抑郁模型大鼠不同腦區(qū)5-HT1A蛋白表達(dá)及加味溫膽湯的干預(yù)作用*

張 齊，楊 瑞，韋利軍，韋海英，高 月，武 麗

廣西中醫(yī)藥大學(xué)廣西中醫(yī)基礎(chǔ)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530200

隨著現(xiàn)代社會(huì)科技的進(jìn)步，經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展，高效率快節(jié)奏的工作、生活方式，致使人們的心理負(fù)荷不斷加重，由心理、社會(huì)環(huán)境等因素導(dǎo)致的精神、心理和心身疾病的發(fā)病率日漸增高，在我國(guó)疾病流行譜中的地位顯著上升，尤其抑郁癥已經(jīng)成為當(dāng)今社會(huì)的多發(fā)病、常見病，是全球面臨的重大公共衛(wèi)生問題［1-3］。在最新中國(guó)精神疾病流行研究中發(fā)現(xiàn)抑郁癥已成為精神障礙患病率排名第二位的疾病，終生患病率高達(dá)7.4%。抑郁癥患者的發(fā)病機(jī)制與“邊緣系統(tǒng)-皮層-紋狀體-蒼白球-丘腦”神經(jīng)環(huán)路關(guān)系密切，神經(jīng)影像學(xué)研究發(fā)現(xiàn)額葉、扣帶回、海馬、基底節(jié)等腦區(qū)的結(jié)構(gòu)及功能連接改變可導(dǎo)致抑郁癥的發(fā)生［4-6］。

抑郁癥屬中醫(yī)“郁證”范疇，是由情志不舒，氣機(jī)郁滯引起的一類病證。主要表現(xiàn)為心情抑郁、情緒不寧、脅肋脹痛，或易怒善哭，以及咽中如有異物梗阻、失眠等各種復(fù)雜癥狀［7-8］。情志致郁理論在明代已經(jīng)形成，而且隨著現(xiàn)代社會(huì)競(jìng)爭(zhēng)的加劇，生活壓力增大而日益受到重視。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)結(jié)合社會(huì)文化、心理、遺傳等各因素，強(qiáng)調(diào)了失敗的生活事件引起的情志不舒在抑郁癥發(fā)病中的重要促發(fā)作用。升降平調(diào)為旨的中藥復(fù)方溫膽湯出自姚僧垣《集驗(yàn)方》，全方寒溫平調(diào)、升降并用，即可理氣解郁，又可降逆化痰，臨床實(shí)踐證實(shí)對(duì)情志具有雙向調(diào)節(jié)作用，但機(jī)制尚未闡明。因此，本課題在前期研究工作的基礎(chǔ)上，以抑郁模型大鼠海馬、下丘腦、前額皮質(zhì)、杏仁核不同腦區(qū)5-HT1A受體蛋白表達(dá)變化為切入點(diǎn)，比較抑郁模型大鼠不同腦區(qū)5-HT1A受體蛋白表達(dá)差異，探討加味溫膽湯“升降平調(diào)”抗抑郁作用的神經(jīng)生化機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與分組選用SPF級(jí)雄性SD大鼠，體質(zhì)量180～200 g（購(gòu)自湖南斯萊克達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司），動(dòng)物合格證號(hào)：SYXK（桂）2019-0001。大鼠造模前進(jìn)行曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)，將行為學(xué)評(píng)分相近的32只大鼠隨機(jī)分為抑郁模型組、抑郁中藥組、抑郁西藥組、正常對(duì)照組各8只。

1.2 藥物制備百憂解（禮來(lái)蘇州制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字520160029，規(guī)格：20 mg/片）。加味溫膽湯藥物組成：枳實(shí)2枚，竹茹6 g，半夏6 g，橘皮9 g，生姜12 g，甘草3 g，石菖蒲9 g，合歡花12 g。經(jīng)中藥植化室鑒定后按照標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程煎煮，煎煮液濃縮成浸膏，4 ℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 儀器與試劑蛋白核酸凝膠電泳轉(zhuǎn)印系統(tǒng)（BIO-RAD，Mini Protean Tetra Cell Mini Transblot cell）；電泳儀（BIO-RAD，PowerPac Universal）；凝膠成像分析系統(tǒng)（BIO-RAD，ChemiDoc）；小動(dòng)物行為記錄分析系統(tǒng)（上海軟隆，Anymaze）；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（Thermo Fisher，ST16R）；5×蛋白上樣緩沖液（Solarbio，P1040）；ECL超敏發(fā)光液（Solarbio，PE0010）；十二烷基磺酸鈉（Solarbio，S8010）；30%丙烯酰胺甘氨酸（Solarbio，A1011）；5HT1A Receptor兔多克隆抗體（Abcam，ab85615）；辣根酶標(biāo)記山羊抗兔lgG（Abcam，ab205718）。

