日本沼蝦核糖體蛋白S3a基因cDNA的克隆、表達及其在卵巢發(fā)育中的功能初探

李屹錚，張帥帥，劉雪巍，張 冉，林鑫輝，張 猛，王 磊，于 淼，喬志剛，江紅霞

(河南師范大學水產(chǎn)學院，河南省水產(chǎn)動物養(yǎng)殖工程技術研究中心，水產(chǎn)動物疾病控制河南省工程實驗室，河南新鄉(xiāng)453007)

日本沼蝦(Macrobrachiumnipponense)廣泛分布于中國、日本及越南等東南亞國家淡水水域，具有較高的經(jīng)濟價值，是我國重要的淡水養(yǎng)殖甲殼動物。近些年來，由于日本沼蝦自然資源銳減，集約化人工養(yǎng)殖被大力發(fā)展，然而隨著人工養(yǎng)殖規(guī)模持續(xù)增加，日本沼蝦出現(xiàn)了性早熟、個體小、商品率低等種質(zhì)退化現(xiàn)象，嚴重制約了日本沼蝦養(yǎng)殖業(yè)持續(xù)健康發(fā)展[1]。因此，研究日本沼蝦性腺發(fā)育規(guī)律，對其性腺尤其是卵巢發(fā)育進行人工調(diào)控，是對其進行人工繁殖和育種，改良其種質(zhì)的基礎。目前，眼柄摘除法是廣泛應用的水產(chǎn)甲殼動物卵巢促熟的常規(guī)方法[2,3]，但是眼柄摘除也會危害甲殼動物生長，縮短其蛻皮周期，增加能量需求，降低卵子質(zhì)量，并使其死亡率升高[4]，因此，尋找新的人工調(diào)控甲殼動物卵巢發(fā)育的方法勢在必行。而從分子水平上尋找甲殼動物卵巢發(fā)育相關基因，通過調(diào)控這些基因表達來促進或抑制其卵巢發(fā)育已成為該研究領域的發(fā)展趨勢。

核糖體蛋白(ribosomal protein,RP)家族是核糖體的結構蛋白，在生物體蛋白合成中具有極其重要的作用。核糖體蛋白S3a(RPS3a)是真核細胞核糖體蛋白40S小亞基組分，在40S亞基與起始因子和mRNA結合以及80S亞基與延伸因子結合中起重要作用，參與翻譯、DNA修復和細胞凋亡[5,6]。此外，RPS3a蛋白被證實還具有調(diào)節(jié)生物體卵巢發(fā)育作用，例如，研究發(fā)現(xiàn)當RPS3a基因表達被反義基因抑制時，黑腹果蠅(Drosophilamelanogaster)卵巢發(fā)育受到抑制，并導致其產(chǎn)卵失敗[7]；RPS3a基因在岡比亞按蚊(Anophelesgambiae)卵巢中高表達，并在其卵子發(fā)生過程中表達上調(diào)[8]；沉默RPS3a基因表達會阻止非滯育期淡色庫蚊(Culexpipiens)的卵巢發(fā)育，并使其進入滯育狀態(tài)[9]；用墨吉對蝦(Fenneropenaeusmerguiensis)重組RPS3a蛋白孵育其卵巢外植體會刺激卵巢發(fā)育相關基因-蝦卵巢圍食膜因子(SOP)和翻譯控制腫瘤蛋白(TCTP)基因表達[10]：另外，RPS3a也是雜交長白母豬(Susscrofadomestica)卵母細胞發(fā)育相關基因，它在其卵母細胞體外成熟過程中表達下調(diào)[11]。但迄今為止，對日本沼蝦卵巢RPS3a基因的研究尚未見報道。

