HA復(fù)合β-TCP在新西蘭兔上頜竇提升術(shù)中的成骨及成血管效果

張艷波 霍峰 王雪峰 韓尚志 張興樂 王鵬

(承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院口腔科，河北 承德 067000)

由社會老齡化、面部創(chuàng)傷、腫瘤切除、先天性畸形及炎癥等因素導(dǎo)致的上頜后區(qū)骨量不足以致牙槽骨骨缺失是口腔臨床醫(yī)學(xué)面臨的重大挑戰(zhàn)之一。在上頜竇提升術(shù)中，有效的修復(fù)及重建骨缺損是使患者免于疾病困擾的慣用治療方案〔1〕。研究顯示〔2〕，自體骨移植修復(fù)材料能明顯促進骨的再生和愈合，是修復(fù)缺失骨的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但是該方法需要從患者身體其他部位獲取，患者要承受新的疼痛或者神經(jīng)創(chuàng)傷，誘發(fā)較為強烈的炎性應(yīng)激等并發(fā)癥，并且由于自體骨的增殖能力有限，難以滿足臨床上較大的骨需求量。大量的臨床數(shù)據(jù)顯示〔3〕置入式骨替代材料在硬組織修復(fù)中具有潛在的廣闊前景。研究顯示〔4〕羥基磷灰石(HA)、β-磷酸三鈣(β-TCP)等替代骨材料常被骨外科醫(yī)師用于骨增量手術(shù)中。有研究報道〔5〕，HA具有明顯的生物相容性優(yōu)勢，可為骨再生提供較為穩(wěn)定的支架作用，但是其被生物降解的過程緩慢，嚴(yán)重影響初期骨的形成。有研究報道稱〔6〕，β-TCP在骨組織修復(fù)中顯示了更好的生物降解速率，但其作為支架作用的缺點同樣較為明顯，無法在3～6個月的骨組織重建過程維系骨替代材料降解與成骨過程的平衡。Sakamoto等〔7〕研究表明將HA復(fù)合β-TCP應(yīng)用到骨重建術(shù)中，顯示了較為滿意的成骨效果。但是HA復(fù)合β-TCP材料用于上頜骨的修復(fù)的報道較少。本研究探討HA復(fù)合β-TCP對新西蘭大白兔上頜竇提升術(shù)中的成骨和成血管的影響。

1 材料和方法

1.1實驗動物、試劑和儀器 動物：雌性，SPF級，3月齡，體重(2.5±0.5)kg，31只，健康新西蘭大白兔，采購自河北省望都縣彤輝養(yǎng)殖有限公司，動物的許可證號：SCXK(冀)2016-002，實驗動物使用許可證號SYXK(冀)2017-001。在承德醫(yī)學(xué)院實驗動物中心飼養(yǎng)房中，恒溫恒濕條件下，標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料，自由飲水，單籠飼養(yǎng)，至少進行適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后用于后續(xù)實驗。本研究的實驗操作均符合醫(yī)學(xué)院動物倫理委員會的要求，已獲取承德醫(yī)學(xué)院動物倫理委員會的批準(zhǔn)。主要試劑：HA復(fù)合β-TCP(HA和β-TCP的比例為3∶7)購自國家生物醫(yī)學(xué)材料工程技術(shù)中心。β-TCP、麻醉劑、磷酸鹽緩沖液(PBS，北京Solarbio公司)，兔抗大鼠GAPDH(北京博奧森生物技術(shù)公司)；蘇木素-伊紅(HE)試劑盒(美國Amresco公司)，免疫組化、Western印跡試劑盒(美國millipore公司)，茜素紅、油紅O染色試劑盒(南京建成生物工程有限公司)。主要儀器：掃描電鏡(日本HITACHI 公司)，光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司)，酶標(biāo)儀(北京六一儀器廠)，F(xiàn)ACS Aria Ⅲ流式細(xì)胞儀、凝膠電泳儀(美國BD公司)。

1.2電鏡觀察HA復(fù)合β-TCP生物材料的特性 在實驗前將無菌真空包裝的HA復(fù)合β-TCP材料切成直徑3 mm，高度為5 mm的形狀，電鏡下觀察復(fù)合材料的微觀結(jié)構(gòu)。

