單倍型造血干細(xì)胞移植后疾病復(fù)發(fā)患者腸道微生態(tài)改變的臨床分析*

楊 曦，黃家文，蒲文琪，李成龍,葉雪梅,毛 妍，黃曉兵△

(1.電子科技大學(xué)附屬醫(yī)院/四川省人民醫(yī)院血液內(nèi)科，成都 610000;2.成都東籬醫(yī)院血液內(nèi)科，成都 610000)

異基因造血干細(xì)胞移植是目前治愈急性白血病最有效的方法。近年來，單倍型造血干細(xì)胞移植技術(shù)突飛猛進(jìn)，日臻成熟。相較于同胞全相合移植，單倍型造血干細(xì)胞移植具有遠(yuǎn)期復(fù)發(fā)率低的優(yōu)勢，但很多患者仍不可避免的遭遇復(fù)發(fā)。復(fù)發(fā)患者往往對化療藥物耐藥，化療后造血恢復(fù)慢，容易合并重癥感染，導(dǎo)致生存期大大縮短。一項351例移植后復(fù)發(fā)的單中心大樣本回顧性分析提示：移植后復(fù)發(fā)患者的3年總生存期(OS)僅有19%[1]。 腸道是人體免疫系統(tǒng)中關(guān)鍵的一環(huán)，體外各種物質(zhì)透過飲食與腸道細(xì)胞及共生菌群交互作用，最終形成免疫屏障以保持人體健康[2]。小鼠的體內(nèi)實驗證實，移植預(yù)處理損傷、抗菌藥物使用、感染等因素，會對腸道微生態(tài)造成不同程度的損傷，進(jìn)而增加移植后移植物抗宿主病(GVHD)的發(fā)生率[3-4]。最近的一項大樣本研究分析了來自4個不同中心的1 362例異基因造血干細(xì)胞移植患者(主要為同胞全相合和非血緣移植)的8 767份糞便樣本，同樣顯示了較低的腸道多樣性與移植相關(guān)死亡(TRM)和重度GVHD存在明顯相關(guān)性[4]。PELED等[5]通過對前瞻性收集的糞便樣本進(jìn)行16S核糖體測序，對541例接受異基因造血干細(xì)胞移植(71%為非血緣移植)治療的患者腸道微生態(tài)情況分析發(fā)現(xiàn)，腸道菌群中一組細(xì)菌的豐度與移植術(shù)后疾病復(fù)發(fā)、進(jìn)展之間存在關(guān)聯(lián)，這也許可作為潛在的生物標(biāo)志物或治療靶點來預(yù)防移植后復(fù)發(fā)并提高生存率。與同胞全相合移植和非血緣移植相比，單倍型造血干細(xì)胞移植在免疫重建、復(fù)發(fā)方面具有自身的獨特性[6-7]，主要體現(xiàn)在免疫重建后期的免疫耐受上。單倍型造血干細(xì)胞移植由于持續(xù)存在人類白細(xì)胞抗原不相合導(dǎo)致的異體反應(yīng)性T細(xì)胞，使患者持續(xù)獲得移植物抗白血病效應(yīng)(GVL)，因此復(fù)發(fā)率明顯低于同胞全相合移植。這種GVL的實現(xiàn)，與腸道微生態(tài)存在關(guān)聯(lián)，而具體的相關(guān)性尚不清楚。因此，本研究探討單倍型造血干細(xì)胞移植后疾病復(fù)發(fā)患者腸道微生態(tài)的改變。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2019年8月至2021年8月于四川省人民醫(yī)院行異基因造血干細(xì)胞移植患者38例為研究對象，分為術(shù)后出現(xiàn)疾病復(fù)發(fā)(復(fù)發(fā)組19例)和術(shù)后未出現(xiàn)疾病復(fù)發(fā)(對照組19例)，配對成19對。所有患者采集糞便樣本前1個月內(nèi)不能使用腸道菌群制劑、廣譜抗生素?；颊吲R床信息見表1。

表1 患者臨床信息(n=19)

1.2 方法

1.2.1糞便標(biāo)本微生物的擴(kuò)增子測序

所有患者收集糞便，立即置于無菌采樣盒內(nèi)，-80 ℃低溫冷凍保存。取 200 mg樣品采用QIAamp DNA Stool Mini Kit 試劑盒(QIAGEN)快速提取和純化 DNA，委托協(xié)云基因信息技術(shù)有限公司完成16S rDNA基因測序，使用QIIME軟件進(jìn)行測序數(shù)據(jù)處理并對獲得的高質(zhì)量序列進(jìn)行分析比對。

