功能核酸用于致病菌檢測(cè)的研究進(jìn)展

趙文卓 ， 李成勛 ， 胡作建 ， 余紅秀

復(fù)旦大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究院&附屬口腔醫(yī)院，上海 200032

由食源性致病菌如金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大腸桿菌（Escherichia coli）和沙門氏菌（Salmonella enterica）等引發(fā)的嘔吐、腹瀉等疾病對(duì)人類健康構(gòu)成重大威脅［1-2］。2013年，國(guó)際食品法典委員會(huì)修訂了《制定和應(yīng)用食品微生物標(biāo)準(zhǔn)的原則和指南》（CAC/GL 21—1997）［3］，其中規(guī)定了微生物標(biāo)準(zhǔn)的適用范圍、定義和要素，以及制定標(biāo)準(zhǔn)的目的、需要考慮的因素、采樣方案和檢驗(yàn)方法等內(nèi)容，以指導(dǎo)各國(guó)微生物限量標(biāo)準(zhǔn)管理工作。我國(guó)《食品安全法》第26條明確規(guī)定，食品安全標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)當(dāng)包括食品中致病性微生物的限量規(guī)定［4］。2013年，我國(guó)制定和發(fā)布了《食品中致病菌限量》（GB 29921—2013），該標(biāo)準(zhǔn)的發(fā)布對(duì)于保障食品安全和控制食源性疾病的發(fā)生具有積極作用。開發(fā)快速且準(zhǔn)確的檢測(cè)和診斷技術(shù)不僅可以對(duì)食物中存在的致病菌進(jìn)行預(yù)防，還可以幫助醫(yī)生確定致病菌，從而實(shí)施快速干預(yù)和精準(zhǔn)醫(yī)療，以改善患者的治療效果。傳統(tǒng)的細(xì)菌感染診斷方法包括細(xì)菌培養(yǎng)法［5］、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測(cè)遺傳物質(zhì)［6］、免疫分析法檢測(cè)細(xì)菌蛋白等。細(xì)菌培養(yǎng)法是一種成熟的檢測(cè)方法，依賴于生物體的直接培養(yǎng)和鋪設(shè)。但這種傳統(tǒng)的檢測(cè)方法只能有效地鑒定給定樣品中的一小部分細(xì)菌且耗時(shí)較長(zhǎng)。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)不費(fèi)時(shí)，可以快速獲得結(jié)果，但僅可用于檢測(cè)已知病原體且樣品污染可能會(huì)產(chǎn)生誤導(dǎo)性結(jié)果。雖然這些傳統(tǒng)技術(shù)都為致病菌的檢測(cè)作出巨大貢獻(xiàn)，但也存在一定的缺陷，因此，建立一個(gè)可以快速簡(jiǎn)便檢測(cè)病原微生物的分析方法至關(guān)重要。

功能核酸（functional nucleic acids，F(xiàn)NAs）是核酸和核酸類似分子的通稱，包括天然FNAs和人造FNAs兩種類型。其中，天然FNAs包括核酶（RNAzymes）和核糖開關(guān)（riboswitches）［7］，而人造FNAs包括通過體外篩選鑒定的適配體（aptamers）、核酶（RNAzymes）和脫氧核酶（DNAzymes）。FNAs具有獨(dú)立結(jié)構(gòu)、執(zhí)行催化和配體結(jié)合等功能，可以取代傳統(tǒng)的蛋白酶和抗體，執(zhí)行特定的生物學(xué)非遺傳功能。近年來，大量的功能核酸在治療、成像、篩選、藥物開發(fā)、材料科學(xué)、納米技術(shù)、有機(jī)合成和傳感等各個(gè)領(lǐng)域顯示出巨大的應(yīng)用潛力［8-9］，其中以適配體和脫氧核酶為基礎(chǔ)，結(jié)合現(xiàn)代生物技術(shù)和先進(jìn)物理技術(shù)的生物傳感器被開發(fā)出來，可在分子水平上快速、靈敏地檢測(cè)金屬離子、小分子、蛋白質(zhì)和細(xì)菌等。王琦等［10］對(duì)核酸適配體傳感器檢測(cè)食品致病菌的研究進(jìn)展做了完整的總結(jié)和回顧，本文著重討論了近年來功能核酸包括具有RNA裂解活性的DNA酶（RNA-cleaving DNAzymes，RCDs）在致病菌檢測(cè)中的應(yīng)用進(jìn)展，以期為致病菌檢測(cè)研發(fā)提供參考。

