左金丸治療寒熱錯雜型潰瘍性結腸炎的臨床觀察及機制研究

★ 吳麗紅 李冰瑩 徐志強 胡家麗 崔曼曼 肖宵 占傳宇 肖曾華 張磊昌（.江西中醫(yī)藥大學 南昌 330004；.江西中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院 南昌 330006）

潰瘍性結腸炎（ulcerative colitis，UC）是一種以黏膜炎癥和潰瘍?yōu)樘卣鞯穆詮桶l(fā)性疾病，病位多在結腸與直腸［1］。常見表現(xiàn)為腹瀉、腹痛、血液黏性樣便，伴全身乏力、食欲不振、發(fā)熱等［2］。該病反復發(fā)作，遷延難愈，近20 年來UC 發(fā)病率顯著增加，是世界衛(wèi)生組織認可的難治病之一［3］。目前UC 的病因尚不明確，部分學者認為免疫失衡作為重要原因，與基因突變、遺傳易感、腦腸軸紊亂相結合貫穿UC 發(fā)病的始終［4］。研究證明PI3K/AKT/mTOR 信號通路參與了UC 發(fā)展的關鍵節(jié)點［5-7］，通過抑制PI3K/AKT 通路中相關蛋白的磷酸化水平，可以減少UC 中炎癥介質的釋放，改善腸黏膜損傷［8］；而mTOR 作為AKT 下游重要的效應學分子，對調控細胞增殖、炎癥反應具有重要影響［9］。

潰瘍性結腸炎的臨床主要用藥為5-氨基水楊酸類藥物、糖皮質激素與免疫抑制劑。這些藥物能夠暫時緩解疾病癥狀，但是長期使用會導致不良反應，如藥物依賴性，腎毒性，感染風險增加等［10］。中醫(yī)藥治療UC 具有很大的優(yōu)勢，既能長期維持緩解期并降低復發(fā)率，又能減少胃腸道反應，不易造成并發(fā)癥。有較多動物實驗及臨床研究證實了左金丸對UC 具有治療作用［11-16］，我們運用左金丸治療UC，是取其“寒溫并用、辛開苦降”的組方配伍特點［17］。左金丸藥理作用廣泛，有較顯著的抑菌與抗炎作用，可以增加CD8+T 細胞［18］。吳甜甜等［16］通過動物實驗發(fā)現(xiàn)左金丸可以通過抑制JAK1/STAT3信號通路從而調節(jié)中樞免疫記憶性T 細胞與效應免疫記憶性T 細胞之間的平衡，進而治療UC。本研究是為了討論左金丸治療寒熱錯雜型潰瘍性結腸炎的效果，并運用RT-PCR 檢測血清中PI3K、AKT 和mTOR mRNA 表達，初步探討左金丸通過PI3K/AKT/mTOR 信號通路調節(jié)炎癥因子水平，進而治療UC?，F(xiàn)將此次研究所得作以下結果可供參考。

1 研究資料與方法

1.1 研究對象

以尊重受試者隱私及受試者自愿為原則，招募2020 年10 月－2021 年10 月在江西中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院肛腸科住院的潰瘍性結腸炎患者48 例。2 組患者性別、年齡、病程、病情輕重程度見表1。所有患者均依照《炎癥性腸病診斷與治療的共識意見（2018 年北京）》［19］活動期輕中度UC 的診斷標準：（1）臨床表現(xiàn)主要為膿血便、里急后重、肛門灼熱等，癥狀持續(xù)或反復發(fā)作；（2）結合腸鏡檢查和黏膜組織學檢查，排除感染性和其他非感染性結腸炎后確診；（3）改良Mayo 評分為3～10 分。排除標準：（1）病情屬于重度者或者處于緩解期；（2）近3 個月或正在使用激素治療或者生物制劑者；（3）合并嚴重并發(fā)癥者，如腸梗阻、中毒性巨結腸、腸上皮癌變、腸穿孔等；（4）處于妊娠期或者哺乳期的婦女；（5）合并嚴重肝功能、腎功能不全及嚴重心腦血管疾病者；（6）目前正在參加其他臨床試驗者。寒熱錯雜證型診斷標準參照《潰瘍性結腸炎中西醫(yī)結合診療共識意見》［20］制定，主癥：（1）腹瀉，便下黏液膿血；（2）腹痛；（3）肛門灼熱；（4）黏液膿血便。次癥：（1）畏寒怕冷；（2）口渴不欲飲；（3）饑不欲食；（4）里急后重。符合主癥其中的2 項，次癥其中的2 項，即可診斷。

