菌草靈芝醇提物的體外抗氧化和免疫活性

張鳳麗, 彭培植, 李靜茹, 黃文琪, 趙立娜

(1.福建農(nóng)林大學國家菌草工程技術研究中心；2.福建農(nóng)林大學生命科學學院，福建 福州 350002)

靈芝(Ganodermalucidum)屬于擔子菌門擔子菌綱靈芝科[1]，是一種食藥兩用真菌，幾個世紀以來一直被用作改善健康狀況的營養(yǎng)藥物[2]，是眾所周知的促進長壽和健康的功能真菌[3].靈芝多糖有多種生物活性[4]，具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗氧化[5]、降血糖、抗糖尿病、抗炎、抗菌[6]等藥理作用.除了對人體健康有益外，靈芝還可提高酸奶品質(zhì)[7]，能有效提高肉雞的生長性能、增加活性氧(ROS)清除活性、增強抗氧化防御系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)[8].菌草靈芝是用菌草代替木屑栽培的靈芝.陳穎等[9]研究表明，菌草靈芝多糖提取率高于椴木靈芝，而肽含量則以椴木靈芝較高；胡居吾等[10]研究也表明，菌草靈芝和椴木靈芝中的粗多糖、三萜類物質(zhì)含量及靈芝孢子油中的三萜類物質(zhì)含量有差異，菌草靈芝中有效活性物質(zhì)和營養(yǎng)成分的含量均高于椴木靈芝[11].一定劑量的菌草靈芝粉可調(diào)節(jié)小鼠免疫器官指數(shù)、血清免疫球蛋白補體水平，促進淋巴細胞增殖，增強免疫作用[12].劉曉艷等[13]研究表明，菌草靈芝提取液對DPPH和羥基自由基有一定的清除能力，同時具有良好的還原力.呂旭聰?shù)萚14]研究表明，菌草靈芝粗多糖的抗氧化能力強于純化多糖，粗多糖與茶多酚復合后的抗氧化能力呈協(xié)同增效作用.在之前的研究中，通過HPLC-QTOF/MS技術，菌草靈芝醇提物(JUNCAOGanodermalucidumalcohol extract, JGEH)在MS2光譜中觀察到的保留時間、假分子離子和離子碎裂模式初步鑒定，JGEH主要含有18種化合物；總離子色譜分析表明，菌草靈芝共鑒定出18種三萜類化合物，其中，靈芝酸B、靈芝酸A、靈芝酸H、靈芝酸D、12-乙酰氧基靈芝酸F是峰面積百分比較高的代表[15].

菌草靈芝有許多重要的生物活性物質(zhì)，據(jù)此，本試驗對JGEH體外抗氧化及JGEH作用后RAW264.7巨噬細胞的增殖率、吞噬指數(shù)、NO釋放量等指標進行了研究，并進一步闡明了JGEH降低細胞中炎癥因子表達量的抗炎機制，旨在為菌草靈芝進一步的研究提供參考依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料 菌草靈芝由福建農(nóng)林大學國家菌草工程技術研究中心提供.

1.1.2 試劑 木瓜蛋白酶購自北京索萊寶科技有限公司；無水乙醇、氫氧化鈉購自國藥集團化學試劑有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、2，2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二胺鹽(ABTS)購自美國Sigma公司；RAW264.7專用培養(yǎng)基購自武漢普諾賽生命科技有限公司；脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；CCK-8試劑盒、中性紅細胞增殖和細胞毒性檢測試劑盒、NO檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；其他試劑均為分析純.

1.1.3 儀器設備 SepectraMax i3X酶標儀購自美谷分子儀器有限公司；pH計購自梅特勒-托利多儀器上海有限公司；PD-3型冷凍干燥機購自河北國輝實驗儀器有限公司；SW-CJ超凈工作臺購自蘇州安泰空氣技術有限公司；TS100倒置顯微鏡購自日本ECLIPSE公司.

1.1.4 試驗細胞 小鼠巨噬細胞RAW264.7由武漢普諾賽生命科技有限公司提供.

1.2 JGEH的制備

菌草靈芝子實體烘干后用磨粉機粉碎，按徐陽陽[16]的提取方法，將子實體粉末以1∶20的料液比溶于70%乙醇中，于75 ℃水浴鍋提取2 h，減壓抽濾后旋蒸濃縮，冷凍干燥制得JGEH.

