白藜蘆醇激活PI3K/Akt信號(hào)通路與老年缺血性腦卒中大鼠血清IL-6、IL-1β含量的分子機(jī)制

王瑜 梁超 王寶愛 徐玉婷

(海口市中醫(yī)醫(yī)院,海南 ?？?570216)

缺血性腦卒中的發(fā)病率和死亡率很高，危及人類健康，是全球性的公共衛(wèi)生問題。根據(jù)美國(guó)心臟協(xié)會(huì)發(fā)布的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，每年在美國(guó)大約有795 000例患者被診斷出患有新發(fā)或復(fù)發(fā)性腦卒中。平均而言，每40 s就有1例患者被診斷為腦卒中，每4 min就有1例患者死于該病。腦卒中的死亡率為60%，而缺血性腦卒中約占所有腦卒中病例的87%〔1〕。在老年人群體中，腦缺血卒中給患者造成的影響是巨大的。越來越多的證據(jù)表明，腦卒中發(fā)作可以觸發(fā)中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)和全身免疫系統(tǒng)內(nèi)的炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，這是缺血性腦卒中病理進(jìn)展的關(guān)鍵因素〔2〕。磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信號(hào)通路在細(xì)胞增殖、炎癥、分化和細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮著重要作用〔 3〕。 減少腦缺血性腦卒中的細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)對(duì)于缺血性腦卒中的改善和治療可能至關(guān)重要。有研究表明PI3K/Akt信號(hào)通路的激活與缺血/再灌注損傷的保護(hù)有關(guān)〔4〕。白藜蘆醇是一種在葡萄、漿果、花生和其他植物中發(fā)現(xiàn)的天然多酚，由于其在許多疾病中作為預(yù)防和治療劑的潛在用途而受到廣泛關(guān)注〔5〕。研究發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇可通過抑制神經(jīng)炎癥來調(diào)節(jié)血漿和腸黏膜細(xì)胞因子〔包括白細(xì)胞介素(IL)-10和IL-17A〕的水平對(duì)急性腦卒中發(fā)揮保護(hù)作用〔6〕。有研究表明，白藜蘆醇可通過激活PI3K/Akt信號(hào)通路抑制骨關(guān)節(jié)炎相關(guān)炎癥的發(fā)展〔7〕。本研究探討白藜蘆醇激活PI3K/Akt信號(hào)通路抑制血清中炎癥因子IL-6和IL-1β的分子機(jī)制。

1 材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)細(xì)胞株和主要試劑 21月齡雄性SD大鼠均購(gòu)買于上海醫(yī)藥工業(yè)研究院；2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色液(1%，BP-DL511，南京森貝伽生物科技有限公司)；TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(C1088，碧云天)；IL-6酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒(ab178013)、IL-1β ELISA試劑盒(ab214025)、PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt抗體、二抗山羊抗兔IgG均購(gòu)自Abcam公司。

1.2缺血性腦卒中大鼠模型構(gòu)建 36只大鼠飼養(yǎng)于無特殊病原體級(jí)層流架上，恒溫(24～26)℃，恒濕(45%～55%)，飼料、飲用水均經(jīng)高溫消毒后使用，實(shí)驗(yàn)過程中對(duì)動(dòng)物的處置符合動(dòng)物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。分組：Control組(正常大鼠)、大腦中動(dòng)脈閉塞(MCAO)組、白藜蘆醇〔25 mg/(kg·d)處理〕組各12只，線栓法建立MCAO模型：大鼠用2%戊巴比妥鈉 (40 mg/kg) 腹腔注射麻醉固定，自頸部行1 cm長(zhǎng)切口，暴露左頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈及頸內(nèi)動(dòng)脈，結(jié)扎頸總動(dòng)脈近心端和頸外動(dòng)脈遠(yuǎn)心端；在頸總動(dòng)脈上兩線結(jié)間打一松結(jié)，將線栓從頸外動(dòng)脈插入頸內(nèi)動(dòng)脈進(jìn)而到達(dá)大腦中動(dòng)脈 (深度約12.0 mm)，血管阻塞1 h后拔出線栓，縫合皮膚。Control組只進(jìn)行手術(shù)操作，不插入線栓，作為對(duì)照。整個(gè)手術(shù)過程平均15 min完成，術(shù)后保持大鼠體溫，自由飲水、進(jìn)食。

1.3老年腦缺血卒中大鼠模型構(gòu)建的評(píng)價(jià) TTC染色評(píng)價(jià)腦梗死體積。缺血24、48 h后，用2%戊巴比妥鈉 (40 mg/kg) 腹腔注射麻醉后處死動(dòng)物?？焖偃〕瞿X組織，以1 mm的間隔進(jìn)行冠狀切片，用2%的TTC染色。梗死體積的計(jì)算方法是將所有截面的梗死面積相加，再乘以總厚度。每組取6只大鼠進(jìn)行評(píng)估計(jì)算后取平均值。一般神經(jīng)系統(tǒng)行為學(xué)評(píng)分。灌注后24、48 h，根據(jù)一般神經(jīng)系統(tǒng)評(píng)分評(píng)估神經(jīng)系統(tǒng)評(píng)分。在一般評(píng)分中，評(píng)估以下6項(xiàng)一般神經(jīng)功能：頭發(fā)狀況(0～2分)，耳朵位置(0～2分)，眼睛狀況(0～4分)，自發(fā)活動(dòng)(0～4分)，姿勢(shì)(0～4分)，癲癇行為(0～12分)，每組取6只大鼠進(jìn)行評(píng)估計(jì)算后取平均值。統(tǒng)計(jì)以雙盲方式進(jìn)行，統(tǒng)計(jì)人員未參加建模，不知曉分組信息。

