艾葉油GC-FP 研究

★ 黎艷剛 李麗云 孫文強(qiáng) 周云龍 朱海 丁江生（云南省藥物研究所/云南省中藥和民族藥新藥創(chuàng)制企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 昆明 650111）

中藥指紋圖譜是從物質(zhì)基礎(chǔ)角度出發(fā)，運(yùn)用現(xiàn)代分析測(cè)試技術(shù)對(duì)不同種類或者產(chǎn)地的中藥材經(jīng)預(yù)處理后通過(guò)一定的構(gòu)建辦法得到的能體現(xiàn)該種藥材質(zhì)量的色譜或光譜圖，是一種綜合的、可量化的鑒定手段。作為一種能整體反映中藥內(nèi)部成分的新技術(shù)，中藥指紋圖譜是目前公認(rèn)的較為有效的中藥質(zhì)量控制技術(shù)，可作為鑒別中藥真?zhèn)魏蛢?yōu)劣的依據(jù)［1］。

艾葉是我國(guó)傳統(tǒng)中藥材，為菊科植物艾的干燥葉，夏季花未開(kāi)時(shí)采摘，除去雜質(zhì)，曬干［2］；最早在《詩(shī)經(jīng)》中就有記載，主產(chǎn)于河南、河北、安徽、湖北、山東、江西等地［3］。其化學(xué)成分主要有揮發(fā)油、黃酮類、三萜類、鞣質(zhì)及微量元素等［4］，具有溫經(jīng)止血、散寒止痛等作用［2］，其中揮發(fā)油已成為研究的熱點(diǎn)，主要成分有α-蒎烯、β-側(cè)柏酮、樟腦、反式石竹烯等［5］。目前已應(yīng)用于藥品、食品、保健品等領(lǐng)域，開(kāi)發(fā)前景廣闊。

艾葉油為菊科植物艾葉經(jīng)水蒸氣蒸餾提取出來(lái)的揮發(fā)油，具有抗菌、消炎、平喘、祛痰等活性［6-7］。艾葉油化學(xué)成分復(fù)雜，且各成分含量存在較大差異［8］，2020 年版《中華人民共和國(guó)藥典》艾葉藥材的含量測(cè)定只控制了桉油精和龍腦的含量，1977 年版《中華人民共和國(guó)藥典》艾葉油的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)沿用至今，該質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)未對(duì)含量進(jìn)行控制，且現(xiàn)有文獻(xiàn)未見(jiàn)艾葉油氣相色譜指紋圖譜的報(bào)道。故采用GC 法建立了艾葉油氣相色譜指紋圖譜的研究方法，以更全面、準(zhǔn)確、有效地控制艾葉油的質(zhì)量。

1 材料與方法

1.1 儀器

Agilent 6890N 氣 相 色 譜 儀（配 有 自 動(dòng) 進(jìn)樣器、柱溫箱、FID 檢測(cè)器和Agilent 色譜工作站，美國(guó)Agilent 公司）；SPB-3 全自動(dòng)空氣發(fā)生器（北京中惠普分析技術(shù)研究所）；載氣為高純氮?dú)猓?9.999%）；燃?xì)鉃楦呒儦錃猓?9.999%）；EX125ZH 電子天平（奧豪斯儀器有限公司）；2012 版《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》（V2.0）。

1.2 試藥

α-蒎烯對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)為110897-201803，純度為99.90%）；桉油精對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)為110788-201707，純度為100.00%）；右旋龍腦對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)為110688-201602，純度為99.60%）；β-石竹烯對(duì)照品（PaNPH 公司，批號(hào)為FC040301，純度為94.90%）；艾葉油樣品來(lái)源于不同的廠家及實(shí)驗(yàn)室提取，見(jiàn)表1；正己烷為分析純。

1.3 色譜條件

BD-1 毛細(xì)管柱（30 m×0.32 mm×0.25 μm）；進(jìn)樣口溫度280 ℃；FID 檢測(cè)器溫度280 ℃；柱溫40 ℃，保持5 min，以1.5 ℃/min 升至70 ℃，再以5 ℃/min 升至200 ℃，保持5 min；流速：1 mL/min；進(jìn)樣量：1 μL；分流比為10∶1。

1.4 對(duì)照品溶液的制備

分別稱取適量的α-蒎烯、桉油精、右旋龍腦、β-石竹烯，用正己烷制成混合對(duì)照品溶液。

1.5 自提揮發(fā)油的制備

按2020 年版《中華人民共和國(guó)藥典》四部（2204 揮發(fā)油測(cè)定方法）用法進(jìn)行操作。

1.6 供試品溶液的制備

精密稱取，艾葉油樣品50 mg，置50 mL 量瓶中，加正己烷至刻度線搖勻，濾過(guò)，取其續(xù)濾液作為供試品溶液。

1.7 方法學(xué)考察

1.7.1 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取同一樣品（編號(hào)S1），按“1.6”項(xiàng)下方法制備供試品溶液1份，分別在0，2，4，6，8，10，12，18 和24 h 按“1.3”的色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)。

1.7.2 精密度實(shí)驗(yàn) 取同一樣品（編號(hào)S1），按“1.6”項(xiàng)下方法制備供試品溶液1 份，按“1.3”的色譜條件連續(xù)測(cè)定6 次。

1.7.3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取同一樣品（編號(hào)S1），按“1.6”項(xiàng)下方法制備供試品溶液6 份，按“1.3”的色譜條件進(jìn)行測(cè)定。

1.8 供試品測(cè)定

取11 批不同來(lái)源的艾葉油，按“1.6”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“1.3”的色譜條件進(jìn)行測(cè)定。