1.3 JGEH體外抗氧化測定

1.3.1 對DPPH自由基清除率的測定 JGEH對DPPH自由基清除率的測定參照Tsai et al[17]的方法.將2 mL 0.10 mmol·L-1DPPH乙醇溶液分別與2 mL不同含量的JGEH混合，避光靜置30 min，測定在波長517 nm處的光密度(D).以無水乙醇為空白樣品，VC溶液為陽性樣品.DPPH自由基清除率按公式(1)計算.

(1)

式中：A0表示空白樣品的D517 nm；A1表示JGEH樣品的D517 nm.

1.3.2 對ABTS自由基清除率的測定 JGEH對ABTS自由基清除率的測定參照Soong et al[18]的方法，略有改進.ABTS溶液用PBS(pH 7.4)稀釋40～50倍至D734 nm為0.70±0.02.將不同含量的JGEH分別加入酶標板中，于30 ℃放置3 min，迅速加入150 μL ABTS溶液，振蕩10 s，于30 ℃放置6 min后測定D734 nm.以PBS為空白樣品，VC溶液為陽性樣品.ABTS自由基清除率按公式(2)計算.

(2)

式中：A0表示空白樣品的D734 nm；A1表示JGEH樣品的D734 nm.

1.3.3 對羥基自由基清除率的測定 JGEH對羥基自由基清除率的測定參照Smirnoff et al[19]的方法，稍加改進.在反應體系中依次加入0.50 mL 1.5 mmol·L-1FeSO4、0.15 mL 20.00 mmol·L-1水楊酸鈉和1 mL不同含量的JGEH，混勻后加入0.35 mL 6.70 mmol·L-1H2O2啟動反應，置37 ℃水浴中保持30 min，冷卻后測定D562 nm.以去離子水代替樣品為空白樣品，以去離子水代替水楊酸為對照樣品，以VC溶液代替樣品為陽性樣品.羥基自由基清除率按公式(3)計算.

(3)

式中：A0表示含有去離子水和水楊酸溶液的D562 nm；A1表示含有JGEH樣品和去離子水溶液的D562 nm；A2表示含有JGEH樣品和水楊酸溶液的D562 nm.

1.4 JGEH對巨噬細胞免疫調(diào)節(jié)作用的測定

1.4.1 細胞增殖率的測定 選用對數(shù)生長期的巨噬細胞RAW264.7，將細胞刮下后用血球計數(shù)板計數(shù).調(diào)整懸液中的細胞密度為1×105個·mL-1，除第1列外，每孔加入100 μL細胞懸液，于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h后取出，棄去培養(yǎng)液.空白組每孔加入100 μL培養(yǎng)基，試驗組每孔加入100 μL含不同量JGEH的培養(yǎng)基，陽性組每孔加入100 μL含1 μg·mL-1LPS的培養(yǎng)基，設置6個復孔.繼續(xù)培養(yǎng)細胞24 h后，每孔加入10 μL CCK-8試劑，再培養(yǎng)2 h后測定D450 nm.細胞增殖率按公式(4)計算.

(4)

式中：A0表示無細胞無樣品的D450 nm；A1表示有細胞無樣品的D450 nm；A2表示不同含量JGEH樣品的D450 nm.

1.4.2 細胞吞噬能力的測定 選用對數(shù)生長期的巨噬細胞RAW264.7，將細胞刮下后用血球計數(shù)板計數(shù)，調(diào)整懸液中的細胞密度為1×105個·mL-1.在酶標板中每孔加入100 μL細胞懸液，于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h后棄去培養(yǎng)液.試驗組每孔加入100 μL含不同量JGEH的培養(yǎng)基，陽性組每孔加入100 μL含1 μg·mL-1LPS的培養(yǎng)基，設置6個復孔.培養(yǎng)24 h后棄去培養(yǎng)液，每孔加入100 μL 0.05%中性紅溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄去培養(yǎng)液，用PBS洗滌3次，每孔加入150 μL細胞裂解液，振蕩裂解10 min，待細胞完全裂解后測定D540 nm.細胞吞噬能力用吞噬指數(shù)表示.

式中：AS表示試驗組樣品的D540 nm；AI表示陽性樣品的D540 nm.