1.2.2糞便標(biāo)本病原微生物宏基因組二代測序(mNGS)檢測

在38例(19對)患者中，根據(jù)擴(kuò)增子結(jié)果，為進(jìn)一步明確差異病原菌具體的種名及相關(guān)生物信息學(xué)特性，選擇其中有代表性的14例(7對)患者的糞便標(biāo)本進(jìn)行病原微生物mNGS檢測，委托協(xié)云基因信息技術(shù)有限公司完成。提取送檢樣本中的所有核酸物質(zhì)，包括DNA/RNA，進(jìn)行高通量測序，經(jīng)過專用病原數(shù)據(jù)庫比對與生物信息學(xué)分析，基于物種和功能豐度信息進(jìn)行豐度柱狀圖、 Alpha多樣性、 beta多樣性及基于Wilcox 秩和檢驗、LEfSe 多元統(tǒng)計分析及代謝通路比較分析，以挖掘樣本(組)之間物種和功能組成的差異。另外，基于以上宏基因組標(biāo)準(zhǔn)分析的結(jié)果進(jìn)行一系列高級分析，例如 NMDS、CCA/RDA、Network、 CAG/MGS、腸型分析、ARDB 抗性基因注釋等分析；同時，可以結(jié)合轉(zhuǎn)錄組、代謝組及蛋白組數(shù)據(jù)進(jìn)行多組學(xué)的關(guān)聯(lián)分析評估糞便菌群的種類、多樣性、代謝通路等指標(biāo)[8]。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 Alpha多樣性指數(shù)分析

在復(fù)發(fā)人群中出現(xiàn)了Alpha多樣性指數(shù)的上升趨勢，代表其腸道中微生物數(shù)目趨于增加。這種增加的趨勢結(jié)合物種構(gòu)成及差異分布情況來看，提示在復(fù)發(fā)人群中有害菌有升高趨勢,見圖1。

A：Observed OTUs組間分布情況；B：Chao1 Index組間分布情況。

2.2 宏基因組分析

與對照組相比，復(fù)發(fā)組檢測到更多的微生物種類，無論是在屬水平，還是在種水平。屬水平：與對照組相比，復(fù)發(fā)人群中enterococcus(腸球菌屬)和escherichia(埃希氏菌屬)物種豐度較低，bacteroides(擬桿菌屬)、roseburia、blautia(布勞特氏菌屬)、clostridium(梭菌屬)和ruminococcus(瘤胃球菌屬)物種豐度較高(圖2A)。種水平：與對照組相比，復(fù)發(fā)人群中enterococcus faecium(屎腸球菌)和bifidobacterium animails(動物雙歧桿菌)豐度下調(diào)，bacteroides vulgatus(普通擬桿菌)、roseburia intestinalis(腸道薔薇菌)、bacteroides xylanisolvens(木桿菌)豐度上調(diào)(圖2B)。此外，圖2中也展示了GVHD組微生物構(gòu)成的情況，由于GVHD組例數(shù)太少，沒有進(jìn)行進(jìn)一步分析。

A：屬水平；B：種水平；CK:對照組；FF:復(fù)發(fā)組。

2.3 生物信息學(xué)分析

與對照組相比，復(fù)發(fā)組乳糖、半乳糖及蔗糖降解通路下調(diào)，丙酮酸代謝為異丁醇的通路、U乙酰胞壁?；彼狨＜暗矸劢到馔飞险{(diào)；GO分析中，復(fù)發(fā)組細(xì)胞膜成分增加，ATP結(jié)合、序列特異的DNA結(jié)合模塊表達(dá)增加；KEGG和Pfam分析中，復(fù)發(fā)組核糖體亞基L33和S14明顯減少，RNA聚合酶sigma-70因子明顯增加，見圖3～6。