1 功能核酸的體外篩選

1.1 指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)

體外人工合成的功能核酸主要分成兩大類：一部分是能夠高特異性識(shí)別并結(jié)合靶分子的DNA或RNA分子，稱為核酸適配體（aptamer）［11］。另一部分是依賴特定分子進(jìn)行催化反應(yīng)的具有酶活性的DNA分子，稱為脫氧核酶（DNAzyme）［12］。

1990年，Ellington［13］和 Tuerk等［14］通過指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)（systematic evolution of ligands by exponential enrichment， SELEX）篩選獲得了核酸適配體。隨后，通過該方法篩選出了數(shù)千種針對(duì)氨基酸、蛋白質(zhì)、小金屬離子、有機(jī)分子、細(xì)菌、病毒和整個(gè)細(xì)胞的功能核酸。除了傳統(tǒng)的SELEX技術(shù)外，還包括基于磁珠的SELEX（magnetic beadbased SELEX）［15］、毛細(xì)管電泳SELEX（capillary electrophoresis SELEX）［16-17］和 全 細(xì) 胞SELEX（whole cell-SELEX）［18］等。根據(jù)篩選過程中是否進(jìn)行序列的擴(kuò)增富集，又將現(xiàn)有的篩選技術(shù)分為SELEX和Non-SELEX。其中Non-SELEX不需要進(jìn)行PCR等核酸序列擴(kuò)增步驟，經(jīng)過2～3次分離直接得到篩選結(jié)果。與SELEX技術(shù)相比，Non-SELEX技術(shù)可在幾天甚至幾小時(shí)內(nèi)完成篩選過程，但其局限性在于對(duì)毛細(xì)管電泳的要求較高，所以只適用于大分子物質(zhì)的篩選［19-20］。

SELEX技術(shù)為功能核酸在生命科學(xué)領(lǐng)域的拓展和應(yīng)用提供了巨大潛力。一旦確定了功能核酸的序列，就可以開發(fā)出多種生物傳感器來檢測(cè)目標(biāo)分子。以功能核酸為基礎(chǔ)的生物傳感器可分為熒光傳感器、比色法傳感器和電化學(xué)傳感器等，它們?cè)谂R床致病菌的檢測(cè)中都顯示出了巨大的應(yīng)用潛力。

1.2 適配體及其篩選原理

核酸適配體通常為單鏈DNA或RNA短序列，通過堿基互補(bǔ)配對(duì)原則或靜電作用等原因發(fā)生折疊，從而形成更為穩(wěn)定的空間結(jié)構(gòu)，這些特別的空間結(jié)構(gòu)可以選擇性地結(jié)合到目標(biāo)分子上［21-22］。適配體作為一種特殊的識(shí)別元件，功能與單克隆抗體相似，但其具備穩(wěn)定性高、易化學(xué)修飾、體積小、無免疫原性和靶標(biāo)多樣等優(yōu)點(diǎn)，在致病菌的快速檢測(cè)中具有廣闊的應(yīng)用前景。目前，已有多種基于核酸適配體設(shè)計(jì)的生物傳感器應(yīng)用于病原微生物的檢測(cè)（表1）。

表1 基于功能核酸檢測(cè)致病菌的生物傳感器性能比較Table 1 Performance comparison of biosensors for detecting pathogenic bacteria based on functional nucleic acids

