亞甲基藍(lán)對(duì)羅氏沼蝦組織結(jié)構(gòu)、抗氧化系統(tǒng)及免疫能力的影響

敖士齊，翟 乾，紀(jì) 鵬，高煒?lè)?，?杰，張曉君，高曉建，姜 群

(揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州 225009)

亞甲基藍(lán)又名次甲基藍(lán)、美藍(lán)，是一種人工合成的噻嗪類染料，作為孔雀石綠、硝基呋喃等禁藥的替代品被廣泛使用[1]，可以有效控制水產(chǎn)養(yǎng)殖中的爛鰓病、水霉病、紅嘴病、小瓜蟲病等常見疾病。與孔雀石綠相比，亞甲基藍(lán)的毒性較低，但是，近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，亞甲基藍(lán)及其代謝物存在一定的毒副作用。例如，亞甲基藍(lán)可導(dǎo)致神仙魚(Symphysodonaequfasciatus)[2]、孔雀魚(Poeciliareticulate)[3]、凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeusvannamei)[4]死亡，誘發(fā)天使魚(Pterophyllumscalare)魚鰾畸形[5]，損傷斑馬魚(Daniorerio)DNA結(jié)構(gòu)[6]，對(duì)羅非魚(Oreochromismossambicus)造成應(yīng)激現(xiàn)象[7]，對(duì)凡納濱對(duì)蝦腸道、肝胰腺組織造成病理?yè)p害[8]等。目前，歐盟、美國(guó)等國(guó)家和地區(qū)已經(jīng)禁止亞甲基藍(lán)在食品動(dòng)物生產(chǎn)中使用[9]，國(guó)內(nèi)尚無(wú)相關(guān)法律和政策，水產(chǎn)養(yǎng)殖中亞甲基藍(lán)的使用缺乏有效的管理。

羅氏沼蝦(Macrobrachiurosenbergii)是我國(guó)重要的水產(chǎn)養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)物種，具有生長(zhǎng)快、個(gè)體大、食性廣、易馴養(yǎng)、適應(yīng)性強(qiáng)、生產(chǎn)周期短等優(yōu)點(diǎn)[10]。隨著羅氏沼蝦養(yǎng)殖密度和養(yǎng)殖規(guī)模的日益擴(kuò)大，亞甲基藍(lán)等水產(chǎn)消毒劑的使用已不可避免，鑒于亞甲基藍(lán)的過(guò)量使用可對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物產(chǎn)生毒副作用，了解亞甲基藍(lán)對(duì)羅氏沼蝦的毒性效應(yīng)，對(duì)于優(yōu)化養(yǎng)殖生產(chǎn)中的使用劑量具有重要的實(shí)踐意義。本研究采用半靜水式方法開展急性毒性實(shí)驗(yàn)，探究亞甲基藍(lán)對(duì)羅氏沼蝦的半致死濃度和安全濃度，并將羅氏沼蝦暴露于濃度為1/2 96 h LC50的亞甲基藍(lán)4 d，后轉(zhuǎn)移至清水養(yǎng)殖7 d，分析亞甲基藍(lán)對(duì)羅氏沼蝦組織結(jié)構(gòu)、抗氧化系統(tǒng)及免疫能力的影響及可逆性，以期為羅氏沼蝦的規(guī)范養(yǎng)殖和安全用藥提供依據(jù)，并為亞甲基藍(lán)對(duì)甲殼動(dòng)物的毒性評(píng)價(jià)提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與樣品收集