大量的研究表明，在甲殼動物中，5-羥色胺(5-HT)和多巴胺(DA)可以通過其X-器官竇腺系統(tǒng)神經(jīng)激素合成和釋放來調(diào)控它們的卵巢發(fā)育[12-14]，但關于5-HT和DA對日本沼蝦卵巢發(fā)育作用的研究迄今為止也未見相關報道。本研究克隆得到了日本沼蝦RPS3a基因的cDNA全長序列，命名為MnRPS3a基因，并分析了該基因的序列特征及其在日本沼蝦不同組織和不同發(fā)育階段卵巢中的表達模式。為了進一步研究MnRPS3a基因在日本沼蝦卵巢發(fā)育中的作用，本研究還檢測了日本沼蝦注射5-HT和DA后其卵巢中MnRPS3a和卵黃蛋白原(Vg)基因的表達變化，最后還進行了MnRPS3a蛋白在日本沼蝦不同發(fā)育階段卵巢中的定位分析。本研究旨在為理解甲殼類動物RPS3a基因在其卵巢發(fā)育中的作用，從而在分子水平上尋找人工調(diào)控甲殼動物卵巢發(fā)育的新方法提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 日本沼蝦不同組織和不同發(fā)育階段卵巢組織的采集

本實驗中所用日本沼蝦購自新鄉(xiāng)市水產(chǎn)品市場，體長為(4.5±0.5) cm，體重為(3.5±1.0) g，暫養(yǎng)于河南師范大學水產(chǎn)養(yǎng)殖基地，養(yǎng)殖水溫25～30 ℃，每天早晚各投喂商品飼料1次，1周換水1次。挑選卵巢發(fā)育處于Ⅰ期的健康雌蝦，冰浴麻醉，采集其不同組織(眼柄、胃、卵巢、肝胰腺、鰓和肌肉)。挑選卵巢發(fā)育處于不同發(fā)育階段的健康雌蝦，冰浴麻醉，采集其不同發(fā)育階段(Ⅰ-Ⅵ期)的卵巢組織(Ⅰ期：卵原細胞增殖期；Ⅱ期：卵黃發(fā)生前期；Ⅲ期：初級卵黃發(fā)生期；Ⅳ期：次級卵黃發(fā)生期；Ⅴ期：成熟期；Ⅵ期：衰退期)樣品。每種實驗樣品均采集5個生物學重復，樣品獲取后立即放入液氮中保存，以備后續(xù)RNA提取。

1.1.2 5-HT和DA刺激實驗中日本沼蝦卵巢組織的采集

將大小均一、卵巢發(fā)育處于Ⅲ期的健康日本沼蝦(4.5±0.5 cm,3.5±1.0 g)分為3組，2個實驗組和1個對照組。2個實驗組分別肌肉注射5-HT(Sigma，美國)和DA(Sigma，美國)，注射量為50 μg/g體重，對照組注射相同體積的PBS，分別在注射后的0、12、24、48、72和96 h，每組隨機選取5尾蝦，取其卵巢組織樣品，立即放入液氮中保存，以備后續(xù)RNA提取。

1.2 總RNA提取

按照total RNA kit Ⅱ(Omega Bio-Tek，美國)說明，分別提取日本沼蝦不同組織、不同發(fā)育階段的卵巢組織、以及注射5-HT和DA后不同時間點的卵巢組織樣品總RNA。RNA的完整性用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，濃度及純度用NanoDrop 2000超微分光光度計(Thermo，美國)檢測。

1.3 cDNA合成

使用PrimeScriptTMⅡ1st Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒(TaKaRa，大連)，以日本沼蝦卵巢組織總RNA為模板反轉(zhuǎn)錄cDNA，-20 ℃保存，以備MnRPS3a核心片段的克隆。另取卵巢總RNA，使用SMARTer RACE 5′/3′Kit(TaKaRa，大連)試劑盒，分別合成5′和3′RACE-ready cDNA，以備MnRPS3a5′和3′兩端片段的克隆。遵循Prime Script@RT reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa，大連)試劑盒的說明對日本沼蝦各樣品RNA進行反轉(zhuǎn)錄，生成的cDNA以備實時熒光定量PCR(qRT-PCR)實驗進行。

1.4 MnRPS3a基因cDNA克隆

根據(jù)本實驗室日本沼蝦卵巢轉(zhuǎn)錄組測序(NCBI SRA登錄號：SRP063589)得到的MnRPS3a基因片段，用Primer 5.0軟件設計MnRPS3a中間核心片段引物(表1)，通過PCR擴增獲得MnRPS3a核心片段，經(jīng)純化、克隆后送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序。根據(jù)獲得的核心片段序列設計特異性引物(表1)用于5′和3′端擴增。5′和3′端RACE-PCR反應體系和反應程序按SMARTer RACE 5′/3′ Kit(TaKaRa，大連)試劑盒說明設置。擴增產(chǎn)物經(jīng)過純化、克隆，送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序，獲得的5′和3′端序列與中間核心片段序列拼接后得到MnRPS3a全長cDNA序列。