1.4ELISA 術(shù)后10 d冰上提取Control組大鼠腦組織和MCAO組大鼠梗死周圍區(qū)的皮層腦組織，按1∶10比例加入預(yù)冷的勻漿緩沖液，冰上研磨為組織勻漿后離心取上清液。采用IL-6和IL-1β ELISA試劑盒對(duì)各組大鼠腦組織培養(yǎng)上清炎癥因子進(jìn)行檢測(cè)，試劑盒均購(gòu)自武漢貝茵萊生物科技有限公司，按照說明書進(jìn)行操作，用底物四甲基聯(lián)苯胺(TMB)顯色。酶標(biāo)儀 (BioTek，USA) 測(cè)定450 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光光度度值，并計(jì)算炎癥因子濃度。重復(fù)3次平行實(shí)驗(yàn)。

1.5TUNEL染色實(shí)驗(yàn) 取大鼠腦組織石蠟切片，常規(guī)二甲苯脫蠟，梯度酒精復(fù)水，3% H2O2溶液中室溫浸泡10 min。磷酸鹽緩沖液(PBS)洗5 min，加入50 μl 20 μg/ml的蛋白酶K (Sigma，USA)，室溫20 min去除組織蛋白。PBS洗3次，5 min/次。加入檸檬酸鹽，抗原修復(fù)30 min，PBS洗2次，5 min/次。加50 μl末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(TdT)酶反應(yīng)液，37°C避光1 h，以不含TdT酶的反應(yīng)液為陰性對(duì)照，PBS洗3次，5 min/次。滴加50 μl過氧化物酶標(biāo)記的抗地高辛(anti-digoxigenin)，37℃避光反應(yīng)30 min，PBS洗3次，5 min/次。二氨基聯(lián)苯胺(DAB,ZSGB-BIO，China)顯色10 min，PBS漂洗3次后，蘇木素復(fù)染后在顯微鏡 (Nikon，Japan) 下觀察并拍照。

1.6Western印跡檢測(cè) 組織加入全蛋白裂解液后冰上裂解10 min，用二喹啉甲酸(BCA)定量試劑盒進(jìn)行定量，定量之后加入10 μl上樣緩沖液95℃煮10 min后即可上樣跑膠，于100 V泳道進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)；電泳后，將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜；封閉液〔5%牛血清白蛋白(BSA)/TBST〕封閉60 min，加入PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt抗體，4℃過夜。一抗孵育完畢后，用1×TBST溶液室溫下?lián)u床搖動(dòng)洗膜，5 min×3次，加辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗山羊抗兔IgG H&L(辣根過氧化酶)，室溫下雜交120 min，TBST洗膜3次，每次20 min后用電化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑盒進(jìn)行發(fā)光反應(yīng)，觀察Western印跡，并進(jìn)行圖像分析，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行方差分析、t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1白藜蘆醇降低腦缺血卒中腦梗死面積 TTC染色檢測(cè)24 h和28 h腦組織結(jié)果顯示，與Control組相比，MCAO組腦梗死面積顯著增多，和MCAO組相比，白藜蘆醇處理組腦梗死面積降低，說明白藜蘆醇降低腦缺血腦卒中腦梗死面積。見圖1。

2.2神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分檢測(cè) 神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分結(jié)果顯示，與Control組〔(1.33±0.52)分〕相比，MCAO組神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分〔(19.34±1.96)分〕明顯升高(P<0.05)；與MCAO組相比，白藜蘆醇組神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分〔(14.33±1.02)分〕明顯降低(P<0.05)，說明白藜蘆醇降低腦缺血卒中神經(jīng)病理機(jī)制。

2.3白藜蘆醇降低老年缺血性腦卒中大鼠血清IL-6和IL-1β的表達(dá)水平 ELISA結(jié)果顯示，與Control組相比，MCAO組血清IL-6和IL-1β表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)；與MCAO組相比，白藜蘆醇組血清IL-6和IL-1β表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)。見表1。

1～3：Control組、MCAO組、白藜蘆醇組；圖3同

表1 各組血清IL-6和IL-1β表達(dá)水平及PI3K/Akt信號(hào)通路蛋白表達(dá)水平比較

2.4白藜蘆醇降低老年缺血性腦卒中腦組織凋亡水平 與Control組相比，MCAO組腦組織凋亡水平明顯升高(P<0.05)；與MCAO組相比，白藜蘆醇組腦組織凋亡水平明顯降低(P<0.05)。見圖2。