CK:對照組；FF:復(fù)發(fā)組。

CK:對照組；FF:復(fù)發(fā)組。

CK:對照組；FF:復(fù)發(fā)組。

CK:對照組；FF:復(fù)發(fā)組。

3 討 論

近年來，單倍型造血干細(xì)胞移植已經(jīng)上升為最主要的異基因造血干細(xì)胞移植類型，尤其在中國。盡管與同胞全相合移植相比，單倍型移植具有更低的復(fù)發(fā)率，但移植后復(fù)發(fā)仍是移植后第一死亡原因。腸道菌群與GVHD、移植后免疫重建、疾病復(fù)發(fā)的相關(guān)性得到了多項研究的證實[9-12]，但當(dāng)前尚無法明確確切的關(guān)系，這與移植后復(fù)雜的生理、病理過程有關(guān)。PELED等[5]研究證明，eubacterium limosum(黏液真桿菌)的高豐度與異基因造血干細(xì)胞移植術(shù)后疾病復(fù)發(fā)、進(jìn)展之間存在關(guān)聯(lián)，可能作為潛在的生物標(biāo)志物或治療靶點來預(yù)防移植后復(fù)發(fā)和提高生存率。GABORIAU-ROUTHIAU 等[13]的實驗發(fā)現(xiàn)，分節(jié)絲狀桿菌的定植能夠提高Th1細(xì)胞產(chǎn)IFN-γ的量、Th17細(xì)胞分泌IL-17的量及小腸和結(jié)腸固有層淋巴細(xì)胞中Treg細(xì)胞的量，但單一定植分節(jié)絲狀桿菌的小鼠體內(nèi)Th和Treg細(xì)胞的總數(shù)量卻比常規(guī)小鼠少，提示分節(jié)絲狀桿菌盡管存在一定的免疫調(diào)節(jié)作用，同時也需要其他微生物共同參與才能實現(xiàn)[14-15]。因此，單一微生物變化的影響有限，并不能很好地指導(dǎo)臨床，這也是這個領(lǐng)域研究中存在的主要問題。近期發(fā)表在《新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志》上的ECOSPORⅢ期臨床試驗結(jié)果首次證實了糞便提取的口服藥物SER-109在臨床上防治復(fù)發(fā)性艱難梭菌感染的可行性[16]。這樣一種全新的改善腸道微生態(tài)的方式完全可能在未來應(yīng)用于造血干細(xì)胞移植后患者，只是安全性有待于進(jìn)一步探索。

本研究提示了與文獻(xiàn)報道不同的腸道微生物異常，盡管例數(shù)偏少，但都說明了移植后腸道菌群的變化與移植后復(fù)發(fā)存在相關(guān)性。這種差異不是單純的一種微生物能夠決定的。本研究結(jié)論中發(fā)現(xiàn)，動物雙歧桿菌這種有益菌在復(fù)發(fā)組中豐度下降；同時也發(fā)現(xiàn)，屎腸球菌這種有害菌在復(fù)發(fā)組中豐度下降，普通擬桿菌、腸道薔薇菌、木桿菌這些腸道常駐菌在復(fù)發(fā)組中豐度增加；進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，在復(fù)發(fā)組中糖酵解相關(guān)通路、蛋白質(zhì)合成代謝上存在一些差異，但由于例數(shù)偏少，無法得出有效的生物信息學(xué)結(jié)論。文獻(xiàn)中關(guān)于上述幾種腸道菌群也有一些報道，主要集中在與移植后感染和GVHD的相關(guān)性上，未見與移植后復(fù)發(fā)相關(guān)的報道。屎腸球菌，尤其是耐萬古霉素的屎腸球菌在造血干細(xì)胞移植術(shù)后兒童患者的血流感染中比較常見[17]；普通擬桿菌的豐度與霉酚酸酯的代謝有關(guān)，高擬桿菌的患者霉酚酸酯血液濃度更高，潛在降低GVHD的發(fā)生率，但可能增加霉酚酸酯相關(guān)毒性[18]。

綜上所述，本研究初步發(fā)現(xiàn)，在單倍型移植體系下，復(fù)發(fā)患者的腸道微生態(tài)紊亂與文獻(xiàn)報道的不盡相同，傾向于有害菌的增多及營養(yǎng)代謝通路失衡，但限于研究例數(shù)，這些差異還有待于更進(jìn)一步的臨床病例觀察及干預(yù)性研究的證實。未來，無論上述差異如何，糾正復(fù)發(fā)患者的腸道微生態(tài)紊亂是全新的一種抗復(fù)發(fā)策略，而糞便提取的口服藥物可能是一個不錯的選擇。