BMP-2蛋白通過Smad途徑對牙髓干細(xì)胞成牙本質(zhì)分化的作用機(jī)制研究

王 曄，于 淼，張 丞，張婉君，馬永平

（保定市第二醫(yī)院口腔科 河北 保定 071000）

牙源性干細(xì)胞包括牙髓干細(xì)胞、牙周膜干細(xì)胞以及根尖牙乳頭干細(xì)胞。牙髓干細(xì)胞是一種成體干細(xì)胞，一般存在于牙髓組織，具有類似于間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特性，可被誘導(dǎo)分化為成牙本質(zhì)細(xì)胞，具有成骨分化能力，所以對牙周組織再生具有重要作用。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證明，將牙髓干細(xì)胞分泌的細(xì)胞外囊泡植入大鼠無髓根管，促進(jìn)牙髓再生，在某些刺激因子作用下，牙髓干細(xì)胞可發(fā)生牙本質(zhì)再生[1-2]。BMP-2在骨再生的促進(jìn)和維持中發(fā)揮重要作用，而且是已知的骨誘導(dǎo)性生長因子之一[3]，Han等[4]的體外研究證明，BMP-2失活抑制骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞樣細(xì)胞分化。將含有人重組BMP-2載體注入顱骨缺損的大鼠體內(nèi)，可有效促進(jìn)顱骨愈合，且反復(fù)給藥并不能增強(qiáng)或減弱愈合能力[5]。BMP信號可激活其受體Smad1/5，Smad1/5信號分子可將細(xì)胞因子轉(zhuǎn)導(dǎo)信號由細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)至細(xì)胞核，調(diào)控靶基因轉(zhuǎn)錄[6]。研究報(bào)道，BMP-2/Smad信號通路與成骨分化密切相關(guān)，該信號通路激活不僅改善骨質(zhì)疏松癥，而且可促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化[7-8]。但BMP-2是否可激活Smad1/5在牙髓干細(xì)胞向成牙本質(zhì)細(xì)胞分化過程中發(fā)揮調(diào)控作用的研究甚少，因此，本研究以人牙髓干細(xì)胞為研究對象，探討B(tài)MP-2對牙髓干細(xì)胞成牙本質(zhì)分化的影響以及對Smad1/5信號通路的影響。

1 材料和方法

1.1 材料和儀器：①Smad1/5信號通路抑制劑LDN-193189購自美國Selleck公司；②CCK-8細(xì)胞活性檢測試劑盒購自日本Dojindo公司；③BCA試劑盒購自德國賽默飛世爾科技公司；④堿性磷酸酶（Alkaline phosphatase,ALP）試劑盒購自北京索萊寶科技公司；⑤Trizol試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自大連寶生物工程有限公司；⑥p-Smad1/5、Smad1/5、BMP-2和GAPDH抗體購自美國Abcam公司；⑦茜素紅購自美國Thermo Fisher Scientifie公司；牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白1(Dentin matrix protein 1,DMP1)和牙本質(zhì)涎磷蛋白(dentin sialophosphoprotein,DSPP）引物序列由上海生工生物工程股份有限公司合成；⑧可見分光光度計(jì)購自上海光學(xué)儀器五廠有限公司；⑨酶標(biāo)儀購自美國Bio-TEK公司；⑩細(xì)胞系：人牙髓干細(xì)胞(上海研生實(shí)業(yè)有限公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與分組：將人牙髓干細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2 d更換一次培養(yǎng)基，待細(xì)胞融合度達(dá)到90%時(shí)，0.25%胰蛋白酶消化、傳代。取第3代對數(shù)生長期的人牙髓干細(xì)胞，DMEM培養(yǎng)基將細(xì)胞重懸，接種于24孔板，細(xì)胞密度為3×104個(gè)/孔，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞密度約為80%時(shí)，隨機(jī)分為對照組、單純誘導(dǎo)組和抑制劑組。對照組細(xì)胞不做任何處理，單純誘導(dǎo)組細(xì)胞用濃度為100 ng/ml的BMP-2誘導(dǎo)液[9]（BMP-2溶于DMEM培養(yǎng)基）培養(yǎng)，抑制劑組細(xì)胞先用200 nmol/L的LDN-193189處理24 h后，棄去原有培養(yǎng)液，更換為BMP-2誘導(dǎo)液。培養(yǎng)14 d后，用于以下實(shí)驗(yàn)。

