(xì)菌發(fā)根農(nóng)桿菌自然轉(zhuǎn)化而成。發(fā)根來自農(nóng)桿菌根誘導(dǎo)質(zhì)粒的T-DNA片段穩(wěn)定插入宿主植物的核基因組。T-DNA序列兩個(gè)邊界之間的起始位點(diǎn)可以被具有藥用價(jià)值的異源基因所替代。成熟的毛狀根培養(yǎng)物具有在液體培養(yǎng)基和無菌條件下無限期繁殖的優(yōu)勢(shì)，并且不會(huì)在周圍環(huán)境中傳播外源基因［16］。目前藥用植物的毛狀根具有較高的生物合成能力，與傳統(tǒng)體外培養(yǎng)相比，在植物次級(jí)代謝產(chǎn)物上具有更高的遺傳和生化穩(wěn)定性［17］。例如在胡蘿卜中提高酚類、黃酮類和槲皮素含量［18］，金盞花中提高酚酸和黃酮類含量［19］，茄科賽莨菪中提高莨菪堿、山莨菪堿和東莨菪堿等化合物的含量［20］，板藍(lán)根中提高黃酮類含量［21］等。毛狀根還可以通過外源激發(fā)劑［22］、人工多倍體［23］和CRISPR/Cas9基因編輯［24］等方法大規(guī)模生產(chǎn)次級(jí)代謝產(chǎn)物。

懸浮細(xì)胞系比毛狀根更容易控制生產(chǎn)條件。目前在煙草懸浮細(xì)胞系BY2中可以便捷地添加穩(wěn)定劑來提高蛋白質(zhì)穩(wěn)定性，實(shí)現(xiàn)高產(chǎn)，例如在煙草BY-2細(xì)胞中生產(chǎn)的人血清白蛋白產(chǎn)量高達(dá)11.88 mg·mL-1［25］，生產(chǎn)青蒿素的產(chǎn)量高于120 mg·kg-1鮮重［26］。還可以通過基因編輯突變BY-2細(xì)胞用于生成“聚糖友好”的底盤植物，重組蛋白不含植物復(fù)合型聚糖［27］。煙草NT-1細(xì)胞（CONCERT系統(tǒng)）可以生產(chǎn)經(jīng)美國(guó)農(nóng)業(yè)部批準(zhǔn)作為獸醫(yī)疫苗的分子農(nóng)業(yè)產(chǎn)品——血凝素神經(jīng)氨酸酶糖蛋白［28］。煙草懸浮細(xì)胞ZMapp可以生產(chǎn)治療埃博拉出血熱的3種單克隆抗體組成的混合物［29］。另外，胡蘿卜懸浮細(xì)胞ElelysoTM已用于生產(chǎn)美國(guó)食品和藥物管理局批準(zhǔn)的第一種用于人類的分子農(nóng)業(yè)產(chǎn)品——葡萄糖腦苷脂酶，這種蛋白可用于治療一種家族性糖脂代謝疾病——戈謝?。?0］。

1.3 浮萍、苔蘚和微藻

浮萍是水生高等植物，具有生長(zhǎng)繁殖快、易于采收、蛋白質(zhì)含量高和可有效表達(dá)復(fù)雜蛋白質(zhì)的優(yōu)勢(shì)，目前已經(jīng)用于生產(chǎn)聚糖工程單克隆抗體、生物仿制藥和獸藥［4］。苔蘚，特別是小立碗蘚能夠在大型光生物反應(yīng)器環(huán)境中表達(dá)復(fù)雜的人類重組蛋白［31］。萊茵衣藻是研究最多的微藻物種之一，目前已有專用于克隆和表達(dá)重組DNA的分子工具包［32］，能夠表達(dá)抗癌癥的免疫毒素蛋白、針對(duì)單純皰疹病毒糖蛋白D的大型單鏈抗體和糖尿病相關(guān)的谷氨酸脫羧酶。以上幾類植物分子農(nóng)場(chǎng)還需要優(yōu)化適合最大化生長(zhǎng)規(guī)模、均勻氣體交換和光擴(kuò)散的光生物反應(yīng)器［5］。