1.4.3 細胞NO釋放量的測定 選用對數(shù)生長期的巨噬細胞RAW264.7，將細胞刮下后加入新的培養(yǎng)基，用血球計數(shù)板計數(shù)，調(diào)整懸液中的細胞密度為2×105個·mL-1.每孔加入500 μL細胞懸液，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h后棄去培養(yǎng)基，空白組每孔加入500 μL完全培養(yǎng)基，試驗組每孔加入500 μL含不同量JGEH和1 μg·mL-1LPS的完全培養(yǎng)基，模型組每孔加入500 μL 含1 μg·mL-1LPS的完全培養(yǎng)基.繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后，離心并收集上清液，采用NO檢測試劑盒測定細胞NO釋放量.

1.5 細胞免疫相關基因mRNA表達水平的RT-qPCR檢測

采用細胞RNA提取試劑盒提取細胞的總RNA，經(jīng)DNaseI處理后，用反轉錄試劑盒反轉錄成cDNA，采用RT-qPCR檢測細胞免疫相關基因IL-8、TLR-4、INOS和IL-1βmRNA的表達水平.以GAPDH為內(nèi)參基因，通過2-ΔΔCt方法計算細胞免疫相關基因mRNA的相對表達量.

1.6 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)以平均值±標準差表示，采用SPSS 11.0軟件對數(shù)據(jù)進行方差分析，同時進行LSD檢驗.以P<0.05表示有顯著性差異.

2 結果與分析

2.1 JGEH對DPPH自由基的清除能力

由圖1可知，JGEH對DPPH自由基的清除率隨著JGEH含量的增加逐漸升高，且呈一定的劑量依賴性.JGEH含量為0.125～0.5 mg·mL-1時對DPPH自由基的清除率增加較緩慢，含量為0.5～2 mg·mL-1時對DPPH自由基的清除率增加相對較快.JGEH含量較高時對DPPH自由基的清除率較高.JGEH含量為2 mg·mL-1時對DPPH自由基的清除率達到80.25%，接近同含量VC的清除水平，與0.2～2 mg·mL-1鹿角靈芝醇提物的清除率(30.00%～90.00%)[20]相符.表明JGEH有較強清除DPPH自由基的能力.

2.2 JGEH對ABTS自由基的清除能力

由圖2可知，JGEH對ABTS自由基的清除率隨著JGEH含量的增加逐漸升高，且呈一定的劑量依賴性.JGEH含量為0.125～0.5 mg·mL-1時對ABTS自由基的清除率增加較快，含量為0.5～2 mg·mL-1時對ABTS自由基的清除率增加相對較緩慢.JGEH含量為2 mg·mL-1時對ABTS自由基有較強的清除效果，清除率達100.00%，達到同含量VC的清除效果，與0.03～2 mg·mL-1鹿角靈芝醇提物的清除率(14.50%～93.00%)[20]相符.表明JGEH有較強清除ABTS自由基的能力.

圖1 JGEH對DPPH自由基的清除率Fig.1 Clearance rate of DPPH by JGEH

2.3 JGEH對羥基自由基的清除能力

圖3 JGEH對羥基自由基的清除率Fig.3 Clearance rate of hydroxyl radical by JGEH

由圖3可知，JGEH對羥基自由基的清除率隨著JGEH含量的增加逐漸升高，且呈一定的劑量依賴性.JGEH含量為0.125～2 mg·mL-1時，羥基自由基清除率的變化均勻.JGEH含量為0.125～0.25 mg·mL-1時對羥基自由基的清除率低于50.00%；JGEH含量為2 mg·mL-1時對羥基自由基的清除率達85.61%，接近同含量VC的清除效果，比20 mg·mL-1靈芝醇提物對羥基自由基清除率(84.00%)[21]高1.61%.表明JGEH有較強清除羥基自由基的能力.

2.4 JGEH對巨噬細胞增殖率的影響

由圖4可知：相對于不含JGEH的對照組，JGEH含量為25～50 μg·mL-1時，巨噬細胞增殖率均高于100.00%，增殖率隨著JGEH含量的增加呈不斷升高的趨勢，并表現(xiàn)出一定的劑量依賴性；JGEH含量為50～200 μg·mL-1時，細胞增殖率隨著JGEH含量的增加呈不斷下降的趨勢，各含量JGEH試驗組的細胞增殖率均低于LPS陽性對照組.JGEH含量為50 μg·mL-1時能顯著提高巨噬細胞的增殖率(P<0.05)，增殖率達121.71%，與研究結果“靈芝能提高巨噬細胞的細胞活力”[22]一致.表明JGEH作用后，不會引發(fā)細胞炎癥，對細胞無毒副作用，增強了巨噬細胞的細胞活力，促進了細胞增殖.

