低溫等離子體對精釀啤酒殺菌效果的研究

呂廣瑞，吳 龍?，戴曉勇，徐 慶，李占勇

（天津科技大學(xué) 機械工程學(xué)院，天津市輕工與食品工程機械裝備集成設(shè)計與在線監(jiān)控重點實驗室，天津市低碳綠色過程裝備國際聯(lián)合研究中心，天津 300222）

精釀啤酒是世界上廣泛流行的飲料，2022年上半年，我國新增精釀啤酒相關(guān)企業(yè)1 645家，同比增加 21.8%[1]。近年來，精釀啤酒企業(yè)數(shù)量也出現(xiàn)了顯著增長，預(yù)計到2025年中國精釀啤酒消費量可達(dá)26億L[2-3]。與傳統(tǒng)工業(yè)啤酒相比，精釀啤酒具有原料選擇精細(xì)、風(fēng)味多樣的特點，具有較強的市場競爭力[4]。精釀啤酒在生產(chǎn)過程中，其口感和新鮮程度會發(fā)生變化，導(dǎo)致啤酒品質(zhì)的劣變，從而容易產(chǎn)生細(xì)菌[5]。精釀啤酒的品質(zhì)與生產(chǎn)工藝、儲備環(huán)境等相關(guān)，直接影響企業(yè)的品牌信譽，以及消費者的接受程度[6]。因此，這就需要合適的殺菌方式對精釀啤酒進(jìn)行殺菌并且保證品質(zhì)。

目前，精釀啤酒通過傳統(tǒng)的熱殺菌方式會使其品質(zhì)受到很大的影響，不能保證口感及品質(zhì)。目前，一些新型殺菌技術(shù)對精釀啤酒的殺菌逐漸流行起來，例如超高壓[7]和高溫瞬時技術(shù)[5]對精釀啤酒的殺菌都有很好的效果。張帆[7]等利用超高壓處理工坊啤酒可有效地殺滅有害微生物并且保證其品質(zhì)。低溫等離子體是一種比較新穎的滅菌技術(shù)，其殺菌的機制主要包括紫外線、電場和活性氧氮等殺菌物質(zhì)的作用[8-11]。馬良軍[12]等利用介質(zhì)阻擋放電低溫等離子體在70 kV、150 s能夠完全殺滅腸炎沙門氏菌。劉雅夫等[13]使用低溫等離子體處理金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌的殺菌率分別為 90.00%和 98.99%。關(guān)于等離子體在果蔬汁方面的研究很多，比如獼猴桃汁[14]，蘋果汁[15]，梨汁[16]等，但低溫等離子體技術(shù)處理精釀啤酒的相關(guān)研究尚無報道。

本文采用等離子體殺菌裝置，研究了對精釀啤酒殺菌率及理化性質(zhì)的影響，并與巴氏殺菌進(jìn)行對比。探究等離子體在不同電壓和處理時間條件下對啤酒中菌落總數(shù)、大腸桿菌、酵母菌的影響；在單因素實驗的基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面優(yōu)化等離子體殺菌條件，并在最佳條件下處理精釀啤酒，為低溫等離子體殺菌技術(shù)在精釀啤酒中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

精釀啤酒：某生啤酒；塑料培養(yǎng)皿：湖南比克曼生物科技有限公司；無菌膠頭滴管：常德比克曼生物科技有限公司；錐形瓶、玻璃棒、燒杯：江蘇華歐玻璃有限公司；結(jié)晶紫中性紅膽鹽、孟加拉紅培養(yǎng)基、平板計數(shù)瓊脂，均為分析純：北京奧博星生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

G-135電子天平：常州市幸運電子設(shè)備有限公司；HSP-150BE恒溫恒濕培養(yǎng)箱、LSH-18B高壓蒸汽滅菌鍋、HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋、SW-CJ-1G型單人雙面凈化工作臺：上海力辰邦西儀器科技有限公司；分光測色儀：深圳市三恩時科技有限公司；DIPump550-B163蠕動泵：卡川爾流體科技（上海）有限公司；低溫等離子體發(fā)生器：南京蘇曼等離子體科技有限公司；啤酒泡持杯：朗鑫化玻璃儀器有限公司；pH-6011筆式pH計：臺灣泰仕電子工業(yè)股份有限公司。