1.4 方法

1.4.1 模型制備與評(píng)價(jià)

1.4.1.1 慢性輕度不可預(yù)見性 應(yīng)激抑郁動(dòng)物模型［9］自分組之日起，抑郁模型組及抑郁中、西藥組接受21天各種未預(yù)知的應(yīng)激，包括通宵照明，24 h禁食，24 h禁水，45 ℃烘箱熱烘5 min，4 ℃冷水游泳5 min，夾尾l min，高速水平振蕩3 min，懸尾l min，100伏電擊足底l min等9種刺激，21天內(nèi)隨機(jī)安排每日給予1種刺激，同一種刺激不能連續(xù)出現(xiàn)，每種刺激出現(xiàn)2～3次，使動(dòng)物不能預(yù)知刺激方式。

1.4.1.2 動(dòng)物模型行為學(xué)評(píng)價(jià)［10］曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)（Open-field法）是比較常用而客觀的動(dòng)物模型行為學(xué)研究方法。將大鼠置于敞箱底面的中心方格內(nèi)，以動(dòng)物穿越底面的格數(shù)為水平運(yùn)動(dòng)次數(shù)，反映動(dòng)物的活動(dòng)度；以后肢直立次數(shù)（兩前爪騰空或攀附箱壁）為垂直運(yùn)動(dòng)次數(shù)，反映動(dòng)物對(duì)新鮮環(huán)境的好奇程度。記錄水平運(yùn)動(dòng)次數(shù)及垂直運(yùn)動(dòng)次數(shù)，每只大鼠測(cè)定1次，每次3 min，用清水和75%酒精依次徹底清潔敞箱后，再進(jìn)行下一只大鼠的觀察。

1.4.2 藥物干預(yù)方法 造模后開始給藥，給藥時(shí)間為35天，抑郁中藥組胃飼加味溫膽湯藥液12 g/kg；抑郁西藥組胃飼百憂解1.8 mg/kg，以上各組藥物用0.5%羧甲基纖維素溶液配制，各組均給相同體積的受試藥物0.1 mL/10 g，每日1次。抑郁模型組和正常對(duì)照組胃飼等容量生理鹽水，所有動(dòng)物自由進(jìn)食和飲水，每日8：00開始給藥，干預(yù)過程中抑郁中藥組大鼠死亡2只。

1.4.3 取材方法 末次給藥結(jié)束，行為學(xué)檢測(cè)之后，10%水合氯醛（0.3～0.4 mL/100 g體質(zhì)量）腹腔麻醉各組大鼠，迅速斷頭、冰上取腦，冰上分離前額皮質(zhì)、海馬CA3區(qū)、下丘腦及杏仁核，剪碎，加入預(yù)冷1.5 mL裂解緩沖液，冰上勻漿，冰上孵育30 min，將勻漿液轉(zhuǎn)移至1.5 mL的EP管，4 ℃離心半徑16 cm，10000 r/min離心10 min，取上清，再離心10 min，取上清，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.4 5-HT1A蛋白Western blot檢測(cè)方法［11］提取前額皮質(zhì)、杏仁核、下丘腦及海馬CA3區(qū)組織中總蛋白，BCA蛋白定量法測(cè)定各腦區(qū)蛋白濃度，根據(jù)蛋白濃度，以40 μg/孔的蛋白量上樣電泳，各腦區(qū)蛋白經(jīng)轉(zhuǎn)膜封閉后4 ℃分別與一抗5-HT1A（1∶1500）、β-actin（1∶1500）蛋白搖床過夜；次日分別與辣根酶標(biāo)記山羊抗兔lgG（1∶2000）結(jié)合反應(yīng)，ECL發(fā)光顯色后于凝膠成像分析系統(tǒng)中曝光測(cè)定條帶灰度值，采用Image J軟件對(duì)圖像進(jìn)行光密度值分析，以β-actin作內(nèi)參蛋白，分析目的蛋白灰度值/內(nèi)參蛋白灰度值比值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 26.0軟件分析數(shù)據(jù)，以±s表示，組間比較采用單因素方差分析，方差不齊時(shí)采用Kruskal-Wallis H檢測(cè)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠行為學(xué)抑郁模型大鼠水平運(yùn)動(dòng)次數(shù)、垂直運(yùn)動(dòng)次數(shù)及總路程較正常對(duì)照組減少（P＜0.05），加味溫膽湯能改善抑郁模型大鼠行為表現(xiàn)（P＜0.05），百憂解只對(duì)總路程有影響（P＜0.01）。見表1。

