固相萃取與氣相色譜-質譜法聯(lián)用測定食用植物油和含脂肪食品中氯丙醇酯的方法驗證研究

盛蕖 ， 張涵 ， 萬悅 ， 占艷 ， 焦玲玲 ， 衛(wèi)楊帆 ， 王超 ， 程勝

黃石市疾病預防控制中心，湖北 黃石 435000

氯丙醇及其酯化物是國際公認的食品加工過程污染物，最早于1978年在用于生產醬油的酸水解植物蛋白中被發(fā)現［1］。后續(xù)研究發(fā)現，脂肪含量高的食品在熱加工過程中?；视团c氯離子發(fā)生反應生成氯丙醇及其酯化物［2］。此外，氯丙醇作為一種鹵代醇，也是樹脂、聚合物、農藥和藥物生產過程中的試劑和原材料［3］。氯丙醇不穩(wěn)定，在食品中主要以酯的形式存在［4］。氯丙醇的種類很多，包括 2-氯-1，3-丙二醇（2-MCPD）、3-氯-1，2-丙二醇（3-MCPD）、1，3-二氯-2-丙醇（1，3-DCP）和2，3-二氯-2-丙醇（2，3-DCP），其中毒性最強的為3-MCPD。氯丙醇具有遺傳毒性、誘變活性以及潛在的致癌性［5-6］，對人體健康構成較大危害。近年來，氯丙醇在熱加工過程食物（食用油脂、兒童食品［5，7-9］、飲用水、食品接觸材料［10］）中的發(fā)現引起了社會對食品安全的廣泛關注。因此，根據已獲得的毒理學研究數據，聯(lián)合國糧食與農業(yè)組織（Food and Ariculture Organization of the United Nations，FAO）、世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）-食品添加劑專家委員會（Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives，JECFA）以及歐盟食品學術研究委員會規(guī)定，3-MCPD每日可承受的最大攝入量為2 μg·kg-1bw［11］。

到目前為止，3-MCPD酯主要在一些食用油脂和含油量大的食品（如油炸食品、嬰幼兒配方食品）中被檢測到［12-15］。由于氯丙醇酯普遍存在于人類的日常飲食中，給該領域的風險評估和再調查研究造成了比較大的困難［2］。在生物體內氯丙醇酯通過消化作用轉化成氯丙醇的過程還處在推理階段，并且上述過程的轉化率在人體毒理學的研究中還沒有相關數據［16］。因此，在對食品中氯丙醇進行風險評估時，我們假設氯丙醇酯在人體內能夠100%轉化成氯丙醇［17］。

目前，分析檢測食品中的氯丙醇酯通常采用氣相色譜-質譜法（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）［4，18-20］，通過測定氯丙醇酯的水解產物——氯丙醇的含量，間接得到食品中氯丙醇酯的含量。在此之前，需要通過衍生技術來增強目標物質的反應活性，從而提高方法的靈敏度、分辨率和選擇性［21］。直接測定氯丙醇酯的方法很難用于常規(guī)分析，因為在這個過程中需要購買大量的標準物質并且在樣品基質復雜的情況下目標物質很難完全分離［22］。已報道的前處理方法主要有固相微萃取法（solid phase microextraction，SPME）［23-24］、磁性固相萃取法（magnetic solid phase extraction，MSPE）［25］、加壓溶劑萃取法（pressurized liquid extraction，PLE）［18］、分散液-液微萃取法（dispersiveliquid-liquid microextraction，DLLME）［26］。盡管上述方法都能用于檢測食品中氯丙醇酯的含量，但樣品前處理過程需要大量的溶劑和吸附劑，處理過程十分繁瑣且方法靈敏度低，難以滿足實際檢測的需求。

基于上述現狀，建立簡單、快速、靈敏的分析方法對于食品中氯丙醇酯的研究、調查以及預防工作至關重要。本團隊結合食品安全風險監(jiān)測工作手冊和已報道的方法，運用固相支持液-液萃取凈化技術、衍生技術與氣相色譜-質譜法相結合的分析方法檢測食品中氯丙醇酯的含量，一方面與其他機構之間進行了協(xié)同驗證，另一方面經過了英國食品分析評估計劃（Food Analysis Performance Assessment Scheme，FAPAS）的能力驗證，并對76批次的3類食品（油及其制品、谷物及其制品、特殊營養(yǎng)用食品）中氯丙醇酯的含量進行了調查，以期為氯丙醇脂的相關研究和檢測提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要儀器