1.5 MnRPS3a生物信息學分析

使用NCBI網(wǎng)站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/orfig.cgi)確定基因的開放閱讀框；使用在線網(wǎng)站http://www.expasy.org/tools/推測翻譯的蛋白質(zhì)分子式、分子量及等電點，并分析其三級結構；利用在線網(wǎng)站http://www.dabi.temple.edu/disphos/和http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/分別預測蛋白磷酸化和糖基化位點；利用PSORTII(http://psort.nibb.ac.jp/)預測核定位信號；使用NCBI網(wǎng)站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)分析各物種RPS3a氨基酸序列相似性；利用Clustal X2進行氨基酸序列多重比對；利用MEGA 5.0以鄰接(NJ)法構建系統(tǒng)進化樹。

1.6 基因表達分析

MnRPS3a基因在日本沼蝦不同組織和不同發(fā)育階段卵巢組織中的表達，以及注射5-HT和DA后不同時間點卵巢組織中的MnRPS3a和Vg基因表達均利用qRT-PCR法進行。以反轉(zhuǎn)錄cDNA為模板，使用LightCycler 96(Roche，瑞士)進行基因qRT-PCR分析，反應體系(10 μL)為：TB Green Premix Ex Taq Ⅱ(TliRNaseH Plus)(2×) 5 μL、正反向引物(10 μmol/L)各0.4 μL、DNA模板1 μL、ddH2O 3.2 μL。qRT-PCR條件為：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s、60 ℃ 20 s、40個循環(huán)；95 ℃ 10 s、65 ℃ 60 s、97 ℃ 1 s；37 ℃ 30 s。以β-actin為內(nèi)參基因，每個樣品設置5個生物學重復和3個技術重復。qRT-PCR過程中所用的各引物序列見表1。基因的相對表達量運用2-△△CT法進行計算，數(shù)據(jù)以平均值±標準差(Means±SD)表示，使用SPSS 20.0軟件和Duncan法進行顯著性分析和多重比較分析，P<0.05表示差異顯著。

表1 日本沼蝦MnRPS3a引物序列Tab.1 Primer sequences of MnRPS3a gene

1.7 MnRPS3a蛋白在日本沼蝦卵巢組織中的定位

解剖獲取成蝦Ⅰ-Ⅴ期卵巢組織，PBS洗滌后，在4%的多聚甲醛中固定24 h，使用梯度酒精脫水和二甲苯逐級透明后用石蠟包埋，制作成4 μm厚的石蠟切片。對一部分切片進行HE染色，用以觀察不同時期卵巢的發(fā)育階段。未經(jīng)HE染色的切片利用免疫熒光(IF)技術進行MnRPS3a蛋白在日本沼蝦卵巢組織中的定位分析，將切片常規(guī)脫蠟后置于EDTA抗原修復液中，高火加熱8 min至沸騰，室溫冷卻8 min后，中高火再加熱8 min，再自然冷卻至室溫；滴加山羊血清封閉液(原液用PBS按1∶9稀釋)，37 ℃孵育30 min。滴加1∶100稀釋的兔多克隆抗體一抗(Cat:GTX124922，Proteintech，美國)，4 ℃過夜。然后37 ℃復溫30 min，PBS洗 5 min×3次；滴加DyLight 488熒光素標記羊抗兔IgG二抗(Cat:A23220，Abbkine，美國)，稀釋比例為1∶100，37 ℃ 孵育45 min。PBS洗5 min×3次；滴加DAPI染色液，室溫孵育3 min。PBS清洗，抗熒光淬滅封片劑封片后，用熒光顯微鏡觀察結果并拍照。