1.3 內(nèi)容與方法

1.3.1 精釀啤酒的準(zhǔn)備

（1）精釀啤酒：采用未經(jīng)處理的青島原產(chǎn)地精釀啤酒，作為實驗的空白對照。

（2）巴氏殺菌：70 ℃條件下水浴加熱30 min。

（3）低溫等離子體殺菌：分別在處理時間5、10、15 s，電壓為30、35、40、45、50 kV，考察等離子體對精釀啤酒的殺菌效果，此時N2流速為60 mL/min。每個條件做3次取平均值。

1.3.2 等離子體裝置

本文采用自行設(shè)計的低溫等離子體殺菌裝置由高壓電源、低溫等離子發(fā)生器、介質(zhì)阻擋反應(yīng)器、蠕動泵、N2瓶等輔助設(shè)備組成，如圖1。精釀啤酒放置在玻璃瓶中，流動速度及等離子體處理時間通過蠕動泵調(diào)節(jié)。等離子體放電殺菌反應(yīng)器裝置是使用石英材料設(shè)計的反應(yīng)釜（長140 mm，寬60 mm，高10 mm），石英介質(zhì)厚度為1 mm。等離子體放電電極采用鋁型材料（長80 mm，寬60 mm，高18 mm），放電電極分別于電源的輸出端相連，絕緣介質(zhì)套于電極外部，兩電極間的最大間距為10 mm。出料口連接玻璃瓶進(jìn)行收集，氣體排出口與通風(fēng)櫥相連接。

圖1 等離子體殺菌裝置示意圖Fig.1 Schematic diagram of plasma sterilization device

以精釀啤酒為原料，選擇500 mL的透明玻璃瓶將其放入高壓滅菌鍋滅菌。實驗開始前使用紫外線燈在超凈工作臺照射30 min后，使用熱水流通整個裝置進(jìn)行滅菌。待冷卻后開啟等離子發(fā)生器及操作系統(tǒng)預(yù)熱1 min并通入氮氣，將精釀啤酒裝入500 mL玻璃瓶，開啟蠕動泵調(diào)節(jié)流速計算等離子體殺菌時間，其處理時間為 5、10、15 s。等離子體處理電壓為 30、35、40、45、50 kV。殺菌完成后立即進(jìn)行感官評價，同時進(jìn)行微生物和品質(zhì)指標(biāo)的測定。

1.3.3 微生物檢測

選取菌落總數(shù)、酵母菌、大腸桿菌作為微生物指標(biāo)。菌落總數(shù)的細(xì)菌檢測根據(jù) GB_4789.2—2016《食品微生物學(xué)檢驗 菌落總數(shù)測定》。酵母菌的檢測根據(jù) GB_4789.15—2016《食品微生物學(xué)檢驗 霉菌和酵母計數(shù)》。大腸桿菌的檢測根據(jù) GB_4789.3—2016《食品微生物學(xué)檢驗 大腸桿菌計數(shù)》。

1.3.4 響應(yīng)面設(shè)計

根據(jù)單因素實驗結(jié)果，以電壓、處理時間、氣體流速為工藝參數(shù)，設(shè)計三因素三水平響應(yīng)面實驗，以菌落總數(shù)、酵母菌、大腸桿菌以及亮度為響應(yīng)值，通過等高線圖、響應(yīng)面圖以及ANOVA進(jìn)行分析，以–1、0、+1進(jìn)行編碼，如表1所示。

表1 響應(yīng)面因素水平Table 1 Response surface factor levels

1.3.5 pH值的測定

將待測的精釀啤酒搖勻除氣后，取30 mL于燒杯中，使用pH計在室溫下測定其pH值。每次處理取3瓶樣品測定，重復(fù)測量3次，取平均值。

1.3.6 色度的測定

采用色差儀測定精釀啤酒的色澤，將除氣后的精釀啤酒搖勻后置于25 mL的比色杯中，測定總色差 ΔE[17]。具體操作方法參考 GB/T_4928—2008《啤酒分析方法》。

1.3.7 泡持性的測定

利用讀秒法，其原理是用目視法測定泡沫消失的速度，以秒表示。在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨立測試結(jié)果的絕對值不得超過算術(shù)平均值的10%[18]。具體操作方法參考 GB/T_4928—2008《啤酒分析方法》。