7890B-5977A氣相色譜-質譜聯(lián)用儀（GC-MS）購自美國Agilent公司，B、I、R、V-300旋轉蒸發(fā)儀購自瑞士BUCHI公司，SOX500脂肪測定儀，BF-2000氮氣吹干儀，QL-901渦旋振蕩器，SFG-01B電熱恒溫鼓風干燥箱，SX2-8-10馬弗爐，AS-3120超聲波清洗器，SHZ-B水浴恒溫振蕩器，1 mL氣密針，2 mL螺口具蓋樣品瓶。

1.2 主要試劑與材料

3-氯-1，2-丙二醇雙棕櫚酸酯（3-MCPD棕櫚酸二酯，純度98%），氘代同位素內標3-氯-1，2-丙二醇雙棕櫚酸酯-d5（d5-3-MCPD棕櫚酸二酯，同位素純度為98%），2-氯-1，3-丙二醇雙硬脂酸酯（2-MCPD硬脂酸二酯，純度98%），氘代同位素內標2-氯-1，3-丙二醇雙硬脂酸酯-d5（d5-2-MCPD硬脂酸二酯，同位素純度為98%）均購自加拿大TRC公司；1-（七氟正丁?；┻溥颍℉FBI，純度97%）購自北京百靈威科技有限公司；甲醇鈉（粉末狀，純度＞96.0%）購自東京化成工業(yè)株式會社；甲基叔丁基醚、石油醚（沸程為35～60 ℃）、乙醚、乙酸乙酯、正己烷、甲醇、冰乙酸均為色譜純；無水乙醇、無水硫酸鈉和氯化鈉均為分析純。硅藻土基質分散固相萃取柱（2 000 mg·45 mL-1）配制專用基質分散劑（3 g·袋-1）和高效脫水劑（15 g·袋-1）購自福州勤鵬生物科技有限公司。

1.3 標準溶液的配制

甲醇鈉溶液：稱取1.35 g甲醇鈉溶解于50 mL甲醇中，用塑料瓶存放，4 ℃保存?zhèn)溆?；溶解液：甲基叔丁基醚與乙酸乙酯以8∶2的體積比混合，用玻璃瓶存放，4 ℃保存?zhèn)溆茫恢泻鸵海?5 mL飽和氯化鈉溶液中加入2.0 mL冰乙酸，混勻備用；乙醚經重蒸后得到無水乙醚備用。

標準儲備液：分別準確稱取1.00 mg 3-MCPD棕櫚酸二酯、2-MCPD硬脂酸二酯、d5-3-MCPD棕櫚酸二酯、d5-2-MCPD硬脂酸二酯標準品于10 mL容量瓶中，用乙酸乙酯溶解，定容至刻度線，混勻后得到濃度為100 μg·mL-1的單一標準儲備液（均以其游離態(tài)3-MCPD、2-MCPD、d5-3-MCPD、d5-2-MCPD表示），于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

混合標準工作液：重復上述步驟，稀釋得到濃度為1.00 μg·mL-1的混合標準工作液（3-MCPD、2-MCPD）和1.00 μg·mL-1的混合內標工作液（d5-3-MCPD、d5-2-MCPD），于4～8 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

標準系列溶液：于5支離心管中各稱取約0.10 g飽和氯化鈉溶液，分別準確加入20、40、100、200、400 μL混合標準工作液（濃度為1.00 μg·mL-1），相當于20、40、100、200、400 ng的氯丙醇，以樣品為0.10 g計算，相當于氯丙醇酯濃度分別為0.200、0.400、1.00、2.00、4.00 mg·kg-1（均以氯丙醇計）。再準確加入混合內標工作液（濃度為1.00 μg·mL-1）各60 μL，超聲混勻后按1.4步驟進一步處理。

1.4 樣品來源與分類

本次調查的76批次3類食品（油及其制品、谷物制品、特殊營養(yǎng)用食品）均從各大超市采集，包含大豆油、花生油、菜籽油、調和油、橄欖油、面包、餅干、糕點、方便面、麻花、油條、乳及乳制品、特殊膳食共13個品種。