實(shí)驗(yàn)所用羅氏沼蝦來(lái)自揚(yáng)州富源水產(chǎn)有限公司，個(gè)體健康、活力良好。隨機(jī)選取體長(zhǎng)為(3.5±0.5)cm的羅氏沼蝦放入100 L的水族缸暫養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)用水為充分曝氣24 h的自來(lái)水，水溫為(25±1)℃，每日清理食物殘?jiān)c糞便，日投喂兩次商品化飼料，暫養(yǎng)7 d后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)前1 d停止投喂，采用半靜水式方法開展急性毒性實(shí)驗(yàn)，每日更換藥液1次，日換水量50%。實(shí)驗(yàn)選用分析純亞甲基藍(lán)(含量98.5%，福晨化學(xué)實(shí)劑有限公司)，使用蒸餾水將其配置為500 mg/L濃度的母液備用，設(shè)計(jì)6個(gè)亞甲基藍(lán)濃度梯度(3.125、6.25、12.5、25、50和100 mg/L)和一個(gè)空白對(duì)照組，每組設(shè)置三個(gè)平行，每個(gè)平行組隨機(jī)放入20尾羅氏沼蝦，每日統(tǒng)計(jì)并且記錄各組羅氏沼蝦存活情況，急性毒性實(shí)驗(yàn)持續(xù)96 h。數(shù)據(jù)采用Excel2016處理，通過(guò)濃度對(duì)數(shù)—死亡率線型回歸方程，計(jì)算亞甲基藍(lán)對(duì)羅氏沼蝦的24、48、72和96 h的半致死濃度。采用特倫堡(Turubell)公式計(jì)算實(shí)驗(yàn)藥品的安全濃度(SC)[11]，SC=48 h LC50×0.3/(24 h LC50/48 h LC50)2。

為進(jìn)一步探究亞甲基藍(lán)對(duì)羅氏沼蝦的毒性效應(yīng)，將羅氏沼蝦暴露于濃度為1/2 96 h LC50的亞甲基藍(lán)4 d，去除亞甲基藍(lán)后清水養(yǎng)殖7 d，暴露實(shí)驗(yàn)期間每日更換藥液1次，日換水量50%，不含亞甲基藍(lán)的清水養(yǎng)殖組為對(duì)照組，每組60尾羅氏沼蝦。于實(shí)驗(yàn)的第0、1、2、4、7和11 d取樣，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取6尾蝦，解剖獲得羅氏沼蝦的肝胰腺、腸道和鰓組織，每尾樣品取部分組織采用Bouin’s溶液固定，用于組織病理?yè)p傷研究，剩余組織樣品液氮冷凍后于-80 ℃保存，用于酶活、基因表達(dá)分析。

1.2 組織病理?yè)p傷評(píng)估

經(jīng)Bouin’s溶液固定48 h的肝胰腺、腸道和鰓組織，轉(zhuǎn)入濃度為75%的乙醇中保存。通過(guò)梯度酒精濃度脫水處理后，用石蠟包埋，石蠟切片機(jī)制片，蘇木精-伊紅(HE)染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察并描述，拍攝主要病變部位。

1.3 生化指標(biāo)測(cè)定

取-80 ℃保存的肝胰腺組織約100 mg，按比例加入生理鹽水，采用電動(dòng)勻漿儀充分勻漿，按照南京建成生物工程公司試劑盒說(shuō)明書，用酶標(biāo)儀進(jìn)行吸光度檢測(cè)，計(jì)算肝胰腺組織中丙二醛(MDA)和過(guò)氧化物(H2O2)含量，計(jì)算超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過(guò)氧化物(GSH-Px)、堿性磷酸酶(AKP)和酸性磷酸酶(ACP)的活性，評(píng)價(jià)亞甲基藍(lán)對(duì)羅氏沼蝦抗氧化系統(tǒng)和免疫因子的影響。