2 結果

2.1 MnRPS3a基因cDNA全長和氨基酸序列分析

MnRPS3a基因cDNA序列(圖1)全長902 bp，5′端非編碼區(qū)53 bp，3′端非編碼區(qū)48 bp，開放閱讀框(ORF區(qū))801 bp，編碼266個氨基酸(AA)。MnRPS3a氨基酸序列含有5個磷酸化位點和3個糖基化位點，在其C端有一個核定位信號“KKGLNKAGKKGSKKK”。推測MnRPS3a蛋白分子質(zhì)量為30.06 kDa，理論等電點為9.78。該基因序列已提交至GenBank，獲得序列號為：MK575884。

圖1 MnRPS3a基因全長cDNA序列及其所編碼的氨基酸(AA)序列Fig.1 cDNA sequence and amino acid sequence of RPS3a gene of M.nipponense下劃線指示ORF區(qū)的起始密碼子(ATG)和終止密碼子(TAA)，灰色背景部分為poly A加尾信號(AATAAA)，黑色三角(▲)指示預測的磷酸化位點，“*”指示預測的糖基化位點，虛線指示核定位信號。

2.2 MnRPS3a氨基酸序列同源性比較及系統(tǒng)進化分析

將MnRPS3a氨基酸序列與其它物種RPS3a氨基酸序列進行相似性分析，結果顯示，MnRPS3a與其它比對物種RPS3a序列相似性介于63%～86%之間，并與墨吉對蝦RPS3a氨基酸序列相似性最高，達到85.71%。利用Clustal X2軟件將MnRPS3a氨基酸序列與其它無脊椎動物RPS3a氨基酸序列進行多重比對，結果(圖2)顯示，各無脊椎動物RPS3a氨基酸序列的C端均具有一個核定位信號。利用Expasy在線軟件預測了MnRPS3a蛋白的三維結構，該蛋白含有34.21% α-螺旋，18.42% β-折疊和47.37%無規(guī)則卷曲(圖3)，比對的其他無脊椎動物同樣具有這些α-螺旋和β-折疊結構(圖2)。利用MEGA5.0軟件構建各物種RPS3a蛋白系統(tǒng)進化樹(圖4)，顯示日本沼蝦RPS3a與同屬于甲殼動物的墨吉對蝦RPS3a在進化樹中聚為一支，親緣關系最近。

圖2 MnRPS3a與其它無脊椎動物RPS3a氨基酸序列多重比對Fig.2 Multiple comparison of RPS3a amino acid sequences between M.nipponense and other invertebrates使用Clustal X2進行多重序列比對，橙色框內(nèi)為核定位信號，紅色框內(nèi)為α-螺旋區(qū)，藍色框內(nèi)為β-折疊區(qū)，各無脊椎動物RPS3a NCBI登錄號見圖4。

圖3 MnRPS3a蛋白三級結構預測Fig.3 Prediction of tertiary structure of MnRPS3a protein

圖4 各物種RPS3a系統(tǒng)進化樹Fig.4 NJ phylogenetic tree based on RPS3a amino acid sequences of various organisms

2.3 MnRPS3a基因的組織表達

MnRPS3a基因在Ⅰ期卵巢日本沼蝦不同組織中的表達水平見圖5。結果顯示，MnRPS3a基因在所測組織中均有表達，其在肌肉中表達量最高，并且顯著高于其它各組織，其在胃中的表達量最低，但其在卵巢組織中的表達量與眼柄、肝胰腺和鰓相比并無顯著差異。

2.4 MnRPS3a基因在不同發(fā)育階段卵巢組織中的表達

MnRPS3a基因在日本沼蝦不同發(fā)育階段卵巢組織中的表達結果(圖6)顯示，該基因表達量隨著卵巢的發(fā)育呈現(xiàn)出逐漸降低的趨勢。該基因在Ⅰ期卵巢中的表達量最高，且顯著高于其它各期卵巢，其次是Ⅱ和Ⅲ期卵巢，Ⅱ期和Ⅲ期卵巢中的表達量顯著高于Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ期卵巢，Ⅵ期卵巢中MnRPS3a基因表達量最低。

圖5 MnRPS3a基因在Ⅰ期卵巢的日本沼蝦不同組織中的表達特征Fig.5 MnRPS3a gene expression in different tissues of M.nipponense with stage Ⅰ ovary E：眼柄；S：胃；H：肝胰腺；O：卵巢；G：鰓；M：肌肉；不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下圖同。

