響應(yīng)面優(yōu)化菌草靈芝水提物提取工藝及其納米乳制備技術(shù)

謝 晶, 孫連月, 周童暉, 卜建超, 方錦濤, 張皓珊, 何 菲, 李 晶, 林占熺

(1.福建農(nóng)林大學(xué)國(guó)家菌草工程技術(shù)研究中心，福建 福州 350002；2.湖南人文科技學(xué)院農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，湖南 婁底 417000；3.福建商學(xué)院，福建 福州 350012；4.福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002)

靈芝(Ganodermalucidum)為真菌門多孔菌目靈芝菌科靈芝屬的一種大型木腐真菌子實(shí)體，在我國(guó)古代被譽(yù)為仙草、瑞草，《神農(nóng)本草經(jīng)》[1]將其列為十大名藥之首.菌草靈芝是指用菌草代替木屑、椴木栽培的靈芝[2].用菌草栽培靈芝不僅可降低成本[3]，還能解決“菌林矛盾”，菌草靈芝活性有效物的含量、藥用價(jià)值均高于木屑栽培的靈芝[4]，其中多糖的含量為椴木靈芝的2 倍以上[5].

靈芝水提物精粉是將靈芝子實(shí)體經(jīng)熱水浸提、濃縮、干燥得到的靈芝浸膏粉[6].研究發(fā)現(xiàn)，靈芝水提物具有增強(qiáng)免疫力[7]、抗腫瘤[8]、保護(hù)神經(jīng)元[9]、降血糖[10]、美白以及抗衰老[11]等作用.由于靈芝水提物精粉采用熱水浸提法，無(wú)任何有機(jī)溶劑殘留的風(fēng)險(xiǎn)，能被廣泛應(yīng)用于食品、藥品、化妝品上.目前，大量的研究集中在靈芝活性成分(如多糖)提取、分析和鑒定以及活性成分的功能方面，而與靈芝水提物提取工藝相關(guān)的報(bào)道較少.

靈芝水提物中含有大量活性成分，因此，在后期貯存和應(yīng)用中會(huì)受到氧、溫度等影響，導(dǎo)致其活性降低；而納米乳粒徑較小，屬于熱力學(xué)上的穩(wěn)定膠體分散體系，能作為靈芝水提物中活性物質(zhì)的有效載體，達(dá)到不同成分間協(xié)同作用的效果[12].研究表明，復(fù)方人參皂苷納米乳能增強(qiáng)小鼠的細(xì)胞免疫和體液免疫功能[13]；經(jīng)鼻復(fù)方丹參納米乳原位凝膠與普通原位凝膠相比，對(duì)腦血管的腦靶向效率更高，且制備方法簡(jiǎn)單，劑型穩(wěn)定安全[14]；復(fù)方丹皮酚納米乳可抑制肺癌細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯和凋亡[15].目前，納米乳的制備方法有借助高速剪切、高壓均質(zhì)、超聲波等機(jī)械力的高能乳化法，也有通過(guò)相變溫度法促進(jìn)乳化的方法，還有在水包油乳化體系中常使用的相變法.后兩種方法屬于低能乳化法，是食品、醫(yī)藥、化妝品等領(lǐng)域制備納米乳的重要方法[16-18].但利用靈芝水提物制備納米乳的研究較少.

本研究以菌草靈芝為研究對(duì)象，通過(guò)單因素試驗(yàn)、Plackett-Burman設(shè)計(jì)和Box-Behnken響應(yīng)面分析法優(yōu)化菌草靈芝水提物的提取工藝，并采用偽三元相圖法篩選菌草靈芝精粉納米乳的最佳制備條件，旨在提高菌草靈芝水提物的提取效率和利用效率，為菌草靈芝產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用提供理論基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菌草鹿角靈芝切片由福建農(nóng)林大學(xué)國(guó)家菌草工程技術(shù)研究中心提供；大豆油、玉米油、橄欖油由中國(guó)糧油集團(tuán)有限公司生產(chǎn)；Tween80和Span80由廣東潤(rùn)華化工有限公司生產(chǎn)；丙三醇(甘油)由美國(guó)陶氏集團(tuán)生產(chǎn).