1.4 基因表達(dá)水平測(cè)定

取-80 ℃保存的肝胰腺組織約100 mg，液氮研磨后，采用Trizol法提取總RNA，采用1×TAE配置1%瓊脂糖凝膠，與6×Loading buffer混合后上樣，根據(jù)28 S和18 S條帶完整性判斷RNA質(zhì)量。另取1 μL RNA用超微量紫外可見分光光度計(jì)(NanoReady Touch)檢測(cè)RNA 濃度，采用HiScript III RT SuperMix for qPCR試劑盒(南京諾唯贊生物科技有限公司)完成反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。本次實(shí)驗(yàn)中所用引物均使用Primer Premier 6.0軟件設(shè)計(jì)，引物序列信息見表1，以β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)和延伸因子-1α(Elongationfactors-1α,EF1α)基因作為內(nèi)參，目標(biāo)基因?yàn)闊嵝菘说鞍?Heatshockprotei,HSP)、酚氧化酶原(Prophenoloxidase,proPO)、TOLL樣受體(Toll-likereceptors,TLR)、凝集素(Lectin,LEC)，采用GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ試劑盒進(jìn)行熒光定量PCR(qRT-PCR)反應(yīng)，反應(yīng)體系為：SYBR qPCR Master Mix 10 μL，上下游引物0.4 μL，cDNA 1 μL，用去離子水補(bǔ)足至20 μL，反應(yīng)條件為：預(yù)變性95 ℃ 30 s，變性95 ℃ 10 s，延伸60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)，所得到的結(jié)果采用2-ΔΔt法計(jì)算免疫基因的相對(duì)表達(dá)水平。

1.5 數(shù)據(jù)處理

免疫基因mRNA表達(dá)量及酶活數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，采用Levene法進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，滿足方差齊性的條件下采用SPSS Statistics 22軟件進(jìn)行單因素方差分析，采用SNK法進(jìn)行組間多重比較，顯著性水平設(shè)為0.05。

2 結(jié)果

2.1 亞甲基藍(lán)對(duì)羅氏沼蝦的急性毒性

本實(shí)驗(yàn)以羅氏沼蝦出現(xiàn)沉底，觸摸無(wú)反應(yīng)且無(wú)心跳為死亡表征。研究發(fā)現(xiàn)，急性毒性實(shí)驗(yàn)期間，對(duì)照組未發(fā)生個(gè)體死亡現(xiàn)象，而不同濃度亞甲基藍(lán)暴露實(shí)驗(yàn)組，羅氏沼蝦出現(xiàn)不同水平的死亡現(xiàn)象。實(shí)驗(yàn)初期，低濃度亞甲基藍(lán)(3.125、6.25和12.5 mg/L)處理組中羅氏沼蝦體色正常，活力與對(duì)照組無(wú)明顯差異，高濃度組亞甲基藍(lán)(25、50和100 mg/L)處理組中羅氏沼蝦出現(xiàn)應(yīng)激現(xiàn)象，主要表現(xiàn)為無(wú)規(guī)則運(yùn)動(dòng)增強(qiáng)。隨著暴露時(shí)間的增加，羅氏沼蝦出現(xiàn)體色加深變藍(lán)，臥伏于水底等現(xiàn)象，直至死亡，死亡個(gè)體尾部肌肉泛藍(lán)，頭部發(fā)黑。亞甲基藍(lán)暴露導(dǎo)致的羅氏沼蝦死亡情況見圖1，相同藥物濃度脅迫下，羅氏沼蝦死亡率隨時(shí)間增加而升高，而同一時(shí)間點(diǎn)，亞甲基藍(lán)濃度越高羅氏沼蝦死亡率越高，亞甲基藍(lán)對(duì)羅氏沼蝦的毒性呈現(xiàn)明顯的劑量與時(shí)間效應(yīng)。通過(guò)濃度對(duì)數(shù)—死亡率線性回歸方程，計(jì)算得到亞甲基藍(lán)對(duì)羅氏沼蝦的24、48、72和96 h的半致死濃度分別為209.7、54.7、6.1和2.8 mg/L，安全濃度為1.1 mg/L。

2.2 亞甲基藍(lán)對(duì)羅氏沼蝦的組織病理?yè)p傷

2.2.1 肝胰腺組織病理變化

圖1 不同亞甲基藍(lán)濃度下羅氏沼蝦的死亡率Fig.1 Mortality rates of M.rosenbergiiexposed to different methylene blue concentrations