1.3 CCK-8法檢測人牙髓干細(xì)胞活性：收集各組細(xì)胞，制成細(xì)胞密度為1×107個(gè)/毫升的細(xì)胞懸液，接種于96孔板，每孔100 μl，培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)5 h，每孔加入CCK-8工作液10 μl，輕輕混勻后37℃孵育30 min，設(shè)置酶標(biāo)儀波長為450 nm，測定吸光度OD值，OD值越大說明活細(xì)胞活性越強(qiáng)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次。

1.4 qRT-PCR法檢測DMP1和DSPP mRNA相對表達(dá)量：收集各組細(xì)胞，4℃下Trizol試劑提取細(xì)胞中總RNA，利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA為模板，以GAPDH為內(nèi)參，進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)程序設(shè)定為：95℃預(yù)變性4 min，95℃變性5 s，56℃退火30 s，70℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)，采用2-△△CT計(jì)算DMP-1和DSPP的相對表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.5 ALP活性檢測：收集各組細(xì)胞，PBS清洗后，加入全細(xì)胞裂解液，冰上裂解10 min，4℃ 1 000 r/min離心5 min，吸取上清液，緩沖液、顯色液依次加入到上清液中，可見分光光度計(jì)檢測510 nm波長處的吸光度A值。按照說明書，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品濃度，樣品測定濃度與標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度值的比值為ALP活性。實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次。

1.6 茜素紅染色觀察礦化結(jié)節(jié)情況：取各組細(xì)胞，PBS清洗3次，每孔加入40 g/L的多聚甲醛溶液1 ml室溫固定30 min，PBS清洗3次，每孔加入40 mmol/L的茜素紅染液1 ml，室溫避光染色20 min，雙蒸水清洗4次，倒置顯微鏡下觀察礦化結(jié)節(jié)情況并拍照。實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次。

1.7 蛋白印跡法檢測BMP-2、p-Smad1/5蛋白相對表達(dá)量：收集各組細(xì)胞，PBS清洗3次，加入100 μl RIPA裂解液，冰上靜置30 min，4℃ 1 2000 r/min離心10 min，離心半徑為10 cm，收集上清，BCA法測定蛋白濃度，加入上樣緩沖液后，100℃煮沸10 min，使蛋白變性穩(wěn)定。80 V電泳20 min使蛋白至分離膠處，120 V電泳2 h，濕轉(zhuǎn)2 h，將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，TBST洗膜3次，室溫封閉1 h，BMP-2、p-Smad1/5、Smad1/5、GAPDH一抗（1:1 000）4℃孵育過夜，二抗（1:5 000）室溫孵育2 h，TBST洗膜3次，ECL法顯色，Image J計(jì)算蛋白條帶灰度值，BMP-2、p-Smad1/5、Smad1/5蛋白條帶灰度值與GAPDH蛋白條帶灰度值的比值為目的蛋白表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料均以（±s）描述，多樣本計(jì)量資料比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞活性檢測結(jié)果：細(xì)胞活性組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與對照組比較，單純誘導(dǎo)組細(xì)胞活性增強(qiáng)（P＜0.05）；與單純誘導(dǎo)組比較，抑制劑組細(xì)胞活性降低（P＜0.05）。見表2。

表2 三組細(xì)胞活性比較 （±s，n=5）

表2 三組細(xì)胞活性比較 （±s，n=5）

注：*表示與對照組比較，P＜0.05；#表示與單純誘導(dǎo)組比較，P＜0.05。

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2.2 qRT-PCR檢測結(jié)果：DSPP、DMP-1 mRNA相對表達(dá)量組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與對照組比較，單純誘導(dǎo)組、抑制劑組的DSPP、DMP-1 mRNA相對表達(dá)量升高；與單純誘導(dǎo)組比較，抑制劑組DSPP、DMP-1 mRNA相對表達(dá)量降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表3。

表3 三組細(xì)胞中DSPP、DMP-1 mRNA相對表達(dá)量比較（±s，n=5）

表3 三組細(xì)胞中DSPP、DMP-1 mRNA相對表達(dá)量比較（±s，n=5）

注：*表示與對照組比較，P＜0.05；#表示與單純誘導(dǎo)組比較，P＜0.05。

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2.3 ALP活性檢測結(jié)果：ALP活性組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與對照組比較，單純誘導(dǎo)組、抑制劑組ALP活性升高（P＜0.05）；與單純誘導(dǎo)組比較，抑制劑組ALP活性降低（P＜0.05）。見表4。