圖2 各組腦組織凋亡水平(TUNEL染色，×400)

2.5白藜蘆醇激活PI3K/Akt信號(hào)通路 Western印跡結(jié)果顯示，與Control組相比，MCAO組腦組織PI3K、p-PI3K、Akt和p-Akt表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)；與MCAO組相比，白藜蘆醇組腦組織PI3K、p-PI3K、Akt和p-Akt的表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)。見表1、圖3。

圖3 Western印跡檢測(cè)各組PI3K/Akt信號(hào)通路蛋白表達(dá)

3 討 論

腦卒中是全球第二大死亡原因，其特征是高發(fā)病率致殘疾和死亡率。發(fā)生在大腦某些區(qū)域的腦血流量不足時(shí)，導(dǎo)致神經(jīng)功能障礙，已被列為世界范圍內(nèi)最常見的死亡和死亡原因之一〔8〕。缺血性腦卒中嚴(yán)重威脅著人類的生命和健康，并給家庭造成了沉重的負(fù)擔(dān)〔9〕。腦缺血后，活化的免疫細(xì)胞和相關(guān)的細(xì)胞因子不僅可以加重缺血性腦損傷，還可以促進(jìn)組織修復(fù)。鑒于中樞神經(jīng)系統(tǒng)自身修復(fù)的能力有限，繼發(fā)免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)可有效改善缺血性腦卒中。Wytrykowska等〔10〕研究表明，與對(duì)照組相比，缺血性腦卒中患者血清中有較高的IL-1β和IL-6水平。

白藜蘆醇被歸類為植物雌激素，其結(jié)構(gòu)類似于雌二醇，并且通過與雌激素受體a和b結(jié)合而發(fā)揮作用〔11〕。白藜蘆醇已被證明可以減少腦卒中前和(或)后的腦損傷和神經(jīng)系統(tǒng)損傷〔12〕，這些神經(jīng)保護(hù)作用與該藥的抗氧化、抗感染和抗凋亡特性有關(guān)。此外，白藜蘆醇與雌激素受體的結(jié)合已經(jīng)與其對(duì)缺血性腦的保護(hù)作用聯(lián)系在一起。Lara等〔13〕研究表明，白藜蘆醇和丙戊酸的結(jié)合可以顯著減少了梗死體積及神經(jīng)功能缺損。Yu等〔14〕研究表明，白藜蘆醇預(yù)處理可顯著改善腦卒中后體內(nèi)和體外的神經(jīng)功能，減少梗死體積，增強(qiáng)活力并減少神經(jīng)元的凋亡。Koronowski等〔15〕研究表明，白藜蘆醇可以通過神經(jīng)元調(diào)節(jié)腦糖酵解功能中的新作用，構(gòu)成缺血耐受的強(qiáng)大神經(jīng)保護(hù)機(jī)制及Ⅲ類去乙?；?SIRT)1在腦中介導(dǎo)的代謝適應(yīng)。

PI3K/Akt信號(hào)傳導(dǎo)途徑是重要的存活和抗凋亡信號(hào)傳導(dǎo)途徑，在細(xì)胞凋亡、存活、增殖、細(xì)胞骨架變化及其他活動(dòng)中起著重要的生物學(xué)功能〔16〕。Peng等〔17〕研究表明，在缺血性腦卒中，miR-221在患者中被下調(diào)，并通過調(diào)節(jié)磷酸酯酶與張力蛋白同源物(PTEN)/PI3K/Akt途徑促進(jìn)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)的功能，木犀草素可以通過抑制基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)9和激活PI3K/Akt信號(hào)通路具有治療缺血性腦卒中的潛力〔18〕。Fan等〔19〕發(fā)現(xiàn)缺血性腦卒中是世界上嚴(yán)重殘疾的主要原因，與感覺運(yùn)動(dòng)和認(rèn)知功能障礙的高發(fā)有關(guān)，S-奧拉西坦(ORC)可以減少TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞，增加細(xì)胞活力，降低血清乳酸脫氫酶(LDH)活性，通過PI3K/Akt/GSK-3β信號(hào)通路抑制細(xì)胞凋亡率。二氫辣椒素(DHC)通過PI3K/Akt調(diào)節(jié)大鼠缺血性腦卒中后增強(qiáng)亞低溫誘導(dǎo)的神經(jīng)保護(hù)作用〔20〕。趨化因子蛋白(CXCL)8的功能性抑制通過調(diào)節(jié)缺血性腦卒中小鼠的PI3K/Akt/核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB信號(hào)傳導(dǎo)途徑來促進(jìn)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞活化并抑制神經(jīng)炎癥〔21〕。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇能使腦梗死面積降低，神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分降低，大鼠血清IL-6和IL-1β降低，腦組織凋亡水平降低及腦組織PI3K、p-PI3K、Akt和p-Akt的表達(dá)水平升高。白藜蘆醇通過激活PI3K/Akt信號(hào)通路調(diào)控老年缺血性腦卒中大鼠血清IL-6、IL-1β含量的分子機(jī)制，為老年缺血性腦卒中的治療提供了新的研究思路。