未經(jīng)亞甲基藍(lán)處理的羅氏沼蝦肝胰腺如圖2a所示，肝胰腺組織結(jié)構(gòu)清晰，肝胰腺小管基膜完整管腔呈星型，細(xì)胞界限清晰，B細(xì)胞分布在肝小管周圍多成馬蹄形，R細(xì)胞有儲(chǔ)存能量物質(zhì)的作用胞內(nèi)可見大小不等的轉(zhuǎn)運(yùn)泡，肝胰腺小管周圍存在少量結(jié)締組織所構(gòu)成的基膜。1.4 mg/L亞甲基藍(lán)暴露4 d的羅氏沼蝦與對(duì)照組相比，少量肝胰腺小管管壁變薄管腔擴(kuò)大刷狀緣消失，部分管腔嚴(yán)重變形呈不規(guī)則形狀，部分B細(xì)胞出現(xiàn)破裂，大量轉(zhuǎn)運(yùn)泡消失(圖2b)。去除亞甲基藍(lán)并在清水中恢復(fù)7 d后，肝胰腺組織結(jié)構(gòu)部分恢復(fù)，管腔出現(xiàn)刷狀緣，部分轉(zhuǎn)運(yùn)泡出現(xiàn)(圖2c)。

圖2 亞甲基藍(lán)暴露對(duì)羅氏沼蝦肝胰腺的組織病理?yè)p傷Fig.2 Histological structure of hepatopancreas tissue in M.rosenbergii following methylene blue exposure and decontamination

未經(jīng)亞甲基藍(lán)處理羅氏沼蝦鰓組織如圖3a所示，鰓組織中鰓絲排列整齊均勻，鰓絲上皮細(xì)胞以及次級(jí)層狀上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整形態(tài)正常，基部泌氯細(xì)胞致密均勻結(jié)構(gòu)完整。1.4 mg/L亞甲基藍(lán)暴露4 d后，羅氏沼蝦鰓絲頂端次級(jí)層狀上皮細(xì)胞出現(xiàn)腫大，鰓絲基部出現(xiàn)空泡和細(xì)胞裂解(圖3b)。去除亞甲基藍(lán)并在清水中恢復(fù)7 d后，鰓絲基部基本恢復(fù)，但鰓絲頂端次級(jí)層狀上皮細(xì)胞依然膨大，未恢復(fù)對(duì)照組水平(圖3c)。

2.2.3 腸道組織病理變化

未經(jīng)亞甲基藍(lán)處理羅氏沼蝦腸組織如圖4a所示，腸壁組織中黏膜層由排列緊密的柱狀上皮細(xì)胞構(gòu)成，上皮細(xì)胞向內(nèi)褶皺形成腸絨毛，腸絨毛表面模糊可見粘膜上皮，柱狀上皮細(xì)胞外側(cè)為環(huán)狀縱向肌層，最外側(cè)由漿膜包裹，組織整體未見明顯異常。1.4 mg/L亞甲基藍(lán)脅迫4 d后，腸壁變薄腸道萎縮，腸絨毛結(jié)構(gòu)消失，部分柱狀上皮細(xì)胞缺失(圖4b)。去除亞甲基藍(lán)并在清水中恢復(fù)7 d后，腸絨毛結(jié)構(gòu)消失癥狀仍然存在，柱狀上皮細(xì)胞部分缺失(圖4c)。

圖3 亞甲基藍(lán)暴露對(duì)羅氏沼蝦的鰓組織形態(tài)的影響Fig.3 Histological structure of gill tissue in M.rosenbergii following methylene blue exposure and decontamination a：對(duì)照組鰓組織；b：亞甲基藍(lán)處理第 4 d 鰓組織；c：轉(zhuǎn)移至清水第 7 d 鰓組織；CC：泌氯細(xì)胞；EC：上皮細(xì)胞；SL：次級(jí)層狀上皮細(xì)胞；▲：鰓絲基部損傷出現(xiàn)大量空泡；●：鰓絲基部基本恢復(fù)；★：鰓絲次級(jí)層狀上皮細(xì)胞腫大。

圖4 亞甲基藍(lán)暴露對(duì)羅氏沼蝦的腸組織形態(tài)的影響Fig.4 Histological structure of gut tissue in M.rosenbergii following methylene blue exposure and decontamination a：對(duì)照組腸道組織；b：亞甲基藍(lán)處理第4 d腸道組織；c：轉(zhuǎn)移至清水第7 d腸道組織；Ser：漿膜；Lum：腸道管腔；EPM：中腸柱狀上皮細(xì)胞；Msz：環(huán)狀縱向肌肉；▲：腸絨毛結(jié)構(gòu)消失；●：柱狀上皮細(xì)胞缺失。