表4 三組細(xì)胞中ALP活性比較 （±s，n=5）

表4 三組細(xì)胞中ALP活性比較 （±s，n=5）

注：*表示與對照組比較，P＜0.05；#表示與單純誘導(dǎo)組比較，P＜0.05。

2.4 茜素紅染色結(jié)果：與對照組比較，單純誘導(dǎo)組礦化結(jié)節(jié)明顯增多；與單純誘導(dǎo)組比較，抑制劑組礦化結(jié)節(jié)明顯減少。見圖1。

圖1 茜素紅染色（×40）

2.5 BMP-2、p-Smad1/5蛋白相對表達(dá)量檢測結(jié)果：BMP-2、p-Smad1/5蛋白相對表達(dá)量組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與對照組比較，單純誘導(dǎo)組、抑制劑組BMP-2、p-Smad1/5蛋白相對表達(dá)量升高（P＜0.05）；與單純誘導(dǎo)組比較，抑制劑組BMP-2、p-Smad1/5蛋白相對表達(dá)量降低（P＜0.05）。見圖2、表5。

表5 三組細(xì)胞中BMP-2、p-Smad1/5蛋白相對表達(dá)量比較（±s，n=5）

表5 三組細(xì)胞中BMP-2、p-Smad1/5蛋白相對表達(dá)量比較（±s，n=5）

注：*表示與對照組比較，P＜0.05；#表示與單純誘導(dǎo)組比較，P＜0.05。

圖2 細(xì)胞中BMP-2、p-Smad1/5蛋白表達(dá)

3 討論

人牙髓干細(xì)胞存在于牙髓組織中，具有高度增殖、多向分化潛能以及無免疫排斥等特點(diǎn)，且來源廣、獲取方便，因此，被視為牙髓再生的理想種子細(xì)胞。正常狀況下，人牙髓干細(xì)胞處于靜息狀態(tài)，在某些刺激因素作用下，可分化為成牙本質(zhì)細(xì)胞、成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞以及軟骨細(xì)胞[10]。牙本質(zhì)是組成牙齒的硬組織部分，其中含有牙本質(zhì)小管，管中存在神經(jīng)纖維和液體成分，外界刺激可通過牙本質(zhì)小管傳至牙髓。當(dāng)出現(xiàn)牙齒磨損或齲齒時(shí)，牙髓干細(xì)胞可分化為成牙本質(zhì)細(xì)胞，成牙本質(zhì)細(xì)胞快速分泌大量基質(zhì)，產(chǎn)生修復(fù)性牙本質(zhì)，封閉牙本質(zhì)小管，阻斷細(xì)菌入侵，避免牙髓發(fā)生炎癥反應(yīng)造成不可逆性損傷。

BMP是一類高度保守的具有分泌作用的功能性蛋白，目前發(fā)現(xiàn)的BMP有20多種亞型，除BMP-1外，其余亞型屬于TGF-β家族。BMP活化后以二聚體的形式存在，通過作用于受體及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑觸發(fā)細(xì)胞發(fā)育。Zhong等[11]研究發(fā)現(xiàn)，長鏈非編碼RNA H19可上調(diào)人牙髓干細(xì)胞中BMP-2表達(dá)，促進(jìn)牙髓干細(xì)胞向成牙本質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化。在人牙髓干細(xì)胞和小鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞成骨分化過程中，BMP-2可增強(qiáng)ALP活性、細(xì)胞外基質(zhì)礦化和成骨基因表達(dá)[12]。體外研究表明，早期BMP-2和血管內(nèi)皮生長因子培養(yǎng)人根尖乳頭干細(xì)胞，可促進(jìn)其骨/牙源性分化[13]。成牙本質(zhì)細(xì)胞在早期分化和礦化階段，需經(jīng)歷細(xì)胞增殖和細(xì)胞外基質(zhì)合成，在此階段特異性表達(dá)ALP，高分化的成牙本質(zhì)細(xì)胞中ALP顯著高于未分化細(xì)胞，因此ALP可作為早期成牙本質(zhì)細(xì)胞分化的標(biāo)志物。膠原Ⅰ是牙本質(zhì)細(xì)胞外基質(zhì)蛋白中最豐富的蛋白，在成牙本質(zhì)細(xì)胞分化、牙本質(zhì)形成和礦化過程中具有重要作用，而研究發(fā)現(xiàn)，100 ng/ml BMP-2誘導(dǎo)液可促進(jìn)膠原Ⅰ的表達(dá)和分泌[14]，從而控制成牙本質(zhì)細(xì)胞分化以及牙本質(zhì)形成。已有研究表明，將BMP-2溶于培養(yǎng)基中，制成濃度為100 ng/ml的培養(yǎng)液，培養(yǎng)14 d后ALP活性增強(qiáng)。本研究通過BMP-2誘導(dǎo)液培養(yǎng)人牙髓干細(xì)胞，10 d后同樣檢測到ALP活性增強(qiáng)，此實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示牙髓干細(xì)胞發(fā)生成牙本質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化。