電熱恒溫水槽(DHG-9240A，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(R206D，上海申生科技有限公司)，高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)(5415R，德國(guó)Eppendorf公司)，電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(DHG-9240A，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)，電子天平[BSA124A，賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司]，激光粒度儀(ZS90，英高馬爾文儀器有限公司)，透射電鏡(HT7700，日本HITACHI公司).

1.2 方法

1.2.2 菌草靈芝水提物得率測(cè)定 菌草靈芝水提物得率(Y)/%=m1/m×100.式中：m1為恒重后菌草靈芝精粉的質(zhì)量，m為菌草靈芝切片的質(zhì)量.

1.2.3 菌草靈芝水提物提取單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在固定液料比(20∶1)、提取溫度(90 ℃)、提取時(shí)間(2 h)、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)轉(zhuǎn)速(40 r·min-1)、離心轉(zhuǎn)速(8 000 r·min-1)、離心時(shí)間(15 min)其中5個(gè)因素的條件下，分別考察液料比(10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1)、提取溫度(60、70、80、90、100 ℃)、提取時(shí)間(1、2、3、4、5 h)、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)轉(zhuǎn)速(30、40、50、60、70 r·min-1)、離心轉(zhuǎn)速(6 000、7 000、8 000、9 000、10 000 r·min-1)、離心時(shí)間(5、10、15、20、25 min)6個(gè)因素對(duì)菌草靈芝水提物得率的影響.每組試驗(yàn)重復(fù)3次.

1.2.4 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以因素X1、X2、X3、X4、X5、X6分別代表液料比、提取溫度、提取時(shí)間、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)轉(zhuǎn)速、離心轉(zhuǎn)速、離心時(shí)間，每個(gè)因素取2個(gè)水平，高水平賦值為+1，低水平賦值為-1(表1)，測(cè)定影響得率(Y)的關(guān)鍵因素.

表1 Plackett-Burman試驗(yàn)6個(gè)因素水平設(shè)計(jì)Table 1 Level design of 6 factors in Plackett-Burman experiment

表2 Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)3個(gè)因素水平設(shè)計(jì)Table 2 Level design of 3 factors in Box-Behnken experiment

1.2.5 Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn) 根據(jù)Plackett-Burman試驗(yàn)的結(jié)果，選擇X1、X2、X3為自變量，以Y為響應(yīng)值進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，見(jiàn)表2.

1.2.6 偽三元相圖法制備菌草靈芝精粉納米乳 (1)偽三元相圖的繪制.按照混合表面活性劑與油相1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1的比例制備混合物，稱取混合物于燒杯中，再緩慢滴加去離子水，溶液由澄清變渾濁，再變澄清，記錄混合表面活性劑、油相、水相達(dá)到相轉(zhuǎn)變臨界點(diǎn)時(shí)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，將其作為三元相圖的3個(gè)頂點(diǎn)，利用Origin軟件繪制偽三元相圖，以形成的乳區(qū)范圍確定納米乳的配方[20].

(2)表面活性劑配比的篩選.以親水親油平衡(hydrophilic lipophilic balance， HLB)值為指標(biāo)，按照水包油(O/W)型納米乳篩選表面活性劑配比.選用 Tween80(HLB值=15)和Span80(HLB值=4.3)復(fù)配作為表面活性劑，分別將Tween80與Span80按質(zhì)量比2∶1、3∶1、4∶1進(jìn)行混合，助表面活性劑為丙三醇，大豆油為油相，表面活性劑與助表面活性劑質(zhì)量比為3∶1，0.5%菌草靈芝精粉溶液為水相，攪拌至形成透明的納米乳劑，繪制偽三元相圖.

(3)油相的篩選.設(shè)置Tween80與Span80質(zhì)量比為3∶1，表面活性劑與助表面活性劑質(zhì)量比為3∶1，選用玉米油、大豆油、橄欖油作為油相，0.5%菌草靈芝精粉溶液為水相，攪拌至形成透明的納米乳劑，繪制偽三元相圖.

(4)表面活性劑和助表面活性劑質(zhì)量比的篩選.設(shè)置Tween80與Span80質(zhì)量比為3∶1，大豆油為油相，分別將表面活性劑與助表面活性劑按質(zhì)量比2∶1、3∶1、4∶1進(jìn)行混合，0.5%菌草靈芝精粉溶液為水相，攪拌至形成透明的納米乳劑，繪制偽三元相圖.