2.3 亞甲基藍(lán)對(duì)羅氏沼蝦的氧化應(yīng)激損傷

1.4 mg/L亞甲基藍(lán)暴露導(dǎo)致羅氏沼蝦活性氧水平和抗氧化酶活性發(fā)生明顯變化(圖5)。亞甲基藍(lán)暴露導(dǎo)致SOD、GSH-Px酶活出現(xiàn)顯著下降，SOD在暴露2 d后出現(xiàn)顯著下降，在4 d達(dá)到最低，GSH-Px酶活于暴露后1 d出現(xiàn)顯著下降，在4 d下降至最低水平，清水恢復(fù)3 d后，SOD、GSH-Px酶活均恢復(fù)至略低于對(duì)照組活性水平，7 d后恢復(fù)至對(duì)照組水平。H2O2和MDA含量在亞甲基藍(lán)暴露后即出現(xiàn)積累，在暴露4 d后達(dá)到峰值，清水恢復(fù)7 d后，MDA含量逐漸恢復(fù)至對(duì)照組水平，H2O2含量仍高于對(duì)照組但差異不顯著。

圖5 亞甲基藍(lán)脅迫對(duì)羅氏沼蝦肝胰腺組織抗氧化系統(tǒng)的影響Fig.5 Effects of MB stress on the activities of antioxidant system in hepatopancreas of M.rosenbergiiT：亞甲基藍(lán)暴露組；C：對(duì)照組；“*”和“**”表示顯著差異(P<0.05)和極顯著差異(P<0.01)。 下圖同。

2.4 亞甲基藍(lán)對(duì)羅氏沼蝦免疫系統(tǒng)的影響

如圖6所示，在1.4 mg/L亞甲基藍(lán)暴露后，羅氏沼蝦肝胰腺免疫因子堿性磷酸酶(AKP)和酸性磷酸酶(ACP)的活性均受到嚴(yán)重影響，與對(duì)照組相比AKP在脅迫后1 d出現(xiàn)明顯下降，在2 d達(dá)最低點(diǎn)，脅迫4 d后出現(xiàn)上升趨勢(shì)，但顯著低于對(duì)照組，清水養(yǎng)殖3 d后AKP活性恢復(fù)至對(duì)照組水平。ACP與AKP趨勢(shì)基本相似，ACP在亞甲基藍(lán)暴露第2 d出現(xiàn)顯著下降，第4 d上升，轉(zhuǎn)移至清水3 d后活性低于對(duì)照組但差異并不顯著，清水養(yǎng)殖7 d后活性與對(duì)照組基本一致。

圖6 亞甲基藍(lán)脅迫對(duì)羅氏沼蝦肝胰腺AKP和ACP活性的影響Fig.6 Effect of MB stress on AKP and ACP activities in the hepatopancreas of M.rosenbergii

除免疫因子外，亞甲基藍(lán)暴露也導(dǎo)致羅氏沼蝦肝胰腺免疫相關(guān)基因表達(dá)水平的變化(圖7)。HSP基因在亞甲基藍(lán)暴露后表達(dá)水平顯著升高，其他三個(gè)免疫相關(guān)基因表達(dá)則出現(xiàn)顯著下降。proPO和TLR基因在亞甲基藍(lán)暴露2 d后表達(dá)水平顯著下降，低表達(dá)水平持續(xù)至暴露后第4 d，清水恢復(fù)3 d后proPO和TLR基因表達(dá)水平恢復(fù)至對(duì)照組水平。LEC基因在亞甲基藍(lán)暴露2 d后出現(xiàn)顯著下降，暴露后4 d下降至最低點(diǎn)，清水恢復(fù)3 d后LEC基因表達(dá)水平仍低于對(duì)照組，直至清水恢復(fù)7 d后LEC基因表達(dá)水平高于對(duì)照組，但差異不顯著。