DSPP和DMP-1是評判成牙本質(zhì)細(xì)胞分化的關(guān)鍵指標(biāo)，DSPP是牙本質(zhì)中含量最為豐富的非膠原基質(zhì)，在牙本質(zhì)礦化中起重要作用，但DSPP合成后很快被酶切成牙本質(zhì)涎蛋白和牙本質(zhì)磷蛋白。既往研究表明，Bbx通過調(diào)節(jié)DSPP控制新生鼠牙根形成，DSPP轉(zhuǎn)基因小鼠可部分修復(fù)DSPP基因缺失小鼠的牙本質(zhì)缺陷[15-16]。DMP-1是成牙本質(zhì)細(xì)胞早期分化時(shí)特異性表達(dá)的磷酸性蛋白酶，通常與DSPP聯(lián)合判斷成牙本質(zhì)細(xì)胞分化情況。Ma等[17]研究發(fā)現(xiàn)，DMP-1可增強(qiáng)β-磷酸三鈣種植體在犬上頜竇底，可增強(qiáng)骨再生和骨整合。本研究中，100 ng/ml BMP-2誘導(dǎo)液培養(yǎng)后DSPP和DMP-1 mRNA相對表達(dá)量升高，茜素紅染色顯示礦化結(jié)節(jié)明顯，提示牙髓干細(xì)胞發(fā)生成牙本質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化并發(fā)生礦化。

經(jīng)典的BMP/Smads信號通路在多種疾病的骨代謝和骨分化中的作用已被廣泛報(bào)道，Yuan等[18]報(bào)道強(qiáng)直性脊柱炎中BMP/Smads信號通路的激活被抑制后，可降低成纖維細(xì)胞的成骨轉(zhuǎn)化。細(xì)胞外鈣通過放大BMP-2對Smad信號的影響促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的骨形成[19]。胰島素樣生長因子1通過激活BMP-2/Smad1/5信號通路促進(jìn)犬上頜竇黏膜干細(xì)胞成骨分化[20]。誘導(dǎo)多能干細(xì)胞實(shí)現(xiàn)牙齒再生是一種新的干細(xì)胞來源，而研究發(fā)現(xiàn)，200 nmol/L Smad1/5信號通路抑制劑LDN-193189處理多能干細(xì)胞，可抑制其成釉分化效應(yīng)[21]。本研究采用Smad1/5抑制劑LDN-193189預(yù)處理后，BMP-2誘導(dǎo)液培養(yǎng)人牙髓干細(xì)胞，蛋白印跡法檢測BMP-2和Smad1/5蛋白表達(dá)情況，結(jié)果顯示，LDN-193189可降低BMP-2誘導(dǎo)液培養(yǎng)的人牙髓干細(xì)胞中BMP-2和Smad1/5蛋白表達(dá)，提示BMP-2/Smad1/5信號通路參與調(diào)控人牙髓干細(xì)胞牙本質(zhì)分化。

綜上所述，BMP-2可促進(jìn)人牙髓干細(xì)胞成牙本質(zhì)分化，其可能是通過調(diào)節(jié)Smad1/5信號通路發(fā)揮調(diào)控作用，但本研究存在一定不足之處，BMP-2劑量選擇以及不同處理時(shí)間對牙髓干細(xì)胞成牙本質(zhì)的影響需要確定。另外，BMP-2如何調(diào)節(jié)Smad1/5信號通路以及Smad1/5信號通路激活后在促進(jìn)成牙本質(zhì)分化中具體發(fā)揮怎樣的作用需要進(jìn)一步探討。