1.4 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析使用 Origin9.0軟件、Design Expert軟件。

2 結(jié)果與討論

2.1 未經(jīng)殺菌處理的精釀啤酒中微生物含量

啤酒中常見的菌種有酵母菌和大腸桿菌，酵母菌是啤酒發(fā)酵過程中比較常見的一個菌種，富含酵母菌易導(dǎo)致酒液微生物系統(tǒng)不穩(wěn)定；大腸菌群是較理想的水體受糞便污染的指示菌，微生物超標(biāo)導(dǎo)致啤酒易變質(zhì)[19]。表2結(jié)果顯示，菌落總數(shù)及大腸桿菌含量均超過啤酒微生物限量（菌落總數(shù)≤30 cfu/mL，大腸桿菌≤15 cfu/mL）。

表2 精釀啤酒中微生物檢測結(jié)果Table 2 Microbiological detection results in craft beer cfu/mL

2.2 等離子體電壓對精釀啤酒殺菌的影響

分別在保壓時間 5、10、15 s，氮氣流速60 mL/min條件下，探究等離子體處理電壓為30、35、40、45、50 kV對精釀啤酒中菌落總數(shù)、大腸桿菌和酵母菌的影響。

2.2.1 不同處理時間對精釀啤酒殺菌的影響

如圖2（a）所示，當(dāng)電壓為40 kV，時間為5 s時，菌落總數(shù)的殺菌率為81.2%；時間為10 s時，菌落總數(shù)被完全殺滅。說明隨著處理時間的增加，菌落總數(shù)減少速率增大。馬良軍等[12]也得到了類似的結(jié)論，處理時間的增加能增強等離子體的殺菌效果。由圖2（b）可知，在電壓大于40 kV，時間僅用5 s就可以有很好的殺菌效果，殺菌率可以達(dá)到95%。國標(biāo)中未對酵母菌含量有明確的要求，但是過多的酵母菌會使精釀啤酒變質(zhì)和有異味，影響其品質(zhì)和口感。由于圖2（b）和圖2（c）中大腸桿菌含量幾乎相同，從而導(dǎo)致線條重疊。從圖2（c）中可以看出，當(dāng)電壓為30 kV時，處理時間從5 s和10 s大腸桿菌濃度含量的變化很大，因為在短時間等離子體釋放的殺菌成分較少，到達(dá)一定時間后，活性成分釋放量不斷增加使得大腸桿菌被殺滅[20]。

圖2 不同處理時間對菌落總數(shù)（a）、酵母菌（b）、大腸桿菌（c）的殺菌效果Fig.2 Bactericidal effects of different treatment times on the total number of colonies (a),yeast (b) and Escherichia coli (c)

2.2.2 不同電壓對精釀啤酒殺菌的影響

由圖3（a）可知，當(dāng)時間為10 s，電壓為30 kV，菌落總數(shù)的含量減少到460 cfu/mL，電壓為40 kV時，減少到15 cfu/mL。可以看出隨著電壓的增大菌落總數(shù)減少速率逐漸增加?？赡苡捎陔妷旱脑黾樱沟玫入x子體產(chǎn)生高速離子對細(xì)菌的穿透作用導(dǎo)致了細(xì)胞的死亡。圖3（b）中，當(dāng)時間為5 s，電壓從30 kV增加到40 kV，酵母菌的殺菌率從51%增加到 96%。表明高壓使微生物細(xì)胞膜被電擊穿，產(chǎn)生不可修復(fù)的穿孔或破裂，使細(xì)胞組織受損，導(dǎo)致微生物失活，而達(dá)到殺菌效果[21]。從圖3（c）可以看出，由于精釀啤酒中大腸桿菌的含量較少，當(dāng)時間≥10 s，電壓≥35 kV時，大腸桿菌已經(jīng)被完全殺滅。其原因可能是由于等離子體含有大量活性物，通過氧化作用引起大腸桿菌的死亡。孫艷[22]等發(fā)現(xiàn)等離子體電壓對殺菌效率有顯著影響，電壓增高，殺菌率增大。

圖3 不同電壓對菌落總數(shù)（a）、酵母菌（b）、大腸桿菌（c）的殺菌效果Fig.3 Bactericidal effects of different voltages on the total number of colonies (a), yeast (b) and Escherichia coli (c)