1.3細(xì)胞實驗部分

1.3.1新西蘭大白兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)分離、鑒定與培養(yǎng) 取1只實驗動物，靜脈注射30 mg/kg的3%戊巴比妥鈉麻醉后，剝離大白兔的股骨〔8〕，PBS沖洗3次，將沖洗出來的骨髓離心，棄上清，以濃度為15%胎牛血清(FBS)的DMEM培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，置于37℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔1 d更換一次培養(yǎng)，并在顯微鏡下隨時觀察細(xì)胞的形態(tài)及生長變化當(dāng)細(xì)胞的生長密度超過90%時，0.25%胰酶消化，用于后續(xù)實驗。BMSCs的表面抗原鑒定通過流式細(xì)胞儀進行，胰酶消化細(xì)胞后，1 500 r/min離心3 min，PBS洗滌，以100 μl的PBS重懸細(xì)胞，加入一抗(CD29、CD34、CD44、CD45)，室溫下孵育30 min，PBS沖洗3次，加入二抗，避光孵育2 h，F(xiàn)ACS Aria Ⅲ流式細(xì)胞儀檢測〔9〕。

1.3.2細(xì)胞實驗分組及HA復(fù)合β-TCP材料對BMSCs的生長活性的影響 胰酶消化細(xì)胞后，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×104個/孔接種于96孔培養(yǎng)板中，將細(xì)胞分為空白組(不進行任何處理)、對照組(細(xì)胞的培養(yǎng)基中添加1%的β-TCP后培養(yǎng))〔10〕、實驗組(細(xì)胞的培養(yǎng)基中添加1%的HA復(fù)合β-TCP材料)，每組設(shè)18個復(fù)孔，置于37℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，接著每孔加入100 μl的CCK-8工作液，室溫孵育1 h，使用酶標(biāo)儀〔11〕在12、24、36、48、60、72 h時各取3個孔測量D450。

1.3.3HA復(fù)合β-TCP材料對BMSCs的成骨分化的影響 胰酶消化細(xì)胞后，更換為成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基同時調(diào)整細(xì)胞濃度為1×104個/孔接種于96孔培養(yǎng)板中，分組同1.3.2，置于37℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔1 d更換培養(yǎng)基，培養(yǎng)14 d后，按茜素紅、堿性磷酸酶染色試劑盒〔12〕，染色，封片，顯微鏡下觀察BMSCs的成骨和成血管狀況。

1.4動物實驗部分

1.4.1新西蘭大白兔的上頜竇提升術(shù) 將實驗動物按隨機數(shù)字表法分為空白組、對照組、實驗組，每組10只；實驗動物禁食禁水12 h后，耳靜脈注射戊巴比妥鈉將動物麻醉后〔13〕，嚴(yán)格按手術(shù)要求在鼻部術(shù)區(qū)備皮，消毒，與動物鼻后1.5 cm處行縱行切口，在無菌顯微剪的幫助下，分開兩側(cè)皮膚，暴露大白兔的鼻翼區(qū)，使用環(huán)形去骨鉆在上頜竇頂壁制備以直徑為0.5 cm的骨窗，取下骨片，分開上頜竇黏膜，復(fù)制出5 cm×5 cm×5 cm的空間：空白組在該處填充醫(yī)用生理鹽水和明膠海綿；對照組在該處填充1%β-TCP、醫(yī)用生理鹽水和明膠海綿；實驗組在該處填充1%的HA復(fù)合β-TCP材料、醫(yī)用生理鹽水和明膠海綿，蓋上自體骨，縫合骨膜，肌注20萬U的青霉素防止感染。

1.4.2HE染色檢側(cè)實驗動物上頜竇組織的形態(tài)改變 所有大白兔在術(shù)后單籠，標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)28 d后，處死動物，無菌分離實驗動物的上頜竇組織。以多聚甲醛固定， 置于脫鈣液中3個月，每3 d更換脫鈣液，待醫(yī)用大頭針能輕易穿刺標(biāo)本后〔14〕，脫水，切片，HE染色，顯微鏡下觀察標(biāo)本中的成骨和成血管情況。

1.4.3免疫組化檢側(cè)各組標(biāo)本中的微血管密度(MVD) 待各組標(biāo)本脫鈣后，常規(guī)脫水，切片，采用檸檬酸鹽緩沖液高溫修復(fù)抗原，5%山羊血清封閉，加入一抗CD31(1∶500)〔15〕，4℃孵育過夜，加入二抗，PBS潤洗3次，蘇木精復(fù)染， 二甲苯脫水，封片，上鏡檢測。

