菌草靈芝多糖肽對(duì)Caco-2細(xì)胞MDR1、MRP2基因表達(dá)水平的影響

謝 晶, 周童暉, 孫連月, 李 晶, 林占熺

(1.福建農(nóng)林大學(xué)國(guó)家菌草工程技術(shù)研究中心，福建 福州 350002；2.湖南人文科技學(xué)院農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，湖南 婁底 417000)

Caco-2 cells

靈芝是我國(guó)傳統(tǒng)的藥食兩用真菌，分布廣泛.現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，靈芝含有多糖、多糖肽、三萜、生物堿等活性成分，具有抗氧化、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)、保肝、降血壓、改善睡眠以及抗腫瘤等作用[1-3].隨著大健康時(shí)代的來(lái)臨，靈芝產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速，利用菌草栽培鹿角靈芝(Ganodermaamboinense)所得的菌草靈芝，林興生等[4]將其命名為“南GL11”，其活性成分的含量高于椴木栽培靈芝，其中，靈芝多糖肽為椴木栽培靈芝的2.8倍[5-8].

菌草靈芝多糖肽(JUNCAOGanodermalucidumpolysaccharide peptides, JCGLPP)是由菌草靈芝子實(shí)體通過(guò)切片、水提、醇沉、透析等工藝加工后得到的一種糖蛋白，由16種氨基酸和單糖結(jié)合而成，多糖含量達(dá) 87.17%，單糖由葡萄糖和甘露糖組成，氨基酸總量為 5.04%[9].JCGLPP是靈芝重要的生物活性物質(zhì)之一，也是靈芝產(chǎn)品質(zhì)量控制的指標(biāo)之一.本課題組前期研究表明，JCGLPP具有增加免疫力、抗氧化、增強(qiáng)記憶力、抗腫瘤、減少氧化應(yīng)激、減輕脂肪肝、保肝護(hù)腎等作用[10-15].

化療是臨床上用于抑制腫瘤細(xì)胞的常用方法，但由于腫瘤細(xì)胞的多藥耐藥性(multi-drug resistance, MDR)常導(dǎo)致化療失敗，其中，MDR主要機(jī)制之一是外排P-糖蛋白(P-glycoprotein, P-gp)和多藥耐藥相關(guān)蛋白-2(multidrug resistance associated protein-2, MRP2)的過(guò)度表達(dá)，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞主動(dòng)外排藥物的能力增強(qiáng)[16-19].在體內(nèi)，參與編碼P-gp和MRP2的基因分別為MDR1和MRP2[20].近年來(lái)許多研究顯示，中藥某些活性成分具有抑制外排蛋白表達(dá)、逆轉(zhuǎn)MDR的作用，如川芎嗪、浙貝母堿、漢防己甲素、苦參堿、姜黃素、蛇床子素、芹菜素等，表明中藥在逆轉(zhuǎn)MDR上具有潛在的應(yīng)用前景[21-24].

本試驗(yàn)通過(guò)建立人結(jié)腸腺癌上皮細(xì)胞(Caco-2)模型，研究JCGLPP對(duì)Caco-2細(xì)胞中P-gp編碼基因MDR1和MRP2編碼基因MRP2表達(dá)水平的影響，并與P-gp蛋白的抑制劑鹽酸維拉帕米(verapamil hydrochloride, VER)[25]、MRP2蛋白的抑制劑丙磺舒(probenecid, PROB)[26]作比較，探討JCGLPP是否具有抑制MDR1和MRP2基因表達(dá)的作用，旨在為其能否逆轉(zhuǎn)MDR現(xiàn)象，發(fā)揮臨床應(yīng)用作用提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞來(lái)源 Caco-2細(xì)胞(美國(guó)菌種保藏中心)傳代至30～50代.

1.1.2 藥物與試劑 JCGLPP由國(guó)家菌草工程技術(shù)研究中心提供；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、磷酸緩沖鹽溶液(PBS)、非必需氨基酸、青霉素/鏈霉素、Trypsin(0.25%)購(gòu)于美國(guó)Gibco公司；PROB、CCK-8試劑盒、Trizol Invitrogen購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司；VER購(gòu)于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；二甲基亞砜(DMSO)購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(HiScript Ⅲ 1st Strand cDNA Synthesis Kit)、qPCR試劑盒購(gòu)于南京諾維贊生物科技股份有限公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純.

1.1.3 儀器與設(shè)備 BPN-150CH CO2培養(yǎng)箱購(gòu)于上海一恒科學(xué)儀器有限公司；1-16K臺(tái)式離心機(jī)購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；TS100倒置顯微鏡購(gòu)于日本Nikon公司；5100-0001程序降溫盒、Nano Drop 2000超微量分光光度計(jì)購(gòu)于美國(guó)Thermo Scientific公司；Power Pac Basic電泳儀、CFX96熒光定量PCR儀購(gòu)于美國(guó)Bio-Rad公司.