2.2.3 精釀啤酒微生物檢測結(jié)果

由表3可知，精釀啤酒中菌落總數(shù)和大腸桿菌都超過國家標(biāo)準(zhǔn)的檢測限值。國標(biāo)中未對酵母菌含量進(jìn)行限制，但是過多的酵母菌會使啤酒持續(xù)發(fā)酵，從而導(dǎo)致啤酒腐敗。等離子體殺菌（電壓45 kV、處理時間10 s和氮氣流速60 mL/min）和巴氏殺菌（70 ℃和處理時間30 min）都有很好的殺菌作用，菌落總數(shù)和大腸桿菌均未檢測出，等離子體殺菌中酵母菌的殺菌率達(dá)到97.96%，而巴氏殺菌對酵母菌的殺菌率為99.99%。

表3 不同處理微生物檢測結(jié)果Table 3 Microbial detection results of different treatments cfu/mL

2.3 實驗?zāi)Ｐ徒⒓帮@著性檢驗

為進(jìn)一步優(yōu)化處理條件，根據(jù)實驗設(shè)計原理，選取處理電壓、處理時間和處理極距氣體流速對精釀啤酒中菌落總數(shù)、酵母菌和大腸桿菌殺菌率及亮度影響顯著的因素進(jìn)行實驗設(shè)計。表4列出了響應(yīng)面實驗設(shè)計以及結(jié)果，表5列出了亮度的響應(yīng)面方差分析結(jié)果。

表4 響應(yīng)面實驗設(shè)計以及結(jié)果Table 4 Experimental design and results of response surface

表5 亮度響應(yīng)面方差結(jié)果Table 5 Brightness response surface variance results

由表4的實驗結(jié)果得到二次多項回歸方程見公式：

式中A為電壓，kV；B為時間，s；C為氣體流速，mL/min

由表4可知，回歸模型顯著，說明該方程擬合得較好。表5顯示一次項A、B、C、交互項AB、AC、二次項A2是極顯著的。各因素對亮度的影響由強到弱依次電壓＞時間＞氣體流速。

2.4 等離子體殺菌效果響應(yīng)面分析

應(yīng)用Design Expert軟件，分析電壓、時間和氣體流速三因素對菌落總數(shù)、酵母菌、大腸桿菌以及亮度影響。

圖4為電壓與時間作用對菌落總數(shù)的影響，由圖可以看出，菌落總數(shù)的含量隨著電壓和殺菌時間的增加而減少，且電壓對菌落總數(shù)殺菌率影響比時間更加顯著。當(dāng)電壓從 30 kV增加到40 kV，時間為10 s、氣體流速為60 mL/min，其他參數(shù)不變，菌落總數(shù)減少了415 cfu/mL。

圖4 殺菌時間與電壓響應(yīng)面和等高線對菌落總數(shù)含量的影響Fig.4 Influence of sterilization time, voltage response surface and contour on total colony content

圖5可以看出，溫度和電壓對殺菌效果的影響接近，電壓40 kV，時間為10 s時，菌落總數(shù)的含量下降約80%，當(dāng)電壓上升到50 kV，時間為10 s，菌落總數(shù)則下降至0，這表明，隨著電壓的增大，殺菌效果增強趨勢顯著。當(dāng)電壓固定在40 kV，時間為15 s時，菌落總數(shù)的含量下降約95%，顯然，處理時間對殺菌效果有一定影響。

圖5 殺菌時間與電壓響應(yīng)面和等高線對酵母菌含量的影響Fig.5 Effect of sterilization time and voltage response surface and contour on yeast content

由圖6可知，響應(yīng)面顯示斜面較傾斜，表明電壓和時間的交互作用顯著。由于精釀啤酒中大腸桿菌含量較少，并且等離子體對大腸桿菌的殺菌作用比較強，因此在氮氣流速一定時，殺菌效果隨著電壓和時間的增加逐漸增強。

圖6 殺菌時間與電壓響應(yīng)面和等高線對大腸桿菌含量的影響Fig.6 Effects of sterilization time, voltage response surface and contour on E. coli content