1.5 樣品的前處理

準確稱取0.10 g脂肪樣品，加入0.50 mL溶解液，再加入60 μL濃度為1.00 μg·mL-1的混合內標工作液，超聲15 min后加入1.0 mL甲醇鈉溶液，渦旋30 s，隨后立即加入適量的中和液，控制pH為6.0～7.0，否則3-MCPD會部分轉化為縮水甘油［13］，影響最后3-MCPD實際含量的測定；在上述水解液中倒入專用基質分散劑（3 g·袋-1），混勻后轉移到硅藻土基質分散固相萃取柱（2 000 mg·45 mL-1）中，用30 mL正己烷淋洗，棄去此淋洗液，再用80 mL無水乙醚分多次洗脫，收集洗脫液于裝有高效脫水劑（15 g·袋-1）的三角瓶中，然后過濾，并用10 mL 正己烷淋洗濾渣，收集濾液；濾液經旋蒸、氮吹后，用正己烷定容至約1.2 mL；隨后，加入50 μL衍生劑HFBI，立即蓋上磨口瓶塞渦旋，于75 ℃的電熱恒溫箱中衍生30 min；衍生結束后，冷卻至室溫，補加正己烷至1.2 mL，加入1 mL飽和氯化鈉，充分渦旋后轉移上層清液至裝有適量無水硫酸鈉的進樣小瓶中，振搖后供GC-MS分析。

氣相色譜條件：DB-5 MS 毛細管色譜柱（30 m×0.25 m×0.25 μm， Agilent）；進樣口溫度：280 ℃；程序升溫：初始溫度50 ℃，保持1 min，以2 ℃·min-1的速度升至90 ℃，再以40 ℃·min-1的速度升至280 ℃，保持5 min；載氣為高純度氦氣，流速為1.0 mL·min-1；采用不分流進樣模式，進樣量為1 μL。

質譜條件：EI電離源；增益因子：15；電子倍增器電壓：1 109 V；溶劑延遲時間：5 min；離子源溫度：230 ℃；MS四極桿溫度：150 ℃；采集類型：SIM模式；監(jiān)測的定性離子和定量離子如表1所示。

表1 氯丙醇及其內標衍生物在GC-MS中的保留時間、定性離子和定量離子Table 1 Retention times, quantifier ion and qualifier ions for the derivatives of chloropropanols and internal standards by GC-MS

1.6 機構驗證實驗

5家機構用上述方法對已知本底值的油樣進行加標回收實驗，并同步進行FAPAS樣品檢測。

2 結果與分析

2.1 氯丙醇酯測定的質量保證與質量控制

將1.2中處理好的標準系列溶液按照1.5中的GC-MS條件進樣分析，得到的總離子流色譜圖（total ions chromatogram，TIC）如圖1所示，兩種氯丙醇及其內標衍生物分離度較好，且峰形尖銳，對稱性好，目標物的保留時間以及定性、定量離子（表1）為后續(xù)實際樣品中氯丙醇酯的測定提供了準確的定性依據。

圖1 氯丙醇及其內標衍生物的總離子流圖Fig. 1 Total ion chromatogram of the derivatives of chloropropanols and internal standards

處理好的標準系列溶液將混合標準和混合內標均進行了衍生操作，因此氯丙醇酯含量（均以游離態(tài)氯丙醇計）分別以對應的標準衍生物與其內標衍生物峰面積的比值來計算，得到的線性回歸方程、相關系數及線性范圍結果顯示（表2），兩種氯丙醇酯的檢測在0.200～4.00 mg·kg-1范圍內線性關系良好（R2＞0.999）。通常情況下，萃取-衍生技術聯(lián)用GC-MS方法的檢出限（limit of detection，LOD）和定量限（limit of quantitation，LOQ）分別以信噪比S/N=3［18］和S/N=10［27-28］計算得到，以此為依據，本方法3-MCPD酯的LOD和LOQ分別為0.042、0.140 mg·kg-1，2-MCPD酯的LOD和LOQ分別為0.058和0.193 mg·kg-1（表2）。進一步對6組空白樣品進行加標回收實驗，以回收率的均值表示方法的準確度，以測定實際結果的相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）表示方法的精密度，由表3可知，3-MCPD酯和2-MCPD酯的平均回收率分別為98.9%和96.5%，兩者的RSD分別為2.6%和4.3%，這表明此方法的精密度和準確度良好。

表2 應用方法的特征分析參數Table 2 The summary of analytical characteristics data of applied methodology

表3 回收率及標準偏差檢測結果（n=6）Table 3 Results of recoveries and relative standard deviations (n=6)

2.2 方法驗證

一方面，5家機構對該方法進行了協(xié)同驗證，由結果可知（表4），兩種氯丙醇酯在0.200～3.000 mg·kg-1范圍內線性良好，LOD在0.030～0.058 mg·kg-1之間，加標的平均回收率在90.1%～104.9%之間，測定實際結果的相對偏差均小于10%，表明該方法的準確性和精密性良好；另一方面，5家機構利用該法測定了英國FAPAS能力驗證樣品，結果如表5所示，所有樣品的測定結果均在合格范圍之內，且平行樣品之間的相對偏差均小于10%，進一步驗證了該方法的可靠性。不同前處理方法的萃取條件、衍生條件、LOD、LOQ以及加標回收率的比較如表6所示，綜合各方因素，固相萃取法（SPE）操作簡便，實際消耗較少，實驗結果能滿足實際樣品檢測需要。