1.2 Caco-2細(xì)胞的培養(yǎng)

將Caco-2細(xì)胞接種在DMEM完全培養(yǎng)基[含10%胎牛血清、1%(青霉素+鏈霉素)、1%非必需氨基酸]上置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)至細(xì)胞融合度達(dá)80%～90%時(shí)即可使用，其間每天換液.

1.3 JCGLPP對(duì)Caco-2細(xì)胞存活率影響的試驗(yàn)

采用CCK-8比色法檢測(cè)不同含量JCGLPP對(duì)Caco-2細(xì)胞存活率的影響,以VER和PROB為陽(yáng)性對(duì)照藥物.調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105個(gè)·mL-1，以每孔100 μL的量接種至96孔板上，靜置20 min后于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)24 h.24 h后，吸去培養(yǎng)液用PBS沖洗，再分別加入JCGLPP(0.1、1、10、20、50、100、200、500 μg·mL-1)、VER(25、50、100、200 μmol·L-1)、PROB(100、500、1 000、2 000 μmol·L-1)培養(yǎng)24 h，測(cè)定前吸去藥液，每孔加入10 μL CCK-8試劑，于培養(yǎng)箱中孵育1 h后，用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm波長(zhǎng)處的光密度(D)，計(jì)算細(xì)胞存活率.

式中，孔中未加入藥物的組別為對(duì)照組，孔中未接種細(xì)胞的組別為空白組.

1.4 Caco-2細(xì)胞中MDR1、MRP2基因表達(dá)水平的測(cè)定

1.4.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及分組 試驗(yàn)設(shè)JCGLPP給藥組(10 μg·mL-1)、VER陽(yáng)性藥物組(50 μmol·L-1)、PROB陽(yáng)性藥物組(500 μmol·L-1)、空白組、對(duì)照組.對(duì)照組加入DMEM培養(yǎng)基，空白組不接種細(xì)胞.每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔.

1.4.2 細(xì)胞總RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Caco-2細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為3×105個(gè)·mL-1，接種于6孔板上置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后分別加入2 mL受試藥品(JCGLPP、VER、PROB)，放入培養(yǎng)箱中孵育1、12、24、48 h后收集細(xì)胞，提取總RNA.取4 μL 200 ng·μL-1RNA，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書的步驟反轉(zhuǎn)錄成cDNA.

1.4.3 目的基因表達(dá)水平的熒光定量PCR檢測(cè) 目的基因的引物序列如表1所示.PCR反應(yīng)體系：上下游引物各0.2 μL、5 μL qPCR Mix、0.5 μL cDNA、4.1 μL無(wú)核酸酶純水.PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性300 s，94 ℃變性45 s，55 ℃退火15 s,72 ℃延伸12 s，43個(gè)循環(huán).

表1 熒光定量PCR引物序列Table 1 Primer sequences for real-time fluorescence quantitative PCR

根據(jù)擴(kuò)增曲線讀取Ct值，以GAPDH為內(nèi)參基因，與各樣品的目的基因MDR1和MRP2進(jìn)行相對(duì)定量，利用相對(duì)定量中的 2-ΔΔCt算法分析基因的表達(dá)量.

1.5 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，應(yīng)用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析.組間比較用單因素方差分析或t檢驗(yàn)，P<0.05表示差異顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2 結(jié)果與分析

2.1 Caco-2細(xì)胞培養(yǎng)狀態(tài)

將Caco-2細(xì)胞接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中于37℃、5% CO2的條件下培養(yǎng)，24 h內(nèi)細(xì)胞基本可完成貼壁生長(zhǎng)，繼續(xù)培養(yǎng)2～3 d，細(xì)胞生長(zhǎng)量可達(dá)到細(xì)胞培養(yǎng)瓶底面積的80%～90%.在倒置顯微鏡下可觀察到Caco-2細(xì)胞彼此間緊密相連，呈不規(guī)則狀多邊形，細(xì)胞間隙清晰.細(xì)胞形態(tài)如圖1所示.

2.2 JCGLPP對(duì)Caco-2細(xì)胞存活率的影響

采用CCK-8比色法檢測(cè)Caco-2細(xì)胞在不同水平JCGLPP、VER、PROB作用下的存活率，細(xì)胞存活率越高，表示藥物對(duì)細(xì)胞毒性越低，試驗(yàn)結(jié)果如圖2、圖3所示.

圖1 Caco-2細(xì)胞形態(tài)(×200)Fig.1 Morphology of Caco-2 cells(×200)

由圖2可見(jiàn)：與不含藥物的對(duì)照組相比，各含量JCGLPP對(duì)Caco-2細(xì)胞無(wú)毒害作用，且部分含量的JCGLPP對(duì)細(xì)胞有一定的增殖活性(P<0.01)；當(dāng)JCGLPP含量為10 μg·mL-1時(shí)，細(xì)胞存活率為124%.因此選擇10 μg·mL-1JCGLPP研究其對(duì)Caco-2細(xì)胞中MDR1和MRP2基因表達(dá)水平的影響.

