一株耐鹽堿細菌的篩選鑒定及其對植物的促生作用

呂正陽, 邵登科, 張春源, 賴澤成, 李望豪, 周瑞鵬, 劉梓燁, 王榮波, 林占熺, 魯國東,5, 葉文雨

[1.福建農(nóng)林大學(xué)國家菌草工程技術(shù)研究中心，福建 福州 350002；2.福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，植物與微生物相互作用福建省高校重點實驗室，福建 福州 350002；3.福建農(nóng)林大學(xué)未來技術(shù)學(xué)院 (海峽聯(lián)合研究院)，福建 福州 350002；4.福建省作物有害生物監(jiān)測與治理重點實驗室，福建 福州 350013；5.福建農(nóng)林大學(xué)植物保護學(xué)院，福建 福州 350002]

土壤鹽堿化是世界旱作農(nóng)區(qū)突出的生態(tài)環(huán)境問題[1].據(jù)統(tǒng)計，鹽堿土資源遍及世界100多個國家，總面積約達10億hm2[2].我國現(xiàn)有鹽堿地面積高達 9.9×106hm2，這些鹽堿地中具有農(nóng)業(yè)發(fā)展?jié)摿Φ恼嘉覈乜偯娣e的10%以上，是我國優(yōu)良的土地儲備資源，如果不加以改良利用，會造成極大的資源浪費[3].土壤鹽分的增加是一種破壞性的非生物脅迫，抑制了植物的正常生長和發(fā)育，導(dǎo)致農(nóng)業(yè)產(chǎn)量大幅下降，破壞了自然地區(qū)的生態(tài)平衡[4-6].鹽脅迫的存在會導(dǎo)致植物產(chǎn)生離子毒害和滲透脅迫，引起植物氧化損傷，增強土傳病原菌的侵染能力[7]，嚴重影響農(nóng)業(yè)生產(chǎn)效益、危害環(huán)境安全.因此，對土壤鹽堿化的治理迫在眉睫.

我國鹽堿地治理方法主要分為工程法、化學(xué)法、生物法，其中，生物法治理鹽堿地的成本較低、生態(tài)安全性好，具有良好的生態(tài)效益并能夠長期改良鹽堿土壤[8].巨菌草(CenchrusfungigraminusZ. X. Lin & D.M. Lin & S. R. Lan sp. nov.)原產(chǎn)于非洲，為禾本科(Gramineae)蒺藜草屬(CenchrusL.)植物，其根系發(fā)達、抗逆性強，年產(chǎn)鮮草可達200～400 t·hm-2，巨菌草目前已被作為優(yōu)質(zhì)飼料、生物燃料等，在農(nóng)牧業(yè)生產(chǎn)和生態(tài)環(huán)境改良上被廣泛應(yīng)用[9-11].巨菌草在鹽漬地的生物量大且根系發(fā)達，有利于固定土壤，且對沙質(zhì)化鹽漬地改良效果較好，土質(zhì)化鹽漬地改良效果相對一般，對鹽漬化土壤的改良起重要作用[12-13]，并且已經(jīng)初步應(yīng)用于鹽堿地的治理[14].玉米是我國三大糧食作物之一，與巨菌草同屬于禾本科，屬于鹽敏感作物，土壤鹽漬化嚴重危害玉米產(chǎn)量[15].植物根際促生菌是指通過自身生命活動，直接或間接促進植物生長的微生物[16]，如假單胞菌(Pseudomonas)[17]、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)[18]等.此外，一些根際微生物還能夠增強植物抗逆境生長能力，抑制有害微生物生長繁殖，不僅對植物體、自然環(huán)境無害，而且許多根際促生菌還有參與植物自身代謝活動和改善生態(tài)環(huán)境的功能[19-20]，具有良好的研究和應(yīng)用價值.

本試驗從福建莆田鹽堿地中分離、篩選出1株耐鹽堿能力最強的解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)PT6-1，對其生理生化特性以及其對巨菌草、玉米耐鹽堿性和抗氧化酶活性等相關(guān)指標(biāo)的影響進行試驗探究，為應(yīng)用耐鹽堿微生物與巨菌草聯(lián)合治理鹽堿地，增強農(nóng)作物的耐鹽堿生長能力提供材料.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試土壤、菌株、植物材料等 供試土壤：2021年5月采集福建省莆田市秀嶼區(qū)安柄村3年生火龍果地15～20 cm根際鹽堿土壤，裝于無菌密封袋，帶回實驗室立即處理.供試菌株：PT6-1，分離保存于福建農(nóng)林大學(xué)植物與微生物相互作用福建省高校重點實驗室.巨菌草幼苗：采集自福建農(nóng)林大學(xué)后山菌草基地.玉米種子：中玉九號，購自吉林省春城種業(yè)有限公司.

1.1.2 培養(yǎng)基 細菌生長培養(yǎng)基：LB培養(yǎng)基[21]；生理生化特性測定培養(yǎng)基：CAS檢測培養(yǎng)基(鐵載體)[21]、蒙娜金有機磷培養(yǎng)基[21]、無機磷培養(yǎng)基[21]、Ashby無氮培養(yǎng)基[21]、淀粉水解培養(yǎng)基[21]、脫脂乳粉培養(yǎng)基[21]、解硅酸鹽培養(yǎng)基[21]、明膠液化培養(yǎng)基[21]、CMC培養(yǎng)基(纖維素酶)[22]、King發(fā)酵培養(yǎng)基[23].