針對(duì)致病菌適配體的篩選方面，目標(biāo)分子可以分為全細(xì)胞、脂多糖、蛋白質(zhì)和芽孢等，其中以全細(xì)胞作為篩選的目標(biāo)分子不需要事先明確生物標(biāo)志物。隨著研究的深入，致病菌的表面組分以及細(xì)菌休眠體已成為研究熱點(diǎn)。相比于全細(xì)胞，以表面組分和芽孢作為目標(biāo)分子具有縮短實(shí)驗(yàn)周期、降低實(shí)驗(yàn)安全隱患等獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。適配體的SELEX篩選包括7個(gè)步驟（圖1）：①確定目標(biāo)分子；②創(chuàng)建高容量的隨機(jī)DNA或RNA文庫；③將DNA或RNA文庫暴露于目標(biāo)分子；④采用特定方法分離弱結(jié)合或未結(jié)合的寡核苷酸；⑤分離目標(biāo)分子；⑥對(duì)結(jié)合的核苷酸序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增并進(jìn)入下一輪篩選；⑦通過反復(fù)的多輪篩選、分離和擴(kuò)增，生成與靶分子高特異性結(jié)合的功能核酸。

圖1 適配體篩選原理[37]Fig. 1 Screening principles of aptamer[37]

1.3 脫氧核酶及其篩選原理

脫氧核酶是具有催化功能的人工單鏈DNA分子，這些分子可以通過體外篩選從隨機(jī)序列DNA庫中分離出來，并作為分子工具被廣泛應(yīng)用。由于脫氧核酶依賴于催化反應(yīng)，與核酸適配體相比，它們不太容易受到非特異性結(jié)合的影響。脫氧核酶包括RNA連接酶、RNA切割酶、DNA連接酶和DNA切割酶等。1994年，Breaker等［38］首次報(bào)道了具有RNA裂解活性的脫氧核酶GR-5，因其良好的生物相容性、高親和結(jié)合力以及靈敏度等特點(diǎn)，在開發(fā)生物分子檢測(cè)和成像傳感器方面?zhèn)涫荜P(guān)注。近年來，以RCDs作為識(shí)別原件檢測(cè)多種目標(biāo)分子的生物傳感器得以廣泛應(yīng)用（表1）。

RCDs的靶標(biāo)可以是RNA［39］、細(xì)菌混合物［40］、潛在的細(xì)胞靶標(biāo)混合物［41］和細(xì)菌粗細(xì)胞外基質(zhì)（crude extra-cellular mixture，CEM）［42］。RCDs的SELEX篩選原理包括6步（圖2）：①制備含有隨機(jī)序列區(qū)、引物結(jié)合區(qū)及一個(gè)核糖核苷酸（rA）為假定切割位點(diǎn)的初始文庫，文庫5'端修飾生物素標(biāo)簽，錨定在固定相上；②目標(biāo)分子與文庫共孵育；③部分DNA序列與目標(biāo)分子相互作用折疊成活性結(jié)構(gòu)切割rA位點(diǎn)，并從固定相中脫落釋放；④PCR擴(kuò)增切割釋放的這部分DNA序列；⑤引入rA切割位點(diǎn)和生物素標(biāo)簽，生成次級(jí)文庫；⑥進(jìn)行下一輪篩選。該方法不需要預(yù)先確定生物標(biāo)志物，且選定的RCDs對(duì)細(xì)菌高度敏感，可以對(duì)樣品基質(zhì)中的潛在靶標(biāo)作出反應(yīng)。

圖2 RCDs的篩選原理Fig. 2 Screening principle of RCDs

2 基于功能核酸的致病菌檢測(cè)

2.1 熒光檢測(cè)