2.5 5-HT和DA刺激對卵巢組織中MnRPS3a與Vg基因表達的影響

如圖7A所示，注射5-HT 24 h后，MnRPS3a表達量與對照組相比顯著增加，注射5-HT 48、72和96 h后，MnRPS3a表達量與對照組相比極顯著增加。整體來看，注射5-HT后，卵巢中MnRPS3a表達量呈逐漸上升趨勢；注射DA 48 h后，MnRPS3a在日本沼蝦卵巢中的表達量與對照組相比極顯著降低(P<0.01)，注射DA 72和96 h后，MnRPS3a表達量與對照組相比顯著降低。5-HT和DA注射后Vg基因表達變化見圖7B。注射5-HT 48 h后，Vg基因表達量與對照組相比顯著增加，注射5-HT 72和96 h后，Vg基因表達量與對照組相比極顯著增加。整體來看，注射5-HT后，卵巢中Vg基因表達量與MnRPS3a表達量一致，也呈現(xiàn)出逐漸上升的趨勢；注射DA 72和96 h后，Vg基因表達量與對照組相比分別顯著和極顯著降低。

圖6 MnRPS3a基因在日本沼蝦不同發(fā)育階段的卵巢中的表達特征Fig.6.MnRPS3a gene expression in different ovarian development stages of M.nipponenseⅠ：Ⅰ期卵巢；Ⅱ：Ⅱ期卵巢；Ⅲ：Ⅲ期卵巢；Ⅳ：Ⅳ期卵巢；Ⅴ：Ⅴ期卵巢；Ⅵ：Ⅵ期卵巢。

圖7 注射5-HT和DA后MnRPS3a(A)和Vg(B)基因在日本沼蝦卵巢中的相對表達量Fig.7 Relative expression levels of MnRPS3a(A) and Vg(B) genes in ovary after M.nipponense were injected with 5-HT and DA“*”表示顯著性差異(P<0.05)，“**”表示極顯著性差異(P<0.01)。

2.6 MnRPS3a蛋白在日本沼蝦卵巢組織中的定位

HE染色及IF檢測結果(圖8)顯示，日本沼蝦Ⅰ期卵巢中大部分為卵原細胞，少部分為卵黃生成前期卵母細胞(圖8-a)，Ⅱ期卵巢中主要為卵黃生成前期卵母細胞(圖8-b)，Ⅰ期和Ⅱ期卵巢的卵原細胞和卵母細胞中均無MnRPS3a蛋白合成信號，而它們周圍的濾泡細胞中顯示出MnRPS3a蛋白的高活性合成信號(圖8-f，8-g)；Ⅲ期卵巢中主要為卵黃生成期卵母細胞，卵黃顆粒位于卵母細胞細胞質(zhì)的外圍(圖8-c)，而在卵黃顆粒生成的部位即卵母細胞細胞質(zhì)的外圍顯示出MnRPS3a蛋白的高活性合成信號(圖8-h)；Ⅳ期卵巢中主要為卵黃生成后期卵母細胞，卵黃顆粒幾乎遍布整個卵母細胞的細胞質(zhì)(圖8-d)，MnRPS3a蛋白的合成信號也遍布Ⅳ期卵巢卵母細胞的細胞質(zhì)，但合成信號較弱(圖8-i)；Ⅴ期卵巢中主要為成熟期的卵母細胞，卵黃顆粒也幾乎布滿整個卵母細胞的細胞質(zhì)(圖8-e)，但整個細胞中都沒有檢測到MnRPS3a蛋白的合成信號(圖8-j)。

圖8 卵巢組織切片觀察及Ⅰ-Ⅴ期卵巢中MnRPS3a蛋白定位的IF檢測Fig.8 Observation of ovarian tissue sections and IF detection of MnRPS3a protein localization in ovaries at stage Ⅰ-Ⅴ