(5)水相的篩選.設(shè)置Tween80與Span80質(zhì)量比為3∶1，表面活性劑與助表面活性劑質(zhì)量比為3∶1，大豆油為油相，分別加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%、0.5%、1.0%的菌草靈芝精粉溶液，攪拌至形成透明的納米乳劑，繪制偽三元相圖.

1.2.7 菌草靈芝精粉納米乳粒徑測(cè)定及形態(tài)考察 取制備好的菌草靈芝精粉納米乳1 mL，用水稀釋100倍，用激光粒度儀測(cè)定納米乳粒徑、zeta電位，重復(fù)測(cè)定3次并取其均值[21].

將銅網(wǎng)置于封口膜上，滴加適量納米乳，之后用磷鎢酸液(ω=2%)滴在封口膜上，再將銅網(wǎng)倒覆于染液上負(fù)染15 min后用蒸餾水沖洗，吸干水分，用透射電鏡觀察納米乳形態(tài)[21].

1.3 數(shù)據(jù)分析

運(yùn)用Excel 2016軟件對(duì)單因素試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)與分析；用Mintab 17.0軟件進(jìn)行Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果分析；用Design-Expert 11軟件對(duì)Box-Behnken試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析和繪圖.

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

液料比對(duì)菌草靈芝水提物得率的影響如圖1A所示，隨著液料比的增加，菌草靈芝水提物得率呈先增大后減小的趨勢(shì).當(dāng)液料比為25∶1時(shí)，得率達(dá)到最大值(10.90%)；之后隨著液料比繼續(xù)增大，得率下降，說(shuō)明在保持提取溫度和時(shí)間不變的情況下，過(guò)多的液料會(huì)使物料的擴(kuò)散和溶出率降低，這與宋智琴等[22]對(duì)石斛多糖提取工藝的優(yōu)化結(jié)果一致.因此，暫定最適液料比為25∶1.

圖1 液料比(A)、提取溫度(B)、提取時(shí)間(C)、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)轉(zhuǎn)速(D)、離心轉(zhuǎn)速(E)、離心時(shí)間(F)對(duì)靈芝水提物得率的影響Fig.1 Effects of liquid-material ratio (A), extraction temperature (B), extraction time (C), rotary evaporation speed (D), centrifugal speed (E), and centrifugal time (F) on yield of G.lucidum water extract

提取溫度對(duì)菌草靈芝水提物得率的影響如圖1B所示，隨著提取溫度的升高，菌草靈芝水提物得率大體呈先增大后減小的趨勢(shì).當(dāng)提取溫度為90 ℃時(shí)，得率達(dá)到9.00%；但當(dāng)溫度為100 ℃時(shí)得率明顯降低，這是因?yàn)闇囟冗^(guò)高使分子擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)過(guò)于激烈，不利于物料的溶出.因此，暫定最適提取溫度為90 ℃.

提取時(shí)間對(duì)菌草靈芝水提物得率的影響如圖1C所示.隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，菌草靈芝水提物得率開(kāi)始快速增大，當(dāng)提取時(shí)間為3 h時(shí)，得率為8.75%；之后增加緩慢并趨于穩(wěn)定，這表明菌草靈芝中能夠溶解在水中的物質(zhì)在3 h時(shí)基本被提取完全.劉復(fù)容等[23]用索氏抽提法對(duì)黑水虻幼蟲(chóng)粗油脂進(jìn)行提取時(shí)，也發(fā)現(xiàn)提取到一定時(shí)間，提取率不再隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而增大.因此，暫定最適提取時(shí)間為3 h.

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)轉(zhuǎn)速對(duì)菌草靈芝水提物得率的影響如圖1D所示，隨著旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)轉(zhuǎn)速的增大，菌草靈芝水提物得率呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì).當(dāng)轉(zhuǎn)速為50 r·min-1時(shí)，得率最大，達(dá)9.03%；之后隨著轉(zhuǎn)速繼續(xù)增大，得率有所降低，這可能是因?yàn)檫^(guò)快的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)轉(zhuǎn)速降低了物料粗提液與旋蒸儀導(dǎo)熱裝置的表面接觸，從而影響了其得率.因此，暫定最適旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)轉(zhuǎn)速為50 r·min-1.