熒光檢測(cè)具有較高的靈敏度，是一種應(yīng)用前景廣闊的生物樣品分析技術(shù)。熒光團(tuán)與核苷酸的大小通常一致，主要用于探測(cè)功能核酸與目標(biāo)物的結(jié)合。熒光團(tuán)具有許多特性，包括消光系數(shù)、激發(fā)/發(fā)射波長(zhǎng)、壽命和能量轉(zhuǎn)移等。已有多種不同的納米熒光材料被用在基于核酸適配體的生物傳感器設(shè)計(jì)中，直接用于病原微生物的檢測(cè)［43-48］。常見的納米熒光材料有金納米顆粒（gold nanoparticles，AuNPs）、量子點(diǎn)（quantum dots，QDs）、上轉(zhuǎn)換納米粒子（up-conversion nanoparticles，UCNPs）、碳點(diǎn)（carbon dots，CDs）和硅納米顆粒（silica nanoparticles）等。金納米顆粒具有高消光系數(shù)和依賴距離的光學(xué)特性，是一種通過肉眼可見的顏色變化進(jìn)行生物傳感的優(yōu)良材料［49-50］。量子點(diǎn)是硒化鎘表面涂有硫化鋅的納米晶體，在低能光激發(fā)下發(fā)出熒光。量子點(diǎn)具有較寬的激發(fā)光譜和較窄的發(fā)射光譜，因此使多色量子點(diǎn)系統(tǒng)對(duì)多個(gè)目標(biāo)進(jìn)行多重檢測(cè)成為可能［51-52］。碳點(diǎn)是最近發(fā)展起來的熒光準(zhǔn)球形納米顆粒，主要由3～10 nm的sp2和sp3雜化碳原子組成。兩親性碳點(diǎn)對(duì)細(xì)菌細(xì)胞膜具有較高親和性，因此可以作為細(xì)菌細(xì)胞的有效熒光標(biāo)記物［53］?；跓晒夥ǖ纳飩鞲衅髦饕m用于實(shí)驗(yàn)室、醫(yī)院和相關(guān)機(jī)構(gòu)的檢測(cè)，靈敏度較高，但具有依賴相關(guān)熒光檢測(cè)儀器和成本較高等缺點(diǎn)（表1）。

2.1.1基于核酸適配體的熒光檢測(cè) Ikanovic等［23］利用量子點(diǎn)與核酸適配體相結(jié)合，直接對(duì)蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis）孢子進(jìn)行檢測(cè)，檢出最低限為1 000 CFU·mL-1。Nuo等［24］利用量子點(diǎn)標(biāo)記的核酸適配體建立了一種流式細(xì)胞術(shù)，可以同時(shí)檢測(cè)副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）和鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimurium）。除此之外， Jin等［25］開發(fā)了一種基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移（fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET）的新型檢測(cè)平臺(tái)，用于快速、特異性的細(xì)菌檢測(cè)。首先將金納米顆粒與核酸適配體結(jié)合，上轉(zhuǎn)換納米粒子與核酸適配體互補(bǔ)的cDNA綴合；然后當(dāng)核酸適配體和cDNA雜交時(shí)，上轉(zhuǎn)換納米粒子熒光發(fā)射和金納米顆粒吸收之間的光譜重疊，發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致上轉(zhuǎn)換熒光猝滅。而在靶細(xì)菌存在的情況下，核酸適配體優(yōu)先與細(xì)菌結(jié)合形成一個(gè)三維結(jié)構(gòu)，將上轉(zhuǎn)換納米粒子-cDNA從金納米顆粒-核酸適配體上解離，從而恢復(fù)上轉(zhuǎn)換熒光。該團(tuán)隊(duì)成功地利用該傳感器對(duì)大腸桿菌ATCC 8739進(jìn)行了檢測(cè)，檢測(cè)范圍為5～106CFU·mL-1，檢出限為3 CFU·mL-1，此方法也可用于食物和水樣中大腸桿菌的檢測(cè)。同時(shí)，該研究應(yīng)用980 nm近紅外激光激發(fā)產(chǎn)生熒光信號(hào)，避免了由于復(fù)雜的真實(shí)食物和水樣中含有的生物分子而可能產(chǎn)生的自發(fā)熒光，保證了適配體在復(fù)雜樣品中特異性。Wang等［26］提出核酸適配體結(jié)合碳點(diǎn)對(duì)鼠傷寒沙門氏菌進(jìn)行定量檢測(cè)，檢測(cè)范圍為103～105CFU·mL-1，在2 h內(nèi)的最低檢測(cè)限為50 CFU·mL-1。