表1 2組患者基線資料比較（s，n=24）

表1 2組患者基線資料比較（s，n=24）

研究對象按照隨機數(shù)字表法分為對照組及觀察組，各24 例，2 組患者性別、年齡、病程、病情輕重程度均無統(tǒng)計學差異（P>0.05），具有可比性。

1.2 研究方法

實驗藥物對照組予美沙拉嗪腸溶片（葵花藥業(yè)集團佳木斯鹿靈制藥有限公司，國藥準字H19980148，規(guī)格：0.25 g），每次1 g，每天3 次；觀察組予左金丸（江西省中醫(yī)院制劑室）治療，黃連30 g，吳茱萸5 g，若見患者腹瀉嚴重，則酌情將黃連用量減至15 g；胸悶少食、便溏者，則在原方基礎上加黨參10 g、陳皮9 g、白術9 g；噫氣不暢，口苦口干伴胃中灼熱者，加柴胡9 g、香附9 g、川楝子6 g；心中煩熱伴里急后重者，加白頭翁9 g、敗醬草9 g。服用方法：水煎服，水煮300 mL，每日2劑，每劑150 mL，分早晚溫服。2 組療程均為8 周，隨訪3 個月。

實驗儀器與試劑：RT-PCR 儀（Eppenndorf Centrifuge公司，德國）；RT-PCR 引物（上海生工生物工程）；低溫高速離心機（Eppendorf 公司，德國）；倒置顯微鏡（Olympus 公司，日本）；96 孔板（耐思，中國）。

2 觀察指標

2.1 主要療效指標

臨床總有效率參照《潰瘍性結腸炎中醫(yī)診療專家共識（2017 年）》，總有效率＝（臨床緩解+臨床有效）/該組總人數(shù)×100%。其中臨床有效的評價標準為總Mayo 評分相對于基線值的降幅≥30%及≥3 分，且便血的分項評分降幅≥1 分或該分項評分為0 分或1 分；臨床緩解的評價標準為總Mayo評分≤2 分且無單個分項評分＞1 分；臨床無效的評價標準為總Mayo 評分較基線值無下降。

2.2 次要療效指標

（1）中醫(yī)證候療效評價：依照《潰瘍性結腸炎中西醫(yī)結合診療共識意見》，觀察腹瀉、黏液膿血便、腹痛、四肢倦怠、里急后重5 個單項癥狀，按照病情輕重程度分別賦值0，2，4，6 分，于治療前后分別評估4 個單項癥狀并進行對比。（2）改良Mayo 評分：主要由排便次數(shù)、便血程度、內(nèi)鏡下情況及醫(yī)師總體評價四部分內(nèi)容構成，總分為0～12 分。見表2。

表2 改良Mayo評分表

（3）Baron 內(nèi)鏡評分標準按照黏膜圖像的病變程度分別賦值0，1，2，3 分。（4）理化指標檢測患者血清中C 反應蛋白測定（CRP)、血沉（ESR)、腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細胞介素6（IL-6），并分別進行前后及橫向對比。（5）RT-PCR 法檢測PI3K mRNA、AKT mRNA 和mTOR mRNA 的表達采用Trizol 法提取外周血單個核細胞（PBMCs）中的總RNA，紫外分光度法測定其濃度，再將其逆轉錄為cDNA，按PCR 試劑盒進行擴增，反應條件為95 ℃變性10 s，退火60 ℃30 s，循環(huán)40 個，用β-actin 作為內(nèi)參，基因引物序列。見表3。

表3 基因引物序列

（6）復發(fā)率依照2018 年《炎癥性腸病診斷與治療共識意見》，調查患者治療結束3 個月后疾病復發(fā)情況。判定標準如下：緩解期后再度出現(xiàn)腹瀉、腹痛、黏液膿血便等情況且在腸鏡下發(fā)現(xiàn)活動性炎癥。復發(fā)率＝復發(fā)例數(shù)/總例數(shù)×100%。

3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 26.0 統(tǒng)計學軟件進行分析，計量資料以均數(shù)±標準差（）表示，組內(nèi)比較采用配對資料t檢驗，組間比較采用χ2檢驗，計數(shù)資料以頻數(shù)（百分比）率表示，P<0.05 代表差異有統(tǒng)計學意義。