圖7 亞甲基藍(lán)暴露對(duì)羅氏沼蝦肝胰腺組織HSP、proPO、TLR和LEC基因表達(dá)的影響Fig.7 Effects of MB on the expression of HSP,proPO,TLR,LEC in hepatopancreas tissues of M.rosenbergii

3 討論

3.1 亞甲基藍(lán)對(duì)羅氏沼蝦的毒性效應(yīng)

據(jù)報(bào)道亞甲基藍(lán)對(duì)金魚苗(CarassiusauratusLinnaeus)[12]、三角魴夏花魚種(Megalobramaterminalis)[13]、高體鳑魚苗(Rhodeusocellatus)[14]，長(zhǎng)薄鰍幼魚(LeptobotiaelongateBleeker)[15]的SC分別為2.36、1.24、0.96和0.93 mg/L。本研究發(fā)現(xiàn)，亞甲基藍(lán)對(duì)羅氏沼蝦的SC為1.1 mg/L，而在劉建勇等[4]的研究中亞甲基藍(lán)對(duì)凡納濱對(duì)蝦蚤狀幼體、糠蝦幼體及仔蝦的SC分別為0.025、0.029和0.073 mg/L，推測(cè)水產(chǎn)動(dòng)物對(duì)亞甲基藍(lán)的敏感性與物種及個(gè)體大小有關(guān)。此外，我們發(fā)現(xiàn)，羅氏沼蝦對(duì)亞甲基藍(lán)暴露初期敏感度較低，24 h LC50達(dá)到209.7 mg/L，但亞甲基藍(lán)對(duì)羅氏沼蝦的毒性效應(yīng)隨時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸加重，96 h LC50僅為2.8 mg/L。本實(shí)驗(yàn)采用濃度為1.4 mg/L亞甲基藍(lán)暴露4 d，結(jié)果顯示亞甲基藍(lán)對(duì)羅氏沼蝦造成不可逆的病理?yè)p傷和功能障礙，如肝胰腺細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)泡減少，肝胰腺小管變性，鰓絲基部出現(xiàn)大量空泡，鰓絲頂部出現(xiàn)腫大，腸道絨毛消失，柱狀細(xì)胞缺失等病理?yè)p傷，并且在去除亞甲基藍(lán)清水養(yǎng)殖7 d后部分損傷仍不可逆。因此建議養(yǎng)殖過(guò)程中采用短期浸泡方式進(jìn)行殺菌消毒，應(yīng)避免亞甲基藍(lán)的長(zhǎng)期使用。

3.2 亞甲基藍(lán)對(duì)羅氏沼蝦抗氧化防御系統(tǒng)的影響

在病原體入侵時(shí)，機(jī)體通過(guò)氧化應(yīng)激產(chǎn)生大量的活性氧(ROS)，而抗氧化系統(tǒng)可以清除機(jī)體內(nèi)過(guò)量ROS，避免機(jī)體受到氧化損傷，當(dāng)抗氧化系統(tǒng)失衡，機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生造成細(xì)胞損傷的氧自由基(H2O2)和脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物(MDA)[16]。超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)是水生動(dòng)物機(jī)體抗氧化酶系統(tǒng)中的重要組成部分，是調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)氧化平衡的第一道防線[17]。SOD催化超氧化物歧化成H2O2，GSH-Px將H2O2還原成H2O和O2，阻止脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，減緩氧化應(yīng)激損傷[18]。本研究中，亞甲基藍(lán)暴露導(dǎo)致SOD和GSH-Px活性顯著降低，表明亞甲基藍(lán)抑制抗氧化酶的活性。此外，本研究中H2O2和MDA含量在羅氏沼蝦肝胰腺組織中顯著上升，二者的積累表明羅氏沼蝦體內(nèi)產(chǎn)生大量氧自由基，并導(dǎo)致過(guò)氧化現(xiàn)象，標(biāo)志著機(jī)體出現(xiàn)嚴(yán)重的氧化應(yīng)激損傷[19]。暴露后的羅氏沼蝦轉(zhuǎn)移至清水養(yǎng)殖7 d后，上述指標(biāo)均恢復(fù)至對(duì)照組水平，推測(cè)亞甲基藍(lán)對(duì)羅氏沼蝦抗氧化系統(tǒng)的損傷具有可逆性。