2.5 JGEH對巨噬細胞吞噬能力的影響

由圖5可知，相對于不含JGEH的對照組，JGEH含量為25～200 μg·mL-1時能不同程度地提高巨噬細胞的吞噬能力，且無劑量依賴性.JGEH含量為25 μg·mL-1時可顯著提高細胞吞噬能力(P<0.05)，吞噬指數(shù)提高到345.21%；200 μg·mL-1JGEH對細胞吞噬能力的增強效果弱于其他含量的JGEH，但仍可以顯著提高細胞吞噬能力.各含量JGEH試驗組的細胞吞噬能力均高于LPS陽性對照組，與研究結果“靈芝孢子粉能使小鼠巨噬細胞的吞噬功能顯著提高”[22]一致，表明JGEH能提高巨噬細胞的吞噬能力.

2.6 JGEH對巨噬細胞NO釋放量的影響

由圖6可知，相對于不含JGEH的對照組，LPS誘導的細胞炎癥模型組中NO的釋放量增加近20倍，表明當細胞發(fā)生炎癥反應時會急劇增加NO的釋放量，NO釋放量過多會造成機體缺氧，從而對機體造成傷害.JGEH含量為25～200 μg·mL-1時能不同程度地降低細胞NO的釋放量，且無劑量依賴性.當JGEH含量為25～100 μg·mL-1時，隨著JGEH含量的增加，NO的釋放量沒有顯著變化；當JGEH含量為200 μg·mL-1時顯著降低NO的釋放量(P<0.05)，此時NO的釋放量接近不含JGEH的對照組水平.表明JGEH具有較好的體外免疫調(diào)節(jié)能力.

圖柱上附不同字母表示差異顯著(P<0.05)，附相同字母表示差異不顯著(P>0.05).圖4 JGEH對巨噬細胞增殖率的影響Fig.4 Effect of JGEH on proliferation rate of macrophage

2.7 JGEH對細胞炎癥相關基因mRNA表達水平的影響

圖柱上附不同字母表示差異顯著(P<0.05),附相同字母表示差異不顯著(P>0.05).圖6 JGEH對巨噬細胞NO釋放量的影響Fig.6 Effect of JGEH on release of NO from macrophage

IL-8、TLR-4、INOS和IL-1β均是重要的炎癥細胞因子，含量過多會引發(fā)機體的炎癥發(fā)生.圖7顯示：與不含JGEH的對照組相比，25～200 μg·mL-1JGEH作用后，這4種炎癥細胞因子基因mRNA的表達量顯著下降(P<0.05)，TLR-4、INOS、IL-8和IL-1β基因mRNA的表達量分別降至78.73%、41.62%、23.52%、53.85%；不同含量的JGEH對細胞炎癥因子基因mRNA表達量均有不同程度的降低作用，含量為50 μg·mL-1時，JGEH的作用效果最佳，且4種因子基因mRNA的表達量均低于LPS陽性對照組.表明了JGEH對細胞炎癥相關因子的表達有顯著的抑制作用(P<0.05)，從而減少了體內(nèi)炎癥的產(chǎn)生，提高機體免疫力.

圖柱上附不同字母表示差異顯著(P<0.05)，附相同字母表示差異不顯著(P>0.05).圖7 JGEH對細胞炎癥關鍵基因表達水平的影響Fig.7 Effect of JGEH on expression of key inflammatory genes in macrophage