4 研究結果

4.1 2 組患者臨床療效比較

經(jīng)過8 周治療后2 組患者臨床療效比較，差異具有統(tǒng)計學意義（P=0.033）。見表4。

表4 2組治療前后臨床療效比較（n=24） 例

4.2 2 組患者治療前后中醫(yī)證候各項評分比較

經(jīng)過8 周治療，同組治療后患者腹瀉、黏液膿血便、腹痛、四肢倦怠和里急后重積分均顯著下降（P<0.05）。觀察組患者腹瀉、黏液膿血便、四肢倦怠和里急后重積分下降情況低于對照組（P<0.05），可以證明左金丸治療腹瀉、黏液膿血便、四肢倦怠和里急后重有明顯效果。觀察組患者腹痛積分與對照組相比，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），說明在腹痛改善方面，單純西醫(yī)治療和中醫(yī)治療效果相似。見表5。

表5 2組治療前后中醫(yī)證候各項評分比較（=24） 分

表5 2組治療前后中醫(yī)證候各項評分比較（=24） 分

注：與同組治療前比較，*P<0.05；與對照組比較，*#P<0.05。

4.3 2 組患者治療前后腸鏡評分及改良Mayo 評分比較

經(jīng)過8 周治療，2 組治療后患者腸鏡評分與改良Mayo 評分均顯著下降（P<0.05），腸鏡下黏膜出血情況均有明顯好轉，且觀察組患者與對照組相比腸鏡評分及改良Mayo 評分均降低（P<0.05）。見圖1、表6。

圖1 2組治療前后腸鏡下圖片比較

表6 2組治療前后腸鏡結果及改良Mayo評分比較s，n=24） 分

表6 2組治療前后腸鏡結果及改良Mayo評分比較s，n=24） 分

注：與同組治療前比較，*P<0.05；與對照組比較，#P<0.05。

4.4 2 組患者治療前后CRP 及ESR 水平變化比較

2 組治療后CRP 及ESR 水平均下降（P<0.05），且觀察組患者的CRP 及ESR 水平與對照組相比較均降低（P<0.05）。見表7。

表7 2組治療前后CRP及ESR水平比較s，n=24）

表7 2組治療前后CRP及ESR水平比較s，n=24）

注：與同組治療前比較，*P<0.05；與對照組比較，#P<0.05。

4.5 2 組患者治療前后TNF-α 及IL-6 水平變化比較

經(jīng)過8 周治療，同組TNF-α 及IL-6 水平均下降（P<0.05），觀察組患者的TNF-α 及IL-6 水平與對照組相比均降低（P<0.05），表明左金丸在降低炎癥水平、修復受損的腸黏膜方面有顯著療效且優(yōu)于單純西醫(yī)治療。見表8。

表8 2組治療前后TNF-α及IL-6水平比較s，n=24） nmol/L

表8 2組治療前后TNF-α及IL-6水平比較s，n=24） nmol/L

注：與同組治療前比較，*P<0.05；與對照組比較，#P<0.05。

4.6 2 組患者治療前后PI3K mRNA、AKT mRNA和mTOR mRNA 表達水平比較

同組治療后PI3K mRNA、AKT mRNA 和mTOR mRNA 的表達水平均下降（P<0.05），且觀察組患者的PI3K mRNA、AKT mRNA 和mTOR mRNA 的表達水平與對照組比較均降低（P<0.05）。見圖2、圖3、圖4。

圖3 2組治療前后AKT mRNA表達水平

圖4 2組治療前后mTOR mRNA表達水平

4.7 2 組復發(fā)率比較

通過3 個月后對患者進行復查，發(fā)現(xiàn)對照組復發(fā)8 例，觀察組復發(fā)3 例，2 組之間具有差異性（P<0.05），說明觀察組復發(fā)率優(yōu)于對照組。見表9。