2 藥用植物分子農(nóng)場(chǎng)的構(gòu)建策略

藥用的植物分子農(nóng)場(chǎng)主要是利用植物分子農(nóng)場(chǎng)生產(chǎn)藥物用途的化合物，例如疫苗與抗體、藥用蛋白和生物功能化合物。與微生物和動(dòng)物體系相比，植物只需要土壤、光和水等條件就可以生成藥用化合物，價(jià)格相對(duì)便宜，并且隨著密碼子優(yōu)化、細(xì)胞特異性啟動(dòng)子和N-聚糖的人源化以及遺傳改造方式的技術(shù)進(jìn)步，大大提高了植物的生產(chǎn)速率，例如瞬時(shí)轉(zhuǎn)染技術(shù)使得轉(zhuǎn)染植株短短數(shù)日內(nèi)就可以收獲，效率較高。因此，藥用植物分子農(nóng)場(chǎng)的快捷性使其特別適合個(gè)性化醫(yī)療［1］。值得注意的是，每類植物分子農(nóng)場(chǎng)根據(jù)其產(chǎn)物的不同，其構(gòu)建策略也各有側(cè)重。

2.1 疫苗與抗體

藥用的植物分子農(nóng)場(chǎng)主要通過過量表達(dá)系統(tǒng)（瞬時(shí)或穩(wěn)定表達(dá)均可）生產(chǎn)多種疫苗和抗體，例如非霍奇金淋巴瘤抗體、來自細(xì)菌和病毒的其他抗原決定簇，如炭疽、狂犬病、白喉、破傷風(fēng)、結(jié)核病、瘧疾等［33-34］。萵苣可以生產(chǎn)艾滋病免疫原性蛋白、鼠疫疫苗的免疫原性F1-V融合蛋白、霍亂毒素B亞單位等［35］。煙草懸浮細(xì)胞ZMapp生產(chǎn)的3種鼠源單克隆抗體混合藥物，可對(duì)埃博拉病毒外糖標(biāo)記的蛋白提供人工免疫應(yīng)答，目前此藥物已經(jīng)在西非病毒性疾病爆發(fā)期間進(jìn)行了嘗試，雖然只有7名患者參與，但其中5名患者最終康復(fù)［29，36］。擬南芥可以用于生產(chǎn)免疫原性蛋白［11］、葡萄糖苷酶［37］和傳染性法氏囊病病毒的免疫原性VP2蛋白［38］。水稻胚乳也可以生產(chǎn)預(yù)防腹瀉病的可食用疫苗、屋塵螨抗原、幽門螺桿菌抗原、日本腦炎病毒包膜蛋白、艾滋病毒和輪狀病毒的抗體等［39］。最新的藥用植物分子農(nóng)場(chǎng)在疫苗和抗體的應(yīng)用產(chǎn)品是新型冠狀病毒疫苗CoVLP，這是目前全球唯一的植物性新型冠狀病毒疫苗［40］。2021年啟動(dòng)了該疫苗在美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局和英國(guó)藥監(jiān)機(jī)構(gòu)的注冊(cè)申報(bào)程序，2022年2月24日，加拿大衛(wèi)生部批準(zhǔn)了這款疫苗，商品名COVIFENZ?，該疫苗也成為世界首個(gè)獲批的植物源新型冠狀病毒疫苗。加拿大已成為全球第一個(gè)授權(quán)使用基于植物的新型冠狀病毒疫苗的國(guó)家［39］。