1.4.4Western印跡檢測各組標(biāo)本中成骨相關(guān)蛋白成骨基因特異性轉(zhuǎn)錄因子(Runx)2、骨橋蛋白(OPN)及血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的表達水平 待各組標(biāo)本脫鈣后，經(jīng)常規(guī)裂解、勻漿、離心后，測定蛋白濃度，電泳分離，轉(zhuǎn)模、封閉〔12〕，滴加一抗(均為1∶500)，4℃孵育過夜，次日清洗后加入二抗(均為1∶1 000)，顯色，凝膠成像儀下讀取各條帶灰度值〔16〕，參照GAPDH的表達計算目的蛋白相對表達水平。

1.5統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS16.0軟件進行方差分析，t檢驗，作圖工具采用Graphpad5.01。

2 結(jié) 果

2.1電鏡下觀察復(fù)合材料的微觀結(jié)構(gòu) 掃描電鏡觀察顯示，HA復(fù)合β-TCP材料內(nèi)部的微孔(直徑300～500 μm)和超微孔(直徑1 μm)數(shù)量豐富，孔徑率在85%左右，視野中的微孔均在內(nèi)部鏈接緊密，為新血管以及骨骼的形成提供足夠的空間和營養(yǎng)，見圖1。

2.2BMSCs的培養(yǎng)與鑒定 光學(xué)顯微鏡下，BMSCs多為長梭形、橢圓形或多邊形，貼壁生長呈現(xiàn)旋渦狀、魚群狀排列；BMSCs表面陽性標(biāo)記物CD29(62.78±2.94)%，CD44(93.73±9.18)%，呈現(xiàn)高表達的狀態(tài)，而CD34，CD45均為陰性表達，這些結(jié)果說明所提取的細(xì)胞為BMSCs，見圖2。

2.3HA復(fù)合β-TCP材料對BMSCs的生長活性的影響 3組細(xì)胞的OD值無明顯差異(P>0.05)，說明3組細(xì)胞的生長的增殖活性趨于一致，進而顯示HA復(fù)合β-TCP材料對BMSCs無毒性，見表1。

圖1 電鏡掃描生物材料的微觀結(jié)構(gòu)

圖2 BMSCs的培養(yǎng)與鑒定

表1 各組細(xì)胞的OD值

2.4HA復(fù)合β-TCP材料對BMSCs的成骨分化的影響 空白組細(xì)胞中未見明顯的礦化結(jié)節(jié)，對照組細(xì)胞中可見少量的礦化結(jié)節(jié)，實驗組細(xì)胞中可見較多的礦化結(jié)節(jié)，3組細(xì)胞的礦化結(jié)節(jié)數(shù)量的差異具有統(tǒng)計意義(均P<0.05)，見圖3，表2。

圖3 各組BMSCs茜素紅染色(×400)

2.5HA復(fù)合β-TCP材料對BMSCs的成骨中血管生成的影響 空白組細(xì)胞中未見明顯的咖啡色顆粒，對照組細(xì)胞中可見少量的咖啡色顆粒，實驗組細(xì)胞中可見較多的咖啡色顆粒，與空白組相比，對照組、實驗組細(xì)胞中堿性磷酸酶的陽性比例明顯升高，與對照組相比，實驗組細(xì)胞中堿性磷酸酶的陽性比例明顯升高(均P<0.05)，見表2，圖4。

表2 各組細(xì)胞礦化結(jié)節(jié)數(shù)量、堿性磷酸酶的陽性比例比較

圖4 各組BMSCs堿性磷酸酶染色(×400)

2.6HE染色檢側(cè)各組上頜竇組織的形態(tài)改變 空白組動物的標(biāo)本中結(jié)締組織大量生成，視野中出現(xiàn)較多的炎性細(xì)胞浸潤，雖有少量骨質(zhì)新生，但未見明顯的骨小梁；對照組動物的上頜竇組織標(biāo)本中新生骨質(zhì)量明顯增多，新生骨質(zhì)見可見少量的血管生成和骨小梁；實驗組中新生骨質(zhì)量較對照組明顯增多，新生血管數(shù)量明顯增多，炎性浸潤的細(xì)胞明顯減少，視野中的骨小梁的數(shù)量明顯增多，見圖5。

2.7免疫組化檢側(cè)各組標(biāo)本中的MVD 與空白組相比，對照組、實驗組上頜竇組織中的MVD明顯增多；與對照組相比，實驗組上頜竇組織中的MVD明顯增多(均P<0.05)，見圖6，表3。