表9 2組復發(fā)率比較（n=24） 例

5 討論

UC 是炎癥性腸病的主要亞型之一［21］，其致病因素主要包括環(huán)境、感染、免疫、心理因素幾個方面。研究表明，免疫應答失調導致的腸黏膜炎癥和腸上皮細胞損傷是UC 發(fā)病的關鍵環(huán)節(jié)［22］。中醫(yī)將UC 歸屬為“久痢”“痢疾”“泄瀉”“休息痢”“腸澼”“腸風”等范疇，常見病理因素為濕熱、熱毒、寒濕、氣滯、血瘀、瘀熱、痰濁、食積，各種因素相互錯雜［23］?！稘冃越Y腸炎中醫(yī)診療專家共識意見（2017）》將本病分大腸濕熱、熱毒熾盛、脾虛濕阻、脾腎陽虛、寒熱錯雜、陰血虧虛、肝郁脾虛7 個證型，且由于本病虛寒熱并見，所以以寒熱錯雜型病證最為常見和棘手。左金丸作為一個中藥復方，出自《丹溪心法·火六》，由黃連與吳茱萸按6∶1 的比例組成，主治肝經(jīng)火旺之證，黃連清熱燥濕解毒，在寒熱錯雜型UC 治療中起清熱燥濕的功效，吳茱萸散寒止痛、降逆止嘔、助陽止瀉，可以治療UC 患者的泄瀉癥狀。兩藥相伍，起寒熱并用，切中中焦病機，使得氣機通暢的作用。文獻研究及大量臨床試驗［17,24-26］表明，在治療輕中度UC 時，不必拘泥于黃連、吳茱萸6∶1 的藥量比例，所以本次臨床觀察中，我們在治療以腹瀉、脾胃受損為主的病人時，酌情將黃連的藥量減至15 g，以達顧護病人脾胃之功。在具體的治療中，也注重該藥方的臨證加減。同時，藥理研究表明，左金丸中的藥物黃連的主要生物堿小檗堿，在對葡聚糖硫酸鈉誘導的小鼠結腸炎模型中有較高的預防活性［27］，它還可以顯著減少急性胃腸炎患者的大便頻次，使機型放射性腸綜合征的發(fā)生率降低。Cui 等［28］發(fā)現(xiàn)小檗堿具有調節(jié)腸道菌群的物質基礎，它可以增加結腸炎大鼠腸道真桿菌和擬桿菌的比例，抑制脫硫弧菌的豐度，緩解腸道菌群的失衡，從而調節(jié)T17 和Treg 細胞的失衡。而吳茱萸中的主要生物堿吳茱萸次堿和喹諾酮類生物堿在抗炎、抗腫瘤、促進細胞凋亡和調節(jié)腸道菌群等方面起效從而達到治療腸炎的目的［29-30］。在寒熱錯雜型潰瘍性結腸炎中運用此方，體現(xiàn)了兩個藥物之間“辛開”“苦降”相協(xié)同的治療機制。

本次研究結果顯示，經(jīng)過8 周治療，與美沙拉嗪組相比，觀察組使用左金丸后，患者腹瀉、黏液膿血便、四肢倦怠、里急后重四項中醫(yī)證候緩解更為有效，腸道癥狀和血清理化指標改善更為明顯，且對臨床緩解期患者3 個月隨訪發(fā)現(xiàn)，觀察組的復發(fā)率更低，患者的生活質量得到顯著提高。以上結果證明UC 治療中左金丸的運用有效緩解了患者臨床癥狀，促進患者腸黏膜的愈合，降低疾病活動性。

基于本課題組的前期網(wǎng)絡藥理學研究，左金丸通過PI3K/AKT/mTOR 信號通路在炎癥反應、分解代謝過程、血管生成及細胞凋亡等多種過程調節(jié)UC。PI3K 作為一種胞內(nèi)磷脂酰肌醇激酶，參與細胞的增殖、分化、凋亡，與多中國癌癥聯(lián)系密切。AKT，是PI3K 下游的主要效應物， AKT 的活化會磷酸化多種下游因子，進而調節(jié)細胞的功能，且其可通過磷酸化下游靶蛋白進而發(fā)揮抗凋亡的作用。mTOR 是PI3K/AKT 下游的關鍵激酶，與腫瘤細胞的增殖、生長、存活和血管生成密切相關。PI3K/AKT/mTOR 信號通路是機體調節(jié)細胞增殖分化、凋亡、自噬的重要途徑，該通路的過度活化會促使腸上皮細胞大量增殖，引起腸道內(nèi)炎癥因子失衡，導致UC 的發(fā)病。同時，炎癥的持續(xù)刺激也會使該通路過度活化［31］。激活該信號通路會影響重要促炎因子TNF-α 的基因轉錄，并進一步誘導其他炎癥介質如IL-6 的分泌，兩種炎癥介質的過度產(chǎn)生會導致細胞沉浸在慢性炎癥因子環(huán)境中，從而導致UC 遷延難愈［32］，所以抑制信號通路的活化與抑制炎癥因子和炎癥介質的產(chǎn)生和增長對治療UC 具有重要意義［33-34］。RT-PCR 結果可見，觀察組PI3KmRNA、AKTmRNA 和mTORmRNA 的表達顯著下調，表明左金丸可能通過抑制PI3K/AKT/mTOR 信號通路過度活化，來治療UC。同時，經(jīng)過治療后TNF-α 和IL-6 水平降低，臨床癥狀好轉，也體現(xiàn)了促炎因子與該通路之間密切相關。

綜上，左金丸能夠顯著改善UC 患者的腸黏膜損傷，緩解患者臨床癥狀，降低疾病活動度，其作用機制可能與PI3K/AKT/mTOR 信號通路活化水平被抑制，從而炎癥介質分泌減少密切相關。