離心轉(zhuǎn)速對(duì)菌草靈芝水提物得率的影響如圖1E所示，隨著離心轉(zhuǎn)速的增大，菌草靈芝水提物得率呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì).當(dāng)離心轉(zhuǎn)速為9 000 r·min-1時(shí)，得率達(dá)到8.73%；之后隨著離心轉(zhuǎn)速繼續(xù)增大，得率降低，這可能是因?yàn)榫蒽`芝水提物中含有一定比例的小分子物質(zhì)，過(guò)高的離心轉(zhuǎn)速會(huì)導(dǎo)致小分子物質(zhì)無(wú)法沉降.這個(gè)現(xiàn)象與李偉民等[24]對(duì)山藥蛋白提取的研究結(jié)果較為一致.因此，暫定最適離心轉(zhuǎn)速為9 000 r·min-1.

離心時(shí)間對(duì)菌草靈芝水提物得率的影響如圖1F所示，隨著離心時(shí)間的延長(zhǎng)，菌草靈芝水提物得率呈先增大后減小的趨勢(shì).當(dāng)離心時(shí)間為15 min時(shí)，得率最大(8.99%)，之后得率逐漸降低.董亮等[25]以云南普洱茶為研究對(duì)象提取茶多糖時(shí)也發(fā)現(xiàn)了相似的規(guī)律.因此，暫定最適離心時(shí)間為15 min.

2.2 Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果

Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果如表3-4所示.經(jīng)數(shù)據(jù)分析得知，6個(gè)因素對(duì)菌草靈芝水提物得率的影響大小表現(xiàn)為X1>X2>X3>X5>X4>X6，其中，具有顯著影響(P<0.05)的因素為X1和X2.結(jié)合單因素試驗(yàn)數(shù)據(jù)，選取X1、X2、X3作為Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)的考察對(duì)象.

表3 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 3 Plackett-Burman experiment design and result

表4 Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果方差分析1)Table 4 ANOVA analysis of Plackett-Burman test

2.3 Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果

2.3.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果見(jiàn)表5.

不同因素的交互作用對(duì)菌草靈芝水提物得率的影響見(jiàn)圖2.響應(yīng)曲面的坡度越陡，反映試驗(yàn)因素對(duì)得率的影響越大；坡度越平緩，反映其影響程度越小.

由圖2A可知：當(dāng)提取時(shí)間一定時(shí)，隨著液料比的增加，菌草靈芝水提物得率逐漸升高，且曲線坡度較陡；隨著提取溫度的升高，菌草靈芝水提物得率先升高后降低，且曲線坡度陡峭.這說(shuō)明兩者交互作用對(duì)菌草靈芝水提物得率有較大影響.

由圖2B可知，當(dāng)提取溫度一定時(shí)，液料比與提取時(shí)間交互作用的影響不顯著.隨著液料比的增加，菌草靈芝水提物得率先升高后緩慢降低，且曲線坡度較陡；隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，菌草靈芝水提物得率變化不明顯，曲線坡度平緩.

由圖2C可知，當(dāng)液料比一定時(shí)，提取溫度與提取時(shí)間交互作用的影響不顯著.隨著提取溫度的升高，菌草靈芝水提物得率先升高后降低，曲線坡度較陡；隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，菌草靈芝水提物得率變化不大，曲線坡度平緩.

表5 Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)與結(jié)果(n=3)Table 5 Box-Behnken response surface optimization design and result (n=3)

表6 Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果方差分析1)Table 6 ANOVA analysis of Box-Behnken response surface optimization result

圖2 液料比、提取溫度和提取時(shí)間對(duì)菌草靈芝水提物得率影響的響應(yīng)面圖Fig.2 Response surface diagram of influence of liquid-material ratio, extraction temperature and extraction time on yield of G.lucidum water extract

根據(jù)所建立的模型得到菌草靈芝水提物最佳提取工藝條件為液料比27.004∶1、提取溫度93.856 1 ℃、提取時(shí)間3.014 52 h，此時(shí)菌草靈芝水提物得率理論值為13.94%.