2.8Western印跡檢測各組標(biāo)本中Runx2、OPN、VEGF蛋白表達 與空白組相比，對照組、實驗組上頜竇組織中Runx2、OPN、VEGF表達明顯升高；與對照組相比，實驗組上頜竇組織中Runx2、OPN、VEGF表達明顯升高(均P<0.05)，見表3，圖7。

圖5 各組上頜竇組織形態(tài)(HE染色，×200)

圖6 各組上頜竇組織MVD(HE染色，×200)

表3 各組上頜竇組織中MVD、Runx2、OPN、VEGF相對表達比較

圖7 Western印跡檢測各組相關(guān)蛋白表達

3 討 論

臨床上常采用骨移植、牽張成骨刺激、牽拉成骨促進骨再生等手段中的一種或者多種方法聯(lián)合應(yīng)用以治療各種原因造成的骨缺損，由于當(dāng)今醫(yī)療技術(shù)的限制及患者所能承擔(dān)的經(jīng)濟負(fù)擔(dān)限制，這些干預(yù)手段但現(xiàn)在尚未達到令人欣慰的效果。但是在一些涉及因癌癥切除、外科創(chuàng)傷、先天性畸形而造成的頜面骨缺失的患者中，骨組織的修復(fù)及重建是提高患者身心健康及生命質(zhì)量的重要途徑。研究顯示〔17〕，自體骨移植、同種異體骨移植及填充骨替代材料是治療頜面骨缺損的主要手段，但是由于自體骨移植、同種異體骨移植固有局限性和技術(shù)要求的嚴(yán)格性，臨床醫(yī)師對這些手段的實用性和療效保留較大的爭議。得益于當(dāng)代生物材料、檢測技術(shù)及有限元建模等技術(shù)的突破性進展，填充骨替代材料成為解決臨床醫(yī)師困擾的最具前景的手段。

目前骨移植替代材料領(lǐng)域的發(fā)展迅速，如膠原、陶瓷、磷酸鈣水泥、β-TCP等。研究顯示〔18〕β-TCP因與骨骼具有相比的成分，在臨床的骨組織修復(fù)中具有廣闊的應(yīng)用前景。Goodarzi等〔19〕通過X射線對β-TCP納米級復(fù)合材料進行表征，結(jié)果顯示β-TCP納米材料的微孔及孔徑均極大提高了大鼠BMSCs的體外相容性，增強細(xì)胞中堿性磷酸酶的活性。Hojo等〔20〕研究報道將β-TCP/膠原蛋白復(fù)合材料用于犬無骨膜壓槽骨缺損模型中，在實驗周期內(nèi)β-TCP能明顯增加成骨的面積，顯示了強勁的促進骨再生和牙槽吸收的效用。Costa等〔21〕研究顯示作為生物活性材料，替代骨材料β-TCP在誘導(dǎo)成骨細(xì)胞的生成過程中，一方面能明顯降低機體的免疫原性和排斥反應(yīng)，另一方面其特有的超微孔結(jié)構(gòu)能明顯促進骨細(xì)胞的增殖，募集和分化。但是Go等〔22〕研究指出由于單一材料理化性質(zhì)難以匹及復(fù)雜的機體生理變化，需要將β-TCP與其他生物活性相復(fù)合，以彌補其作為支架功能不足的掠食，以發(fā)揮其最大的成骨效用。許多材料如骨傳導(dǎo)性能較好的聚乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)、殼聚糖、聚己內(nèi)酯、α-半水硫酸鈣(CSH)、納米HA等復(fù)合材料均已應(yīng)用到這一領(lǐng)域〔23〕。而HA因其具有與人類骨骼組織礦物質(zhì)相類似的成分，優(yōu)良的骨傳導(dǎo)性能，降低疾病傳播的風(fēng)險及方便易于結(jié)合性能等優(yōu)勢而被眾多學(xué)者廣泛研究。Nascimento等〔24〕通過對Wistar大鼠顱骨缺損的研究指出HA復(fù)合β-TCP材料的應(yīng)用能明顯增強填充物的生物相容性和骨傳導(dǎo)性，并且保留了原始的移植形狀，促進顱骨缺損的修復(fù)。但是有關(guān)HA復(fù)合β-TCP材料在頜面骨缺損修復(fù)的報道較少。本研究結(jié)果說明生物復(fù)合材料的應(yīng)用能明顯增強BMSCs體外成骨的分化及成血管效用。HA復(fù)合β-TCP材料的應(yīng)用能明顯緩解實驗動作缺損灶點的病理損傷，增加血管生成的數(shù)量，增強成骨和成血管相關(guān)蛋白Runx2、OPN、VEGF的表達。