圖7為等離子殺菌對亮度的影響，亮度可以觀察出精釀啤酒的外觀評價?？梢钥闯隽炼入S著時間和電壓的升高而降低。當(dāng)電壓為30 kV、時間為5 s時，亮度為37 cd/m2。當(dāng)電壓為50 kV、時間為10 s時，亮度為33 cd/m2?？梢钥闯鲭妷汉蜁r間對精釀啤酒的亮度有一定影響。

圖7 殺菌時間與電壓響應(yīng)面和等高線對亮度的影響Fig.7 Effect of sterilization time and voltage response surface and contour on brightness

通過響應(yīng)面方差分析，該模型為極顯著模型，說明該模型與實驗擬合較好。利用已建立的數(shù)學(xué)模型在實驗范圍內(nèi)優(yōu)化出最優(yōu)條件為：電壓40 kV，時間10 s，氣體流速60 mL/min，各因素影響大小為電壓＞時間＞氣體流速。在此條件下，菌落總數(shù)為13 cfu/mL（符合國家標(biāo)準(zhǔn)菌落總數(shù)濃度＜30 cfu/mL）、酵母菌含量為460 cfu/mL、大腸桿菌含量為 0，以及亮度為 36 cd/m2。精釀啤酒中保留少量的酵母菌可以保持口感和品質(zhì)，菌落總數(shù)和大腸桿菌達(dá)到國家標(biāo)準(zhǔn)。

2.5 色度和泡持度分析結(jié)果

由表6可知，色度物質(zhì)的含量主要與色素和制取的條件有關(guān)。其等離子體處理條件為電壓40 kV、時間10 s和氣體流速60 mL/min，巴氏殺菌處理條件為處理溫度 70 ℃，時間 30 min。啤酒色度由L*、a*和b*值計算得出色差值ΔE，可以看出這種精釀啤酒屬于濃色啤酒[17]。三者經(jīng)過對比，等離子體殺菌處理后和未經(jīng)處理的精釀的色度比較相近。泡持性是啤酒泡沫能維持的時間，啤酒中的表面活性物質(zhì)能降低表面張力，可以使泡沫更加持久，泡持性越長越好?？梢钥闯霭褪蠚⒕莩中员任刺幚淼木勂【婆莩中詼p少了一半，說明巴氏殺菌影響了啤酒的外觀評價以及感官分析。

表6 色度和泡持度變化Table 6 Variation of color and bubble holdup

2.6 pH值分析結(jié)果

pH對啤酒中渾濁的產(chǎn)生都有顯著的影響[23]。釀造所用水的特性影響著啤酒風(fēng)味，pH值過低可能是是雜菌污染所導(dǎo)致的，pH值過高影響糖化過程的作用和蛋白質(zhì)的凝固。其等離子體處理條件為電壓40 kV、時間10 s、氣體流速60 mL/min，巴氏殺菌處理條件為處理溫度 70 ℃，時間30 min。如表7所示，三者的pH值的變化不對，說明等離子和巴氏殺菌對精釀啤酒的酸堿度影響不大。

表7 pH值變化Table 7 pH change

3 結(jié)論

利用低溫等離子體連續(xù)處理精釀啤酒中菌落總數(shù)、酵母菌和大腸桿菌以及色澤、亮度、泡持度和 pH值的變化。與巴氏殺菌進(jìn)行對比，殺菌率幾乎相同，但是等離子體殺菌的品質(zhì)比巴氏殺菌更好。當(dāng)電壓為40 kV，處理時間為10 s時，菌落總數(shù)、酵母菌和大腸桿菌的殺菌率為99.1%、97.6%和 99.9%，菌落總數(shù)和大腸桿菌均到達(dá)國標(biāo)。同時亮度、色澤、泡持度以及 pH值分別為36 cd/m2、29.41 EBC、318 s、4.7，都與精釀啤酒相接近。利用實驗設(shè)計，通過響應(yīng)面建立了低溫等離子體殺滅菌落總數(shù)、酵母菌和大腸桿菌及亮度的影響的二次多項數(shù)學(xué)模型，此模型的預(yù)測值與實際值相似。本研究為飲料的低溫殺菌工藝提供參考，也為等離子體對菌落總數(shù)、酵母菌和大腸桿菌的殺菌效果提供理論依據(jù)?？梢?，低溫等離子體對精釀啤酒殺菌的應(yīng)用有著很好的前景。