3.3 亞甲基藍(lán)對(duì)羅氏沼蝦免疫系統(tǒng)的影響

甲殼動(dòng)物缺乏特異性免疫力，依靠非特異性免疫系統(tǒng)抵抗病原干擾，如細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答[20]。酸性磷酸酶(ACP)和堿性磷酸酶(AKP)是非特異性磷酸單酯水解酶，通過(guò)直接溶解或消化外源物質(zhì)以達(dá)到防御的目的，反映了機(jī)體對(duì)外源性物質(zhì)的防御力[21]，是評(píng)價(jià)甲殼動(dòng)物免疫狀態(tài)的重要指標(biāo)[22]。AKP和ACP極易受外界環(huán)境影響，pH、溫度、重金屬、病原體等因素[23,24]均可導(dǎo)致其活性發(fā)生改變，本研究發(fā)現(xiàn)，亞甲基藍(lán)暴露導(dǎo)致肝胰腺出現(xiàn)嚴(yán)重組織病理?yè)p傷，并顯著降低羅氏沼蝦AKP和ACP活性，相似的結(jié)果在敵百蟲對(duì)克氏原螯蝦(Procambarusclarkii)的毒性研究中也有報(bào)道[25]。除AKP和ACP外，熱應(yīng)激蛋白(heat shock proteins,HSP)，酚氧化酶原(prophenoloxidase,proPO)、Toll樣受體(toll-likereceptor,TLRs)和凝集素(lectin,LEC)也是甲殼類動(dòng)物重要的先天免疫因子。HSP又稱熱休克蛋白，是生物體內(nèi)參與抗逆功能的重要蛋白，外界刺激(如高溫、缺氧、病毒感染、自由基等)均可誘導(dǎo)熱休克蛋白大量合成[26]。亞甲基藍(lán)暴露后，羅氏沼蝦HSP基因表達(dá)顯著上調(diào)，表明亞甲基藍(lán)可誘導(dǎo)羅氏沼蝦合成熱休克蛋白，增強(qiáng)對(duì)外界環(huán)境的抵抗力。proPO是酚氧化酶(PO)的前體物質(zhì)，機(jī)體受到病原刺激后可觸發(fā)酚氧化酶原激活系統(tǒng)，將proPO裂解為PO通過(guò)胞吐釋放進(jìn)入血淋巴，在病原體周圍形成黑色素沉淀消滅病原[27]。TLRs是一種特殊結(jié)構(gòu)模式識(shí)別受體，可廣泛性識(shí)別病原微生物進(jìn)化存在的保守分子[28]。LEC作為免疫效應(yīng)分子凝集素，具有識(shí)別、黏附，調(diào)理，促吞噬等生理生化功能[29]。本研究中亞甲基藍(lán)脅迫暴露導(dǎo)致proPO、TLR和LEC基因表達(dá)量顯著下降，AKP和ACP活性降低，推測(cè)亞甲基藍(lán)暴露可對(duì)羅氏沼蝦免疫系統(tǒng)造成嚴(yán)重?fù)p害，清水養(yǎng)殖7 d后，上述免疫基因表達(dá)水平和酶活均恢復(fù)至對(duì)照組水平，推測(cè)1.4 mg/L濃度亞甲基藍(lán)對(duì)羅氏沼蝦非特異性免疫因子的損傷可逆。

4 結(jié)論

羅氏沼蝦對(duì)亞甲基藍(lán)較為敏感，1.4 mg/L濃度亞甲基藍(lán)的持續(xù)暴露可導(dǎo)致羅氏沼蝦肝胰腺、腸道和鰓組織的病理?yè)p傷，并破壞抗氧化系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)，去除亞甲基藍(lán)并于清水中恢復(fù)7 d后，大部分損傷可恢復(fù)，然仍有部分組織病理?yè)p傷不可逆。