由圖3可見(jiàn)，與不含藥物的對(duì)照組相比，陽(yáng)性對(duì)照藥物VER和PROB均對(duì)Caco-2細(xì)胞無(wú)明顯的毒性作用，考慮到細(xì)胞存活率越高，越方便開展下一步試驗(yàn)，因此選擇50 μmol·L-1VER、500 μmol·L-1PROB分別研究對(duì)Caco-2細(xì)胞中MDR1和MRP2基因表達(dá)水平的影響.

*表示與CK相比差異顯著(P<0.05)，**表示與CK相比差異極顯著(P<0.01).圖3 陽(yáng)性藥物對(duì)Caco-2細(xì)胞存活率的影響Fig.3 Effect of positive medicines on the survival rate of Caco-2 cells

2.3 目的基因熔解曲線和擴(kuò)增曲線的構(gòu)建

通過(guò)觀察引物的熔解曲線和擴(kuò)增曲線可以判斷所選引物是否具有特異性.從圖4、圖5可以看出：在目的基因MDR1、MRP2和內(nèi)參基因GAPDH的熔解曲線中，兩尖峰無(wú)其他雜峰，上下游引物的熔解溫度(Tm)為80～90 ℃，說(shuō)明引物特異性較好；擴(kuò)增曲線均呈“S”型走勢(shì)，表明擴(kuò)增狀態(tài)良好.

A:熔解曲線;B:擴(kuò)增曲線.圖4 內(nèi)參基因的熔解曲線和擴(kuò)增曲線Fig.4 Melting curve and amplification curve of internal reference gene

2.4 JCGLPP對(duì)Caco-2細(xì)胞MDR1基因表達(dá)水平的影響

分別用10 μg·mL-1JCGLPP和50 μmol·L-1VER給藥1、12、24、48 h后測(cè)定 Caco-2細(xì)胞中MDR1基因的表達(dá)水平.結(jié)果(表2)顯示：VER和JCGLPP均可顯著下調(diào)MDR1基因的表達(dá)水平，且隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，VER對(duì)MDR1基因的抑制效果逐漸減弱，而JCGLPP對(duì)MDR1基因的抑制效果逐漸增強(qiáng)；當(dāng)JCGLPP作用48 h后，MDR1基因的表達(dá)水平最低，抑制作用最大.

表2 JCGLPP對(duì)Caco-2細(xì)胞MDR1基因表達(dá)水平的影響1)Table 2 Effect of JCGLPP on MDR1 gene expression in Caco-2 cells at different treatment time

2.5 JCGLPP對(duì)Caco-2細(xì)胞MRP2基因表達(dá)水平的影響

分別用10 μg·mL-1JCGLPP和500 μmol·L-1PROB給藥1、12、24、48 h后測(cè)定Caco-2細(xì)胞中MRP2基因的表達(dá)水平.結(jié)果(表3)顯示：JCGLPP作用1 h后，MRP2基因表達(dá)變?nèi)?，但隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，MRP2基因表達(dá)增強(qiáng)；作用1 h與作用12、24 h間、作用48 h與作用12、24 h間的表達(dá)量差異達(dá)極顯著水平，表明JCGLPP對(duì)MRP2基因表達(dá)水平的影響與作用時(shí)間相關(guān).PROB對(duì)Caco-2細(xì)胞作用1、24 h后可抑制MRP2基因的表達(dá)；作用12、48 h后可增強(qiáng)MRP2基因的表達(dá).

表3 JCGLPP對(duì)Caco-2細(xì)胞MRP2基因表達(dá)水平的影響1)Table3 Effect of JCGLPP on MRP2 gene expression in Caco-2 cells at different treatment time

3 結(jié)論

本研究結(jié)果表明：JCGLPP對(duì)Caco-2細(xì)胞無(wú)毒性，且呈一定的細(xì)胞增殖活性；在抑制外排蛋白P-gp的編碼基因MDR1方面，JCGLPP在作用1～48 h后，顯著下調(diào)了MDR1基因的表達(dá)水平，抑制作用的強(qiáng)弱與時(shí)間呈正相關(guān)，抑制能力優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照藥物VER；在抑制外排蛋白MRP2的編碼基因MRP2方面，JCGLPP在作用1 h后，下調(diào)了MRP2基因的表達(dá)水平，但在作用12、24 h后，上調(diào)了MRP2基因的表達(dá)水平.JCGLPP能在短時(shí)間內(nèi)抑制MRP2基因的表達(dá)，而長(zhǎng)時(shí)間則能促進(jìn)其表達(dá)，而陽(yáng)性對(duì)照藥物PROB對(duì)MRP2基因的表達(dá)呈無(wú)規(guī)律狀態(tài)，相關(guān)原因有待進(jìn)一步研究.綜上，JCGLPP可替代VER作為P-gp蛋白的抑制劑，推測(cè)JCGLPP與化療藥物共同使用時(shí)可以逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞多藥耐藥現(xiàn)象，為JCGLPP的臨床應(yīng)用提供參考.