2.2 藥用蛋白

1986年，在植物中生產(chǎn)的第一種藥用植物蛋白質(zhì)是通過在煙草和向日葵愈傷組織中表達(dá)的人類生長(zhǎng)激素［41］。1990年，在轉(zhuǎn)基因煙草和馬鈴薯中生產(chǎn)了另一種重組蛋白，即人血清白蛋白［42］。治療戈謝病葡萄糖腦苷脂酶已成為藥用植物分子農(nóng)場(chǎng)應(yīng)用的成功案例之一，該酶通過把蛋白質(zhì)導(dǎo)向液泡來防止末端甘露糖殘基的延伸，從而促進(jìn)人體巨噬細(xì)胞對(duì)酶的吸收［43］。用于治療1型糖尿病的重組人胰島素原也是在煙草和萵苣中生產(chǎn)的［7］。水稻種子也為植物制藥提供了巨大的應(yīng)用潛力，常作為口服給藥的生產(chǎn)系統(tǒng)［14］。更多的可食用植物（如番茄）正在越來越廣泛地應(yīng)用于口服治療性蛋白的生產(chǎn)，例如腫瘤壞死因子拮抗劑、人α-抗胰蛋白酶、纖維生長(zhǎng)因子、人溶菌酶、乳鐵蛋白、人生長(zhǎng)激素、人白細(xì)胞介素和人酸性α-葡萄糖苷酶等各種重組藥物蛋白［14］。上述藥用蛋白的生產(chǎn)主要在植物不同的組織器官中通過過量表達(dá)系統(tǒng)來實(shí)現(xiàn)。