2 結(jié)果

2.1 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

以桉油精的保留時(shí)間為參照，計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD均小于0.5%；以桉油精的峰面積為參照，計(jì)算各共有峰的相對(duì)峰面積，各共有峰相對(duì)峰面積RSD均小于3.0%，表明樣品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.2 精密度實(shí)驗(yàn)

以桉油精的保留時(shí)間為參照，計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD均小于0.5%；以桉油精的峰面積為參照，計(jì)算各共有峰的相對(duì)峰面積，各共有峰相對(duì)峰面積RSD均小于3.0%，表明儀器精密度良好。

2.3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

以桉油精的保留時(shí)間為參照，計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD均小于0.5%；以桉油精的峰面積為參照，計(jì)算各共有峰的相對(duì)峰面積，各共有峰相對(duì)峰面積RSD均小于3.0%，表明具有較好的重現(xiàn)性。

2.4 艾葉油指紋圖譜的建立與分析

采用11 批不同來(lái)源的艾葉油建立艾葉油的GC 指紋圖譜，見(jiàn)圖1。以桉油精（S）為參照峰，采用2012 版《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》（V2.0）處理數(shù)據(jù)，經(jīng)多點(diǎn)校正，以中位數(shù)法生成對(duì)照指紋圖譜，并計(jì)算各艾葉油樣品圖譜與對(duì)照指紋圖譜的相似度。結(jié)果11 批艾葉油有17 個(gè)共有峰，其指紋圖譜匹配圖見(jiàn)圖1B，經(jīng)過(guò)與對(duì)照品對(duì)比，確認(rèn)了4 個(gè)特征指紋峰，即共有峰1 為α-蒎烯、共有峰6（S）為桉油精、共有峰8 為右旋龍腦、共有峰13 為β-石竹烯。見(jiàn)表1。

表1 艾葉油來(lái)源信息及GC相似度計(jì)算結(jié)果

江西百草藥業(yè)生產(chǎn)的艾葉油和康圣堂生產(chǎn)的艾葉油GC 指紋圖譜與對(duì)照指紋圖譜之間的相似度均較高，吉水縣金海生產(chǎn)的艾葉油與實(shí)驗(yàn)室自提的艾葉油相似度較近且與對(duì)照指紋圖譜之間的相似度較低。見(jiàn)圖1。

圖1 艾葉油GC指紋圖譜

2.5 艾葉油樣品聚類分析

以GC 指紋圖譜共有峰相對(duì)峰面積作為特征指標(biāo)，采用SPSS 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)艾葉油進(jìn)行聚類分析，采用組間均連法，以歐氏距離為測(cè)度進(jìn)行分類處理，聚類譜系見(jiàn)圖2。從聚類結(jié)果可知S1，S3，S2歸為第一類（百草藥業(yè)艾葉油）；S6，S7，S8，S5歸為第二類（康盛堂艾葉油）；S10，S11，S4，S9歸為第三類（金海及自提艾葉油）。

圖2 艾葉油樣品聚類分析樹(shù)狀圖

3 結(jié)論

采用國(guó)家藥典委員會(huì)的相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)計(jì)算的相似程度和SPSS 系統(tǒng)軟件進(jìn)行的聚類分析結(jié)果其相似性較強(qiáng)，都能將金海及自提的區(qū)分開(kāi)，但也有著一定的區(qū)別，結(jié)合2 種分析方法，發(fā)揮各自優(yōu)勢(shì)，能有效地區(qū)分不同來(lái)源的艾葉油，為臨床用藥提供科學(xué)參考依據(jù)。

4 討論

艾葉油中含有α-蒎烯、桉油精、側(cè)柏酮、右旋龍腦、β-石竹烯等揮發(fā)性成分，2020 年版《中華人民共和國(guó)藥典》艾葉藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中含量測(cè)定采用桉油精和龍腦為其質(zhì)量控制指標(biāo)。桉油精為所有艾葉油中所共有，其質(zhì)量穩(wěn)定，將其作為內(nèi)參照峰，所得相似度結(jié)果良好，各特征色譜峰均能良好對(duì)齊。

《中華人民共和國(guó)藥典》記載艾葉具有小毒［2］，據(jù)研究表明β-側(cè)柏酮［9］是有毒性的一類成分，出峰時(shí)間為29.26 min，樣品S1、S2、S3 號(hào)為未檢測(cè)到β-側(cè)柏酮，推測(cè)其原因：一是可能艾葉原藥材中不含β-側(cè)柏酮，二是艾葉油的提取廠家對(duì)艾葉油做了相應(yīng)的減毒處理。其他廠家及自提艾葉油中β-側(cè)柏酮含量較低且高低不同，說(shuō)明不同廠家及自提艾葉油中的β-側(cè)柏酮的含量與艾葉生長(zhǎng)條件、采收時(shí)期、干燥條件、儲(chǔ)藏條件、儲(chǔ)存時(shí)間等都有一定關(guān)系。

本研究所建立的艾葉油GC 指紋圖譜研究方法操作簡(jiǎn)單、重現(xiàn)性好且穩(wěn)定可靠。結(jié)合2012 版《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》（V2.0）和SPSS軟件聚類分析處理數(shù)據(jù)，能有效判別不同廠家及自提艾葉油之間的差異，能初步區(qū)別并推測(cè)艾葉油的生產(chǎn)廠家，為中醫(yī)臨床用藥提供科學(xué)依據(jù)。此外，本研究所建立的檢測(cè)方法還可以用于艾葉油中α-蒎烯、桉油精、右旋龍腦、β-石竹烯4 個(gè)主要活性成分的含量測(cè)定，為艾葉油的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供了參考。