3 討論與結論

靈芝富含多糖、三萜和蛋白質(zhì)等生物活性物質(zhì)[23]，還含有靈芝酸、香豆精、生物堿、揮發(fā)油和甾類等物質(zhì)[24].機體抗氧化自由基的大量產(chǎn)生通常與許多疾病的發(fā)生有關，對抗氧化的研究可以克服自由基過量對機體造成傷害.靈芝能夠增強超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化氫酶(CAT)的活性，降低丙二醛(MDA)水平，從而達到抗氧化和抗衰老的效果[25].DPPH是一種穩(wěn)定存在于有機溶劑中的自由基，自由基清除劑可捕捉DPPH的單電子從而使其顏色變淺.本研究中，JGEH含量為2 mg·mL-1時對DPPH自由基的清除率達到80.25%，接近同含量VC的清除效果；JGEH對ABTS自由基的清除率隨著JGEH含量的增加表現(xiàn)出一定的劑量依賴性，JGEH含量為2 mg·mL-1時對ABTS自由基有較強的清除效果，清除率達100.00%；羥基自由基的氧化力強且危害性大，JGEH含量為2 mg·mL-1時對羥基自由基的清除率達到85.61%，接近同含量VC的清除效果.JGEH對DPPH、ABTS和羥基自由基的清除率表明了JGEH有較強的抗氧化能力，這與鐘千貴[26]的研究結果“無柄靈芝醇提物對DPPH、ABTS和羥基自由基有較強的清除率，抗氧化能力較強”一致.

免疫力低下會引發(fā)多種慢性疾病，全世界因免疫力低下引發(fā)的慢性病發(fā)病率不斷上升[27].免疫系統(tǒng)不同于身體的其他系統(tǒng)，它包含具有特殊和互補功能的多層和細胞亞群[28]，這種細胞網(wǎng)絡協(xié)調(diào)一致地保護宿主免受各種刺激.研究表明：靈芝可以調(diào)節(jié)機體的免疫系統(tǒng)，促進身體健康，有利于長壽[29]；靈芝破壁孢子粉可以提高血清免疫因子含量及免疫器官指數(shù)，提高肉仔雞的生長性能、抗氧化能力及免疫功能[30]；黑靈芝多糖可以抑制LPS誘導MAPK信號通路的激活，從而起到抗炎作用[31].本研究中，JGEH含量為25～200 μg·mL-1時，RAW264.7巨噬細胞的增殖率均高于100.00%，表明此范圍含量的JGEH對巨噬細胞無毒副作用；JGEH含量為50 μg·mL-1時能顯著提高巨噬細胞的細胞活力(P<0.05)，可將巨噬細胞的增殖率提高到121.71%；JGEH含量為25 μg·mL-1時可顯著提高巨噬細胞的吞噬能力，相對于正常細胞，可將其吞噬指數(shù)提高到345.21%.NO具有一定的毒性，炎癥反應會引起細胞NO釋放量過多，損傷DNA介導的組織[32].本研究結果顯示：25～200 μg·mL-1JGEH可降低巨噬細胞NO釋放量，從而達到抗炎效果，表明JGEH具有較強的體外免疫調(diào)節(jié)能力；當JGEH含量為200 μg·mL-1時，巨噬細胞NO釋放量達89.62%.此結果與HU et al[33]的研究結果一致.

細胞因子在調(diào)節(jié)機體代謝方面發(fā)揮著重要作用.炎癥因子作為炎癥反應的引發(fā)劑，參與機體的免疫應答.IL-8、TLR-4、INOS和IL-1β都是重要的炎癥細胞因子，表達量過多會引發(fā)機體炎癥的發(fā)生.IL-8促進彈性蛋白酶的釋放，加速內(nèi)皮細胞損傷使組織壞死，從而影響器官功能.機體NO含量過多時，會造成機體缺氧，從而對機體造成傷害.INOS為NO合成酶，控制著機體NO的合成量.研究表明，靈芝多糖可顯著降低大鼠IL-2和TNF-α的表達水平從而抑制炎癥的發(fā)生，同時會提高血清IL-2、IL-4和IL-10的表達水平從而增強大鼠的免疫水平[34].本研究中，25～200 μg·mL-1JGEH作用后，巨噬細胞中4種炎癥細胞因子基因mRNA的表達量顯著下降(P<0.05)，TLR-4、INOS、IL-8和IL-1β基因mRNA的表達量分別降至78.73%、41.62%、23.52%、53.85%，表明JGEH對細胞炎癥相關因子的表達有顯著抑制作用，能減少體內(nèi)炎癥因子的產(chǎn)生量，提高機體免疫力.

綜上所述，JGEH能較好地清除DPPH、ABTS和羥基自由基，增強巨噬細胞的增殖率和吞噬能力，降低炎癥細胞NO釋放量，抑制TLR-4、INOS、IL-8和IL-1β炎癥相關因子基因的表達，提高機體免疫力.