2.3 藥用功能的其他化合物

藥用的植物分子農(nóng)場(chǎng)也能生產(chǎn)包括酚類、黃酮類、莨菪堿類等很多具有藥用功能的植物次生代謝物，相對(duì)于普通植物，藥用植物（整個(gè)植株、毛狀根或懸浮細(xì)胞）也是常用的底盤植物，可以用來提高植物中藥用次生代謝物含量。為了加速解析藥用植物次生代謝物積累的分子機(jī)制，生物學(xué)家一方面開發(fā)了DNA條形碼，可識(shí)別藥用植物的遺傳多樣性及其在屬和種水平上的準(zhǔn)確分類［44］；另一方面通過簡(jiǎn)化基因組測(cè)序和轉(zhuǎn)錄組分析，可以識(shí)別有價(jià)值的生物合成途徑中的關(guān)鍵基因和酶，以及快速準(zhǔn)確地進(jìn)行種群分類。目前全基因組關(guān)聯(lián)分析適用于檢測(cè)植物中數(shù)量性狀基因座，使其整個(gè)基因組覆蓋著高密度的單核苷酸多態(tài)性標(biāo)記［45］。在構(gòu)建生產(chǎn)藥用功能化合物的植物分子農(nóng)場(chǎng)時(shí)，需要在明確有效藥用成分分子積累機(jī)制的基礎(chǔ)上，綜合考慮目標(biāo)蛋白的性質(zhì)、目標(biāo)基因的表達(dá)和其他因素以優(yōu)化構(gòu)建策略，通過設(shè)計(jì)藥用植物次生代謝調(diào)控手段，提高有效成分合成積累和藥用價(jià)值，同時(shí)還要考慮制藥產(chǎn)量和品質(zhì)的平衡。首先，可以通過遺傳轉(zhuǎn)化將整條生產(chǎn)代謝物的代謝通路轉(zhuǎn)移到底盤植物中，使化合物在更容易富集的植物中聚集。例如將參與青蒿素生物合成途徑的多個(gè)基因轉(zhuǎn)化到煙草中，不僅顯著增加了煙草中青蒿素的產(chǎn)量，而且煙草本身產(chǎn)量可觀，從而能夠大幅度降低青蒿素的生產(chǎn)成本［26］。其次，可以根據(jù)目標(biāo)蛋白與化合物積累的關(guān)系，特異性阻斷目標(biāo)蛋白的功能，使底盤植物趨向藥用化合物的方向積累。此外，還可以引入TALENs、ZFNs和CRISPR-Cas9系統(tǒng)的靶向基因組編輯的方法，創(chuàng)造包含所需化合物和/或新生物產(chǎn)品的藥用植物［46］。例如丹參中迷迭香酸合酶基因的抑制導(dǎo)致3，4-二氫羥基苯乳酸的水平增加，迷迭香酸的質(zhì)量也有所提升［47］。通過CRISPR敲除二萜合酶基因?qū)е碌⑼拷档?，發(fā)現(xiàn)二萜合酶基因是丹參酮生物合成中的關(guān)鍵基因［48］。在長(zhǎng)春花中，香葉基（香葉基）二磷酸合酶和香葉醇合酶基因的過度表達(dá)導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因植物中長(zhǎng)春堿和長(zhǎng)春新堿的含量顯著增加［49］。盾葉薯蕷中法尼基焦磷酸合酶基因的靶向突變使其酶學(xué)活性降低，導(dǎo)致角鯊烯的含量比野生型植物低1.6倍［50］。在人參毛狀根中，通過基因編輯調(diào)控三萜類皂苷代謝工程以及木質(zhì)部合成（苯丙氨酸解氨酶）基因表達(dá)，抑制了稀有人參皂苷Rg3合成的側(cè)支途徑，能夠顯著提升Rg3含量，產(chǎn)量可達(dá)到83.6 mg·L-1［51］。為增加藥用植物生產(chǎn)化合物的能力，可以用串并聯(lián)的間歇浸沒生物反應(yīng)器培養(yǎng)系統(tǒng)來提高懸浮細(xì)胞、組織器官或者全株植物培養(yǎng)的通量［52］。再次，智能蛋白質(zhì)分子設(shè)計(jì)手段也能夠應(yīng)用于藥用植物分子農(nóng)場(chǎng)的設(shè)計(jì)策略上，例如通過分子對(duì)接技術(shù)發(fā)現(xiàn)提高牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸合酶活性的關(guān)鍵位點(diǎn)，再結(jié)合轉(zhuǎn)基因技術(shù)可顯著提升煙草中的胡蘿卜素含量［53］。第四，利用藥用植物分子農(nóng)場(chǎng)生產(chǎn)人工miRNA，例如將2種針對(duì)乙型肝炎病毒設(shè)計(jì)的人工miRNA，遺傳轉(zhuǎn)化生菜后飼喂給患病小鼠，能夠有效降低病毒的表達(dá)和肝損傷，且無不良反應(yīng)，這種表達(dá)人工miRNA的生菜未來可能成為保健營(yíng)養(yǎng)蔬菜，并有望成為未來人類防治乙肝病毒感染的有效方法［54］。最后，氨基酸形成的短肽也可以在植物分子農(nóng)場(chǎng)中大規(guī)模生產(chǎn)，利用糧食作物（如水稻）可以大幅增加藥物的產(chǎn)量。例如利用水稻胚乳生產(chǎn)糖蛋白激素人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子，可用于化療和骨髓移植后恢復(fù)淋巴細(xì)胞，治療失血性休克、水腫和燒傷［55］。水稻胚乳生產(chǎn)的嵌合型多重降壓肽，能夠顯著降低高血壓大鼠的血壓，且無明顯副作用［56］。