3 討論

了解與性腺發(fā)育相關基因的功能與作用對于控制日本沼蝦的生殖發(fā)育至關重要。一些報道表明核糖體蛋白基因在生物體的卵巢發(fā)育中具有重要作用，例如小鼠(Musmusculus)卵母細胞中Rps26基因敲除會導致卵泡從竇前卵泡到竇卵泡的發(fā)育遲緩，最后導致卵母細胞死亡和卵巢早衰[15]；褐稻虱(Nilaparvatalugens)RPL5基因被RNA干擾后阻滯了其卵巢發(fā)育，并減少了其產(chǎn)卵量[16]；用墨吉對蝦重組RPL10a蛋白孵育其卵巢外植體會刺激卵巢成熟相關基因表達[17]，且墨吉對蝦活體注射重組RPL10a蛋白后會促進其卵黃生成和早期卵巢發(fā)育[18]；RPL24基因在日本沼蝦卵巢早期發(fā)育階段高表達，該基因表達被RNAi沉默后其卵巢發(fā)育被延遲，產(chǎn)卵率下降[19]，克氏原螯蝦RPS24基因在其Ⅰ期卵巢中的表達量最高，其次是Ⅱ期和Ⅳ期卵巢，可能與其卵原細胞分化和卵母細胞成熟分裂的啟動有關[20]。為進一步研究核糖體蛋白家族基因?qū)θ毡菊游r卵巢發(fā)育的作用，本研究從日本沼蝦卵巢中克隆得到了MnRPS3a基因，并對其功能進行了初步的探究。

3.1 MnRPS3a基因序列與系統(tǒng)進化分析

本研究中，MnRPS3a基因以及其他無脊椎動物RPS3a基因所編碼的氨基酸序列的C端均具有一個核定位信號。以往的研究表明墨吉對蝦RPL10a[17]和日本沼蝦RPL24[19]氨基酸序列中也具有核定位信號，說明這些核糖體蛋白均是在細胞質(zhì)中合成，然后在核定位信號的指引下進入細胞核的核仁處與rRNA一起進行組裝，裝配形成的核糖體再從細胞核的核孔進入細胞質(zhì)中發(fā)揮作用，這與它們作為一種核糖體的結構蛋白而參與蛋白質(zhì)生物合成的基本作用是一致的。將MnRPS3a與其他生物RPS3a氨基酸序列進行比對和系統(tǒng)進化分析，發(fā)現(xiàn)它與同為十足目甲殼動物墨吉對蝦RPS3a氨基酸序列相似性最高，親緣關系也最近，并在進化樹上與無脊椎動物RPS3a聚于一支，這些研究結果都與日本沼蝦的分類地位相一致。

3.2 MnRPS3a基因表達分析

核糖體蛋白基因轉(zhuǎn)錄在機體的各組織中廣泛分布。在無脊椎動物的研究中，褐稻虱RPL5基因[16]和日本沼蝦RPL24基因[19]在所檢測的各種組織中均有表達，但均在卵巢組織中表達量最高。本研究中，MnRPS3a基因也在所檢測的日本沼蝦的8個組織中均有分布，這與以上研究結果一致，說明這些核糖體蛋白基因為非組織特異性基因。但在本研究中，MnRPS3a基因在日本沼蝦肌肉組織中的表達量最高，然后是肝胰腺，再次為卵巢，這又與以上研究結果不一致，說明不同的核糖體蛋白在不同物種的組織分布具有一定的差異性。在不同發(fā)育階段的卵巢組織中，MnRPS3a在Ⅰ期卵巢中的表達量最高，并隨著卵巢發(fā)育其表達量逐漸降低，說明該基因在日本沼蝦早期卵巢發(fā)育階段起較大作用。研究表明墨吉對蝦RPS3a[10]、日本沼蝦RPL24[19]和克氏原螯蝦(Procambrusclarkii)RPS24基因[20]均在卵巢發(fā)育的早期階段高表達，在卵巢發(fā)育晚期階段表達量較低。本研究結果與以上研究結果一致，推測MnRPS3a蛋白可能與墨吉對蝦RPS3a、日本沼蝦RPL24和克氏原螯蝦RPS24蛋白一樣，是一種早期卵巢發(fā)育的刺激因子。