2.1.2基于RCDs的熒光檢測(cè) RCDs具有RNA切割活性，利用此特性可設(shè)計(jì)特殊的誘導(dǎo)性探針開關(guān)，觸發(fā)熒光信號(hào)變化［27，54］。近年來，人們開發(fā)了熒光標(biāo)記的RCDs（RNA-cleaving fluorogenic DNAzymes，RFDs），用于體外檢測(cè)多種細(xì)菌。這些RFDs可以在嵌入熒光的DNA-RNA嵌合底物的單個(gè)核糖核苷酸位點(diǎn)上進(jìn)行切割。核糖核苷酸的兩側(cè)分別帶有熒光基團(tuán)和猝滅劑，因此在完整的底物被剪切之前，熒光值非常低，而在目標(biāo)細(xì)菌存在時(shí)，底物被RFDs切割，導(dǎo)致熒光基團(tuán)與淬滅劑標(biāo)記的序列分離，從而產(chǎn)生熒光信號(hào)（圖3）［55-56］?；谠撛恚呀?jīng)實(shí)現(xiàn)了對(duì)大腸桿菌（Escherichia coli）［57］、幽門螺旋桿菌（Helicobacter pylori）［32］、肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）［28］和鰻弧菌（Vibrio anguillarum）［29］等的高特異性檢測(cè)。例如，Yousefi等［27］開發(fā)了一種食品包裝傳感器，可以實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)特定細(xì)菌對(duì)食品的污染。大腸桿菌激活的RFDs被共價(jià)連接在低熒光背景、高柔韌性和低成本的環(huán)烯烴聚合物膜上，當(dāng)膜與污染肉類接觸時(shí)，會(huì)產(chǎn)生一種獨(dú)特的熒光信號(hào)，而未污染的肉類上檢測(cè)不到這種熒光信號(hào)，且信號(hào)可以在至少兩周內(nèi)保持穩(wěn)定，這項(xiàng)工作很好地將脫氧核酶?jìng)鞲衅骷夹g(shù)轉(zhuǎn)化為創(chuàng)新應(yīng)用。Ali等［28］提出了一種基于RFDs的肺炎克雷伯菌熒光紙傳感器，該RFDs在肺炎克雷伯菌存在的情況下通過體外選擇技術(shù)切割熒光DNA-RNA嵌合底物生成，RFDs以96孔格式打印在紙基質(zhì)上，其檢測(cè)限為105CFU·mL-1。研究者對(duì)20株臨床分離的細(xì)菌進(jìn)行評(píng)估，發(fā)現(xiàn)無論其來源或耐藥性如何，RFDs都能在含有肺炎克雷伯菌樣本中產(chǎn)生熒光信號(hào)。該方法操作簡(jiǎn)單、快速、廉價(jià)，且避免了復(fù)雜的設(shè)備和樣品制備程序，但缺點(diǎn)是無法區(qū)分易感分離株與碳青霉烯類耐藥分離株，因此，RCD的特異性仍有進(jìn)一步的提高空間。

圖3 基于RFDs的熒光檢測(cè)原理圖[33]Fig. 3 Schematic diagram of fluorescence detection based on RFDs[33]