2.3.2 響應(yīng)面優(yōu)化條件的驗(yàn)證 結(jié)合實(shí)際可行性，經(jīng)修正得到菌草靈芝水提物最適提取工藝條件為液料比27∶1、提取溫度93 ℃、提取時(shí)間3 h，且設(shè)定旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)轉(zhuǎn)速50 r·min-1、離心轉(zhuǎn)速9 000 r·min-1、離心時(shí)間15 min，在此條件下進(jìn)行3次平行試驗(yàn)并取其平均值，得到菌草靈芝水提物平均得率為13.53%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation, RSD)=0.92%(n=3)，與理論預(yù)測(cè)值(13.94%)基本一致.因此，采用響應(yīng)面法對(duì)菌草靈芝水提物提取工藝有較好的優(yōu)化效果.

2.4 菌草靈芝精粉納米乳制備

2.4.1 表面活性劑配比的篩選 偽三元相圖中乳液形成的區(qū)域越大，表明乳化效果越好.從圖3可看出，當(dāng)表面活性劑Tween80與Span80質(zhì)量比為4∶1(此時(shí)HLB值為12.8)時(shí)，所形成的菌草靈芝精粉納米乳區(qū)的面積最大.這可能是由于較高的HLB值(8～18)更易形成水包油型納米乳，且表面活性劑最適復(fù)配比例，能讓其更好地在油相周圍生成薄膜，強(qiáng)化兩相間的界面以保持乳滴的穩(wěn)定性.這一結(jié)果與包睿文[12]采用香菇多糖制備納米乳的研究結(jié)果類似.因此，本試驗(yàn)選擇Tween80與Span80質(zhì)量比為4∶1.

A.2∶1;B.3∶1;C.4∶1.圖3 Tween80與Span80質(zhì)量比對(duì)納米乳體系形成的影響Fig.3 Influence of mass ratio of Tween80 and Span80 on formation of nanoemulsion system

2.4.2 油相的篩選 如圖4所示，當(dāng)油相為玉米油、橄欖油、大豆油時(shí)，所形成的菌草靈芝精粉納米乳區(qū)面積差異較小.但在納米乳制作過(guò)程中，由于大豆油黏度低，其脂肪酸以油酸和亞油酸為主，尤其是亞油酸含量較高[26-28]，這些都有益于納米乳液的形成[29].因此，本試驗(yàn)選擇油相為大豆油.

A.玉米油;B.橄欖油;C.大豆油.圖4 油相對(duì)納米乳體系形成的影響Fig.4 Influence of oil phase on formation of nanoemulsion system

2.4.3 表面活性劑與助表面活性劑質(zhì)量比的篩選 如圖5所示，當(dāng)表面活性劑與助表面活性劑質(zhì)量比為2∶1時(shí)，所形成的菌草靈芝精粉納米乳區(qū)面積較大.這是由于助表面活性劑丙三醇具有較高的黏度，當(dāng)表面活性劑和助表面活性劑達(dá)到一定比例時(shí)，能在乳液體系中形成層狀結(jié)構(gòu)，降低水油兩相間的表面張力，使得整個(gè)納米乳體系穩(wěn)定.這與藍(lán)苑元等[30]對(duì)姜黃素進(jìn)行乳化的研究結(jié)果一致.因此，本試驗(yàn)選擇表面活性劑與助表面活性劑質(zhì)量比為2∶1.

A.2∶1;B.3∶1;C.4∶1.圖5 表面活性劑與助表面活性劑質(zhì)量比對(duì)納米乳體系形成的影響Fig.5 Influence of mass ratio of surfactant and cosurfactant on formation of nanoemulsion system

2.4.4 水相的篩選 如圖6所示，隨著菌草靈芝精粉濃度的升高，所形成的菌草靈芝精粉納米乳區(qū)面積呈先增大后減小的趨勢(shì)，這是由于菌草靈芝精粉溶液中含有大量的靈芝多糖，其具有一定黏度，當(dāng)濃度過(guò)高時(shí)，多糖分子間可能發(fā)生凝膠化作用，導(dǎo)致納米乳區(qū)面積減小.因此，本試驗(yàn)選擇0.5%菌草靈芝精粉溶液為水相.