3 展望

綜上所述，利用藥用植物分子農(nóng)場(chǎng)生產(chǎn)藥物希望與挑戰(zhàn)并存。近年來，應(yīng)用植物分子農(nóng)場(chǎng)生產(chǎn)治療慢性病和傳染病的酶、生長(zhǎng)因子、抗體、疫苗和藥物［57］，其良好的安全性讓植物衍生藥物更受市場(chǎng)歡迎［58］。提高藥用植物分子農(nóng)場(chǎng)的效能還需要考慮以下幾點(diǎn)。首先，動(dòng)物和植物之間在高爾基體發(fā)生O-聚糖和N-聚糖修飾上存在差異，而且植物缺乏N-乙酰神經(jīng)氨酸，因此不能進(jìn)行真正的N-糖基化，這是阻礙植物單克隆抗體用于治療的原因之一［59］。已有研究發(fā)現(xiàn)植物糖基化抗體可能會(huì)導(dǎo)致受試者的免疫原性和過敏［60］，因此需要根據(jù)分子農(nóng)場(chǎng)的實(shí)際情況進(jìn)一步細(xì)化研發(fā)工作，綜合考慮如何減少與植物藥物相關(guān)的免疫原性和過敏性疾病，進(jìn)一步加強(qiáng)聚糖修飾工程研究，確保產(chǎn)生能夠進(jìn)行類似于人體細(xì)胞的真實(shí)糖基化的植物株系。其次，藥用植物富含次生代謝產(chǎn)物，一方面分子農(nóng)場(chǎng)可以生產(chǎn)大量的目標(biāo)產(chǎn)品，另一方面藥用植物的組織中可能存在少量有毒生物堿。根據(jù)其使用生產(chǎn)系統(tǒng)（全植物、植物組織或細(xì)胞懸浮液），對(duì)應(yīng)蛋白質(zhì)提取和純化需要收獲植物材料、除去雜質(zhì)。如何快速高效地獲得有效目標(biāo)產(chǎn)物是研發(fā)應(yīng)用生產(chǎn)的重點(diǎn)，因此需要考慮更優(yōu)化的提取/純化方法，最大程度減少異源蛋白質(zhì)的蛋白水解趨勢(shì)［58，61］。最后，構(gòu)建藥用的植物分子農(nóng)場(chǎng)還需要考慮產(chǎn)量與品質(zhì)的平衡。為了提高產(chǎn)量，需要選擇合適的底盤植物，或者使用間歇浸沒生物反應(yīng)器或者大面積種植糧食作物［26，52，55-56］。由于大田作物很容易受到生物因素（害蟲和疾?。┮约皻夂蚝吞鞖鈼l件等非生物因素的影響，用于藥物用途的作物生產(chǎn)需要良好的生產(chǎn)規(guī)范與轉(zhuǎn)基因植物監(jiān)管。藥用的植物分子農(nóng)場(chǎng)還可以考慮全自動(dòng)化的“立體農(nóng)業(yè)”，所有植物分層種植，每層都包含各自的照明和肥料供應(yīng)系統(tǒng)，與無土生長(zhǎng)基質(zhì)和水培或氣培灌溉系統(tǒng)結(jié)合使用，或者采用全封閉設(shè)計(jì)，使植物生長(zhǎng)與當(dāng)?shù)丨h(huán)境和氣候隔絕［62］。

當(dāng)前研究發(fā)現(xiàn)，讓人們獲得藥用的植物分子農(nóng)場(chǎng)產(chǎn)品最經(jīng)濟(jì)的方法是將重組蛋白靶向植物的可食用部分，直接在飲食體系中傳遞，然后進(jìn)行濃縮和/或工業(yè)包裝，不需要任何純化步驟。此外，還需要克服蛋白質(zhì)生產(chǎn)水平低和水解率高等因素，以及與轉(zhuǎn)基因可能擴(kuò)散到非靶標(biāo)生物體有關(guān)的生物安全和公眾可接受性問題。全局性設(shè)計(jì)藥用的植物分子農(nóng)場(chǎng)需要綜合考慮將外源基因穩(wěn)定插入細(xì)胞核或質(zhì)體基因組以及優(yōu)化基因表達(dá)系統(tǒng)，提高翻譯后的穩(wěn)定性從而提高整體蛋白質(zhì)產(chǎn)量。選擇植物組織、器官或亞細(xì)胞器來表達(dá)和積累目標(biāo)蛋白質(zhì)對(duì)最終產(chǎn)品的完整性和功能性有較大影響。隨著全球人口的增長(zhǎng)，生物制藥的需求將大大增加，需要建立更多高效的藥用植物分子農(nóng)場(chǎng)，以滿足人類對(duì)各種疾病治療的日益增長(zhǎng)的需求。