3.3 MnRPS3a基因的功能分析

研究表明，5-HT和DA對甲殼動物卵巢發(fā)育具有重要的作用。例如，5-HT會促進淡水蟹Travancorianaschirnerae、BarytelphusaGuerini和克氏原螯蝦的卵巢發(fā)育，而DA則會抑制它們的卵巢發(fā)育[12-14]。甲殼動物卵巢發(fā)育過程伴隨著卵黃的不斷生成，卵黃不僅是卵子的重要結構成分，還是甲殼動物胚胎發(fā)育的重要能量和營養(yǎng)來源。甲殼動物卵黃的主要成分為卵黃蛋白(Vn)，其前體為卵黃蛋白原(Vg)。甲殼動物Vg合成的位置存在爭議，一種認為Vg是由卵巢以外的器官(肝胰腺和脂肪體等)合成，然后通過卵黃蛋白原受體(Vgr)介導的內(nèi)吞作用從血淋巴帶入卵母細胞[21,22]，還有一種認為Vg是在卵巢內(nèi)產(chǎn)生的[23,24]。然而，也有研究表明，日本沼蝦[2]和克氏原螯蝦[25]等的肝胰腺和卵巢都是Vg的合成部位。本研究中，日本沼蝦注射5-HT后24～96 h的卵巢中MnRPS3a表達量和注射5-HT后48～96 h的Vg基因表達量與對照組相比顯著升高；而在注射DA后48～96 h的卵巢中MnRPS3a的表達量和注射DA后72～96 h的Vg基因表達量與對照組相比顯著降低。由于隨著5-HT和DA注射后卵巢中MnRPS3a基因表達升高和降低，Vg基因的表達量也升高和降低，推測MnRPS3a可能通過調(diào)控Vg的合成而參與日本沼蝦卵黃的生成作用，從而在其卵巢發(fā)育過程中起重要作用。

本研究IF檢測結果也表明MnRPS3a蛋白可能參與卵黃顆粒的形成。研究表明，濾泡細胞參與無脊椎動物卵巢發(fā)育過程中多種蛋白的合成并轉(zhuǎn)運至卵母細胞[26-28]。本研究中Ⅰ和Ⅱ期卵巢組織濾泡細胞中有很強的MnRPS3a蛋白合成信號，這可能是由于Ⅰ和Ⅱ期卵巢組織分別主要由卵原細胞和卵黃生成前期卵母細胞組成，卵黃顆粒尚未生成，這時在濾泡細胞中大量合成MnRPS3a蛋白，然后再轉(zhuǎn)運入卵母細胞，從而為隨后卵母細胞中卵黃顆粒蛋白的形成需要大量的核糖體做準備；對泥蚶(Tegillarcagranosa)[29]和糙海參(Holothuriascabra)[30]的卵母細胞超微結構研究表明，卵黃生成期的卵母細胞細胞質(zhì)中的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體、線粒體、核糖體等多種細胞器參與卵黃的合成，且核糖體密集分布在胞質(zhì)中。而MnRPS3a蛋白合成信號定位于Ⅲ期卵巢卵母細胞細胞質(zhì)的外周和Ⅳ期卵巢卵母細胞的整個細胞質(zhì)中，即定位于這兩期卵巢中的卵母細胞的卵黃顆粒的生成部位，由此推測MnRPS3a蛋白可能用于合成大量的核糖體從而參與卵黃顆粒蛋白的生成；Ⅴ期卵巢中卵母細胞已完全成熟，不再需要卵黃顆粒的生成，同時MnRPS3a蛋白的合成信號也消失。本研究中，MnRPS3a蛋白的合成信號基本上是隨著卵巢從Ⅰ期到Ⅴ期的發(fā)育由強逐漸變?nèi)酰@與MnRPS3a基因在日本沼蝦不同發(fā)育階段的卵巢中的表達特征基本一致。但日本沼蝦MnRPS3a蛋白與卵巢中卵黃的生成有關的推測還需進一步的研究驗證。

4 結論

綜上所述，本研究克隆得到了日本沼蝦MnRPS3a基因的全長cDNA序列，通過其表達分析和蛋白的定位分析，推測MnRPS3a基因可能直接或間接參與日本沼蝦卵巢中卵黃的生成從而對其卵巢發(fā)育進行調(diào)控，并在其早期卵巢發(fā)育階段起重要的作用，但其具體作用的分子機制還需進一步的研究確定。