綜上所述，篩選方法中RNA剪切點(diǎn)兩邊分別標(biāo)記一個(gè)熒光基團(tuán)和一個(gè)淬滅劑，雖然可以產(chǎn)生靈敏和即時(shí)的信號(hào)，但是這種修飾昂貴且選擇程序較復(fù)雜，同時(shí)，這些標(biāo)簽成為RFDs的一部分使RFDs難以用于檢測(cè)其他類型的信號(hào)。Gu等［29］設(shè)計(jì)了一種未修飾的文庫，并篩選到能對(duì)鰻弧菌進(jìn)行特異性檢測(cè)的RCDs。以此為基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)了FAM標(biāo)記的生物傳感器，成功用于魚類組織和飼料水樣中的細(xì)菌檢測(cè)，檢測(cè)限可降至4 000 CFU·mL-1。此外，研究也表明未修飾DNA也可用于細(xì)菌的靶向檢測(cè)，這使RCDs的篩選文庫進(jìn)一步擴(kuò)大，不僅降低了成本，也為最佳RCD的篩選提供了基礎(chǔ)。

2.2 比色法檢測(cè)

比色法檢測(cè)是基于某一化合物的變色反應(yīng)從而導(dǎo)致整個(gè)系統(tǒng)顏色的改變，通過視覺觀察或使用分光光度計(jì)獲得結(jié)果的檢測(cè)方法［58］。與其他檢測(cè)方法相比，比色法檢測(cè)可以最大限度地減少甚至消除對(duì)分析儀器的依賴，這使現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)成為可能，但結(jié)果難以量化（表1）。比色法檢測(cè)的構(gòu)建需要引入顏色報(bào)告基團(tuán)，如有機(jī)染料、共軛聚合物和金屬納米顆粒。

2.2.1基于核酸適配體的比色檢測(cè) 金納米顆粒是一種常見的納米材料，呈紅色，適配體可以在鹽溶液中與金納米顆粒結(jié)合并使其分散，然而當(dāng)靶標(biāo)物存在時(shí)，適配體就會(huì)和金納米顆粒分離與靶標(biāo)物結(jié)合，導(dǎo)致金納米顆粒聚集，溶液顏色從紅色變成紫色。由于其獨(dú)特的性質(zhì)，金納米顆粒已被廣泛用于比色檢測(cè)（圖4）［59］。Chang等［30］報(bào)道了一種基于核酸適配體SA23-金納米顆粒檢測(cè)金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的方法，發(fā)現(xiàn)檸檬酸包被的金納米顆粒與金黃色葡萄球菌的結(jié)合能力很強(qiáng)，而與腸道沙門氏菌（Salmonella enterica）和奇異變形桿菌（Proteus mirabilis）的結(jié)合能力較弱，導(dǎo)致鹽溶液中金納米顆粒的顏色發(fā)生了不同變化，這種比色反應(yīng)能夠?qū)⒔瘘S色葡萄球菌與其他細(xì)菌分開。Kim等［31］應(yīng)用金納米顆粒發(fā)現(xiàn)了一種靈敏且方便的免標(biāo)記核酸適配體平臺(tái)，用于嬰兒配方奶粉中阪崎腸桿菌（Cronobacter sakazakii）的比色檢測(cè)。

圖4 基于核酸適配體-金納米顆粒的比色檢測(cè)原理圖[30]Fig. 4 Schematic diagram of colorimetric detection based on aptamer-AuNPs[30]

2.2.2基于RCDs的比色檢測(cè) 由于RCDs具有RNA切割活性且易于修飾，因此可利用信號(hào)轉(zhuǎn)換分子將催化反應(yīng)轉(zhuǎn)化成視覺信號(hào)。Ali等［32］報(bào)道了一種幽門螺旋桿菌（Helicobacter pylori）特異性脫氧核酶，并設(shè)計(jì)了一種便攜式紙基傳感器，可以有效地在1 h內(nèi)實(shí)現(xiàn)對(duì)幽門螺旋桿菌的半定量檢測(cè)。該傳感器將尿素連接的底物鏈與RCDs進(jìn)行雜交，幽門螺旋桿菌蛋白激活RCDs，裂解底物鏈，使脲酶釋放到體系中。隨后脲酶進(jìn)入含有尿素和酚紅的檢測(cè)區(qū)域，將尿素水解成氨，促使檢測(cè)區(qū)域pH改變，從而導(dǎo)致顏色變化。Ali等［33］還分離出了一種新型的由金黃色葡萄球菌激活的RCDs，基于此設(shè)計(jì)了一種簡(jiǎn)單的側(cè)流式裝置（lateral flow device，LFD），用于快速檢測(cè)鼻腔粘液中的金黃色葡萄球菌，此方法可在無任何設(shè)備的條件下，在30 min內(nèi)通過比色讀數(shù)方式提供測(cè)試結(jié)果。這種紙基傳感器無需精密設(shè)備即可進(jìn)行分析，且能夠直觀顯示結(jié)果，且在室溫下能夠穩(wěn)定至少4個(gè)月。這些發(fā)現(xiàn)使生物傳感器更加便攜，且開發(fā)成本低，對(duì)于資源有限的地區(qū)非常有意義。