表1 各組大鼠行為學(xué)比較（±s）

表1 各組大鼠行為學(xué)比較（±s）

注：a表示與正常對(duì)照組比較，P＜0.01；b表示與抑郁模型組比較，P＜0.01

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2.2 大鼠不同腦區(qū)5-HT1A蛋白表達(dá)抑郁模型組大鼠海馬CA3區(qū)5-HT1A蛋白表達(dá)升高，加味溫膽湯能降低CA3區(qū)5-HT1A蛋白表達(dá)（P＜0.05），百憂解能提高杏仁核5-HT1A蛋白表達(dá)（P＜0.05）。見表2及圖1。

表2 各組大鼠不同腦區(qū)5-HT1A蛋白相對(duì)表達(dá)水平比較（±s）

表2 各組大鼠不同腦區(qū)5-HT1A蛋白相對(duì)表達(dá)水平比較（±s）

注：a表示與正常對(duì)照組比較，P＜0.01；b表示與抑郁模型組比較，P＜0.01

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圖1 不同腦區(qū)5-H1A蛋白相對(duì)表達(dá)情況

3 討論

無(wú)論是新型抗抑郁藥物還是傳統(tǒng)抗抑郁藥物，在治療抑郁癥過程中都會(huì)出現(xiàn)諸多不良反應(yīng)。三環(huán)類抗抑郁藥（tricyclic antidepressant，TCA）為第一代單胺再攝取抑制劑，臨床用藥包括阿米替林、丙咪嗪以及多慮平，不良反應(yīng)主要源于抗膽堿作用，可能造成患者便秘、尿潴留及視力模糊等情況，更有甚者會(huì)造成患者體位性低血壓、心律失常以及心肌梗死等［12-15］。選擇性5-HT再攝取制劑副作用小，患者依從性較好，但有一定耐受性，也有常見的不良反應(yīng)，包括惡心、頭痛、腹瀉、激越、失眠、嗜睡、眩暈、顫抖、性功能障礙［16-18］。另外，帕羅西汀有體位性低血壓，氟西汀可致再生障礙性貧血等副反應(yīng)［19-25］。中醫(yī)藥因擅長(zhǎng)身心整體論治而在疾病的防治中具有一定優(yōu)勢(shì)，中藥復(fù)方以多成分、多環(huán)節(jié)、多層次、多靶點(diǎn)的藥理學(xué)作用見長(zhǎng)［2，21-26］。因此，從天然藥物和中藥復(fù)方中尋找、研制療效好、副作用小、適合長(zhǎng)期服用的抗抑郁藥日益受到重視。

本研究在中醫(yī)情志理論指導(dǎo)下，在前期工作基礎(chǔ)上，認(rèn)為寒溫平調(diào)、升降并用的中藥復(fù)方加味溫膽湯可能通過調(diào)節(jié)情緒神經(jīng)回路不同腦區(qū)的5-HT1A蛋白變化發(fā)揮抗抑郁情志調(diào)節(jié)作用。本研究結(jié)果表明，抑郁模型大鼠不同腦區(qū)5-HT1A蛋白表達(dá)不一致，抑郁模型大鼠主要表現(xiàn)為海馬CA3區(qū)5-HT1A蛋白表達(dá)升高，而加味溫膽湯可能通過降低抑郁模型大鼠海馬CA3區(qū)5-HT1A蛋白表達(dá)，從而實(shí)現(xiàn)抗抑郁、情志調(diào)節(jié)作用，但詳細(xì)機(jī)制有待進(jìn)一步闡明。