A.0.1%；B.0.5%;C.1.0%.圖6 菌草靈芝精粉溶液濃度對(duì)納米乳體系形成的影響Fig.6 Influence of concentration of JUNCAO G.lucidum refined powder solution on formation of nanoemulsion system

2.5 菌草靈芝精粉納米乳的粒徑及其形態(tài)

圖7所示為菌草靈芝精粉納米乳在激光粒度儀下的測(cè)試結(jié)果.由圖可知，納米乳經(jīng)3次測(cè)試的結(jié)果均呈單峰型，峰值分別為143.5、154.2、157.8 nm，表明粒徑大小均勻，平均粒徑為151.8 nm. zeta 電位為-21.29 mV，表明該納米乳呈負(fù)電性，又因其絕對(duì)值較大，由同性相斥原理可推測(cè)該納米乳穩(wěn)定性較好.從圖8可以看出，菌草靈芝精粉納米乳的乳滴為球形，大小為50～200 nm，顆粒較為均勻.可見(jiàn)，電鏡觀察結(jié)果和粒度儀測(cè)定結(jié)果基本一致.

圖7 菌草靈芝精粉粒徑分布Fig.7 Distribution of particle size of JUNCAO G.lucidum

3 討論與結(jié)論

圖8 透射電鏡下菌草靈芝精粉納米乳形態(tài)Fig.8 Morphology of nanoemulsion of G.lucidum refined powder under transmission electron microscope

菌草靈芝精粉采用熱水浸提法制備，具有無(wú)溶劑殘留、工藝簡(jiǎn)單、有效活性物質(zhì)含量多的特點(diǎn).陳灶鑫等[31]通過(guò)紅外光譜法研究發(fā)現(xiàn)，靈芝經(jīng)不同處理得到的提取物中，承載化學(xué)信息量最豐富的提取物為靈芝水提物，其具有抗氧化、美白、抗腫瘤等多種生物活性.近年來(lái)，隨著人們健康意識(shí)的增強(qiáng)，靈芝產(chǎn)品需求量日益增大，若能通過(guò)優(yōu)化提取工藝提高活性物質(zhì)提取效率，則可以降低生產(chǎn)成本，擴(kuò)大菌草靈芝相關(guān)產(chǎn)品的應(yīng)用范圍.

響應(yīng)面法具有試驗(yàn)次數(shù)合理、試驗(yàn)結(jié)果精確、周期短等技術(shù)特點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于生物工程、食品工藝及藥學(xué)等領(lǐng)域.王會(huì)賓等[32]采用響應(yīng)面法優(yōu)化熱水浸提靈芝孢子多糖的工藝，田淑雨等[33]采用響應(yīng)面法優(yōu)化超聲破碎輔助提取靈芝多糖的工藝，劉曉艷等[34]采用響應(yīng)面法優(yōu)化靈芝總?cè)泼篙o助提取工藝，趙立娜等[4]采用響應(yīng)面法優(yōu)化菌草靈芝多肽-硒螯合物的制備工藝，均取得了較好的效果.本研究采用Plackett-Burman設(shè)計(jì)聯(lián)合Box-Behnken響應(yīng)面法考察了液料比、提取時(shí)間、提取溫度、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)轉(zhuǎn)速、離心轉(zhuǎn)速、離心時(shí)間對(duì)菌草靈芝水提物得率的影響.試驗(yàn)得到的最佳工藝條件為液料比27∶1、提取溫度93 ℃、提取時(shí)間3 h、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)轉(zhuǎn)速50 r·min-1、離心轉(zhuǎn)速9 000 r·min-1、離心時(shí)間15 min，在此條件下菌草靈芝水提物得率為13.53%.

田艷[35]研究表明，靈芝多糖納米乳佐劑具有增強(qiáng)疫苗免疫效果的作用；楊迪等[36]研究證實(shí)，南極磷蝦油靈芝孢子油納米乳復(fù)合物可以提高小鼠免疫力.這些研究顯示納米乳可以提高大分子活性物質(zhì)的生物效價(jià).因此,本研究將菌草靈芝精粉制成菌草靈芝精粉納米乳，通過(guò)偽三元相圖法獲得納米乳最佳制備條件：Tween80與Span80質(zhì)量比4∶1，大豆油為油相，表面活性劑與助表面活性劑質(zhì)量比2∶1，0.5%菌草靈芝精粉溶液為水相，該條件下制備得到的納米乳平均粒徑為151.8 nm，zeta電位為-21.29 mV，納米乳液乳滴為球形，大小均勻.但該納米乳的活性有待進(jìn)一步研究.