2.3 電化學(xué)檢測(cè)

除熒光檢測(cè)和比色檢測(cè)以外，電化學(xué)方法也可用來進(jìn)行病原微生物檢測(cè)。與其他檢測(cè)方法相比，電化學(xué)檢測(cè)是一個(gè)具有吸引力的平臺(tái)，其檢測(cè)原理是根據(jù)功能核酸與靶標(biāo)物結(jié)合時(shí)電學(xué)性質(zhì)的變化進(jìn)行結(jié)果判斷。在實(shí)際應(yīng)用方面，與熒光檢測(cè)不同，電化學(xué)檢測(cè)相關(guān)的儀器成本要低很多，電子設(shè)備通?？梢孕⌒突?，同時(shí)超高的靈敏度、良好的再現(xiàn)性和快速的響應(yīng)使檢測(cè)結(jié)果可以非常直觀地觀察到（表1）［60-62］。

2.3.1基于核酸適配體的電化學(xué)檢測(cè) Lian等［34］利用金黃色葡萄球菌核酸適配體作為生物識(shí)別原件，構(gòu)建了一種新型核酸適配體——石墨烯交叉指狀金電極壓電式傳感器，用于金黃色葡萄球菌的快速檢測(cè)。石墨烯通過化學(xué)反應(yīng)固定在交叉指狀金電極表面，在沒有金黃色葡萄球菌的情況下，核酸適配體吸附在石墨烯上，反之，適配體優(yōu)先與金黃色葡萄球菌結(jié)合，并從石墨烯上分離，使電極表面的電參數(shù)發(fā)生變化，導(dǎo)致串聯(lián)電極壓電石英晶體的振蕩頻率發(fā)生變化。該傳感器的檢測(cè)限為41 CFU·mL-1，可用于臨床診斷和食品檢測(cè)。在此基礎(chǔ)上，Thi等［35］開發(fā)了一對(duì)同時(shí)結(jié)合金黃色葡萄球菌的同源適配體，并將這對(duì)適配體成功地用于開發(fā)三明治型電化學(xué)生物傳感器，其在緩沖液和自來水樣中的檢測(cè)限分別為39 CFU·mL-1和414 CFU·mL-1。這種電化學(xué)適配傳感器簡(jiǎn)單、靈敏且對(duì)昂貴的儀器無任何要求。這些優(yōu)點(diǎn)使新型三明治型電化學(xué)生物傳感器可以很好地應(yīng)用于金黃色葡萄球菌檢測(cè)，同時(shí)在食品工業(yè)和其他領(lǐng)域有廣闊的應(yīng)用前景。