表4 不同檢驗機構之間方法驗證結果Table 4 Results of verification by different inspection and research institutes

表5 不同檢驗機構測定FAPAS樣的結果（n=3）Table 5 Results of detecting FAPAS samples by different inspection and research institutes (n=3)

表6 不同前處理方法的比較Table 6 Comparison of different pretreatment methods

2.3 實際樣品中氯丙醇酯含量的調查

利用本方法對76批次的3類食品（油及其制品、谷物制品、特殊營養(yǎng)用食品）中氯丙醇酯的含量進行了調查。樣品的前處理按照1.4的步驟進行，進樣分析后，得到的結果如表7所示，3-MCPD酯的含量在0.042～4.865 mg·kg-1之間，平均 值 為0.773 mg·kg-1；而2-MCPD酯 的 含 量 在0.058～2.592 mg·kg-1之間，平均值為0.469 mg·kg-1，小于3-MCPD酯在這3類食品中的含量，主要是因為這些食品中的油和油脂是由具有高度特異性的原料在精煉過程中加工得到的［11］。

表7 常見食用油和含脂肪食品中3-MCPD酯和2-MCPD酯的含量Table 7 Content of 3-MCPD esters and 2-MCPD esters in edible vegetable oils and fatty food

由表1可知，在GC-MS分析中，對3-MCPD酯和2-MCPD酯進行檢測的定量離子為289 m·z-1，3類食品提取該離子的色譜圖，從圖2中可以清晰地看到3-MCPD酯和2-MCPD酯的特征峰，說明3類食品中均含有這2種氯丙醇酯。

圖2 3類食品的提取離子色譜圖（289 m·z-1）Fig. 2 Extracted ion chromatogram (EIC, 289 m·z-1) of three kinds of food

對所調查的76份樣品進行統(tǒng)計分析，結果如表8所示，其中，3-MCPD酯和2-MCPD酯的樣本檢出率分別為93.4%和98.7%，樣本檢出率較高，應引起高度重視。3類食品中氯丙醇酯含量的比較如圖3所示，谷物制品中氯丙醇酯的含量最多，這是因為此類食品中的水分較少。研究表明，水分含量少于15%的食品中有較多的甘油存在［18］，甘油在熱加工過程中與氯離子作用容易產生氯丙醇酯。

表8 全部所測樣品中3-MCPD酯和2-MCPD酯含量的分布情況Table 8 Content distribution of 3-MCPD esters and 2-MCPD esters in all samples

圖3 3類食品中3-MCPD酯和2-MCPD酯的含量Fig. 3 Content of 3-MCPD esters and 2-MCPD esters in three kinds of food

3 討論

本文采用固相支持液-液萃取凈化技術、衍生技術與氣相色譜-質譜法相結合的檢測方法，并將該方法成功運用在3類實際樣品（油及其制品、谷物制品、特殊營養(yǎng)用食品）中氯丙醇酯含量的分析。所調查的76份樣品中，3-MCPD酯和2-MCPD酯的樣本檢出率均高于90%，這為有關部門深入系統(tǒng)地采取措施提供了理論依據。實驗過程中，方法的線性范圍、檢出限、定量限、加標回收率均能滿足實際檢測需要。此外，利用實驗室間比對的方式驗證了方法的準確度和精密度，通過測定英國FAPAS能力驗證樣品進一步證實了該方法的可靠性。以內標法定量，降低了實驗操作過程中的損失，提高了方法的準確度和靈敏度，為該法廣泛運用在工業(yè)生產的質量控制體系奠定了基礎。目前，市場上食品中氯丙醇酯污染事件頻發(fā)，我國對此類問題十分重視，相關檢測方法的研究取得一定進展，各地食品安全風險監(jiān)測項目的開展也為制定標準方法提供大量基礎數據。但現有檢測方法還存在缺陷，例如前處理步驟復雜、試劑消耗量大且易引起測定結果偏差、測定氯丙醇酯種類單一等，因此今后工作需進一步優(yōu)化前處理方法，包括提取、水解、凈化、衍生等，此外還需要將另兩種氯丙醇酯，1，3-DCP酯和2，3-DCP酯一并列入未來研究計劃中。