2.3.2基于RCDs的電化學(xué)檢測(cè) 基于RCDs的電化學(xué)檢測(cè)是將脫氧核酶作為靶標(biāo)物的識(shí)別探針應(yīng)用于電極上。Pandey等［36］通過篩選獲得高特異性識(shí)別大腸桿菌的RCDs，并將電活性RCDs集成到具有納米結(jié)構(gòu)電極的雙通道電子芯片中，當(dāng)大腸桿菌存在時(shí)，RCDs識(shí)別大腸桿菌，發(fā)生切割并釋放DNA條形碼，隨后雙星形通道的差分電化學(xué)芯片捕獲電活性DNA條形碼，實(shí)現(xiàn)信號(hào)傳導(dǎo)（圖5）。該方法靈敏度高、特異性強(qiáng)且可手持使用，能夠從包含多種非特異性細(xì)菌中選擇性地檢測(cè)1 000 CFU·mL-1的大腸桿菌，實(shí)現(xiàn)在1 h內(nèi)分析臨床尿液樣本，其靈敏度和特異性與需要數(shù)日完成的臨床尿液培養(yǎng)相近。隨著DNAzymes技術(shù)和電子芯片制造技術(shù)的進(jìn)步，該系統(tǒng)可以設(shè)計(jì)成一體的POC測(cè)試盒，并且可以進(jìn)行多行靶向和鑒定多種病原體，使檢測(cè)無試劑、更快速和多樣化。

圖5 基于RCDs的電化學(xué)檢測(cè)原理圖[36]Fig. 5 Schematic diagram of electrochemical detection based on RCDs[36]

3 展望

由致病性細(xì)菌引發(fā)的疾病對(duì)人類健康構(gòu)成了巨大威脅。現(xiàn)有研究雖然在傳染病的診斷和治療方面取得了重大進(jìn)展，但開發(fā)快速、經(jīng)濟(jì)的檢測(cè)方法，克服治療試劑的副作用和病原體耐藥性仍然是巨大的挑戰(zhàn)。功能核酸由于具有親和力高、免疫原性低和易于修飾等特點(diǎn)，為開發(fā)新型診斷試劑和治療藥物提供了有力工具。本文綜述了適配體和RCDs在致病菌檢測(cè)中的應(yīng)用進(jìn)展。

盡管功能核酸在致病菌檢測(cè)方面已經(jīng)取得了令人興奮的進(jìn)展，但在真正的實(shí)際應(yīng)用中仍然存在巨大挑戰(zhàn)，克服這些挑戰(zhàn)是推動(dòng)該領(lǐng)域向前發(fā)展的關(guān)鍵。例如，功能核酸在復(fù)雜樣本（如食物、血液或糞便）中是否仍然發(fā)揮作用？復(fù)雜樣品中包含其他微生物種類以及化學(xué)或生物污染，功能核酸作為識(shí)別元件，是否仍然具有高度特異性和穩(wěn)定性？此外，生物傳感器的成本和用戶友好性也十分關(guān)鍵，特別是用于環(huán)境檢測(cè)和家庭、社區(qū)、醫(yī)院等現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用的傳感器，需要操作簡(jiǎn)單、快速且結(jié)果易于解讀。這些挑戰(zhàn)需要更多的創(chuàng)新思路，同時(shí)也可以為該研究領(lǐng)域迎來新的機(jī)遇。隨著納米技術(shù)和化學(xué)生物學(xué)快速發(fā)展，研究者不斷對(duì)功能核酸分子進(jìn)行化學(xué)修飾，以提高其在臨床標(biāo)本中的穩(wěn)定性，甚至延長(zhǎng)其體內(nèi)存活率并降低其清除率。越來越多基于生物納米分子和納米材料組合的生物傳感器被開發(fā)，為致病菌檢測(cè)與臨床診斷方面的挑戰(zhàn)提供解決方案。未來，在功能核酸的篩選過程中，研究者需要通過更優(yōu)的篩選文庫、更便捷高效的篩選條件等，獲得更高特異性的功能核酸，從而提高生物傳感器的靈敏度和精確度。同時(shí)，也需要根據(jù)不同的使用環(huán)境和操作人員，設(shè)計(jì)更為合理、方便的生物傳感器，使其更好的服務(wù)于家庭、社區(qū)、醫(yī)院等。相信在不久的將來，基于功能核酸的致病菌檢測(cè)技術(shù)會(huì)進(jìn)一步在食品、環(huán)境和醫(yī)療等方面獲得更廣泛的應(yīng)用。