1.2 方法

1.2.1 耐鹽堿細菌的分離、保藏及耐鹽堿能力篩選 準確稱取5 g土壤樣品與45 mL無菌水混勻置于三角瓶內(nèi)，37 ℃搖床振蕩0.5 h，冰浴30 min，取上清液1 mL，用無菌水梯度稀釋至10-4、10-5，取100 μL上清稀釋液涂布于NaCl濃度為5%、pH值為9(NaOH調(diào)節(jié))的耐鹽堿能力篩選LB平板，37 ℃黑暗恒溫倒置培養(yǎng)48 h，盡可能挑取菌落外觀形態(tài)不同的細菌單菌落，劃線在新的耐鹽堿篩選平板上，連續(xù)劃線純化3次后保藏[21].用不同濃度NaCl作為單一鹽脅迫處理、NaOH調(diào)節(jié)不同pH值作為單一堿脅迫處理，配制不同的LB液體篩選培養(yǎng)基，以1%的接種量接種細菌菌液，37 ℃，200 r·min-1培養(yǎng)36 h，每隔3 h測定1次培養(yǎng)液在600 nm處的光密度(D600 nm)的吸光度.通過菌株生長情況判斷其是否能夠耐受當(dāng)前濃度的鹽、堿脅迫.篩選出耐鹽、耐堿能力最強的菌株，繪制其在常規(guī)LB培養(yǎng)基、含PT6-1可耐受的最高濃度NaCl的LB培養(yǎng)基、可耐受最高pH值的LB培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)的生長曲線.

1.2.2 PT6-1的分子鑒定 以細菌16S rRNA通用引物27F、1492R對篩選出的耐鹽堿細菌PT6-1的16S rRNA進行擴增[21]，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳驗證，將正確的條帶送至擎科生物科技有限公司測序，測序結(jié)果在NCBI的GenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上進行Blast序列對比，下載高同源性序列，采用MEGA X軟件，鄰近相接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹.

1.2.3 PT6-1生理生化特性 測定PT6-1解有機磷[21]、無機磷[21]、解硅酸鹽[21]、固氮[21]、產(chǎn)IAA[23]、產(chǎn)鐵載體[21]、明膠液化[21]、產(chǎn)淀粉水解酶[21]、產(chǎn)蛋白酶[21]、產(chǎn)纖維素酶[22]、產(chǎn)接觸酶能力[22]的有無，對產(chǎn)生透明圈的平板進行透明圈直徑(D)和菌落直徑(d)測量，計算溶解比(D·d-1)，固氮酶活性測定用細菌固氮酶ELISA檢測試劑盒(上海優(yōu)選生物科技有限公司).利用革蘭氏染色試劑盒(購自索萊寶生物科技有限公司)對其進行革蘭氏染色[24]，光學(xué)顯微鏡觀察染色結(jié)果.

1.2.4 PT6-1對巨菌草、玉米在鹽堿條件下生長的促進效果 將NaCl以0.3%的比例添加至植物營養(yǎng)土，用自來水和適量NaOH混合后加入土壤，使土壤含水量為40%～50%、pH 值為8.5～9.0，模擬自然條件下的重度鹽堿地.巨菌草幼苗、玉米幼苗在未施加鹽堿脅迫的營養(yǎng)土中培育，待幼苗培育至出芽第7天(株高約8～12 cm)，將幼苗移栽入試驗鹽堿土盆中進行下一步操作.

取出苗約7 d、生長狀況相近的巨菌草幼苗(苗高約為8～12 cm)，移栽至鹽堿脅迫營養(yǎng)土中， 3株苗1盆，共6盆，其中3盆為對照組(CK)，3盆為PT6-1菌液灌根處理組.移栽后當(dāng)天進行第1次灌根，每盆的灌根量為20 mLD600 nm=1.0的PT6-1菌液，用自來水稀釋10倍進行澆灌，對照組澆灌20 mL LB液體培養(yǎng)基，用10倍自來水稀釋.每隔7 d重復(fù)進行1次灌根處理，從幼苗移栽當(dāng)日開始計時，待幼苗生長第28天收獲并測定其每盆植株的株高、莖粗、總鮮質(zhì)量、地上鮮質(zhì)量、地下鮮質(zhì)量、總干質(zhì)量、地上干質(zhì)量、地下干質(zhì)量，玉米的處理方式和測定指標(biāo)與巨菌草相同(移栽日玉米幼苗株高約10～15 cm).

1.2.5 PT6-1對巨菌草、玉米在鹽堿脅迫下光合色素含量、抗氧化酶活性的影響 巨菌草、玉米種植，菌液灌根處理方法同1.2.4，取第1次菌液處理后生長第28天的巨菌草、玉米植株，每個處理及對照隨機取3株進行測定，測定葉片的總光合色素含量、葉綠素含量，葉片超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性、根系過氧化物酶(peroxidase，POD)活性和葉片過氧化氫酶(catalase，CAT)活性，試驗重復(fù)3次[25].

2 結(jié)果與分析

2.1 耐鹽堿細菌的分離、篩選

分離、篩選出1株耐鹽堿能力最強的細菌， 將它命名為PT6-1，其耐NaCl 最高濃度為2.4 mol·L-1，最高耐堿pH值為12.PT6-1在pH值為12的LB液體培養(yǎng)基和NaCl濃度為2.4 mol·L-1的LB液體培養(yǎng)基中均能正常傳代培育，但相較于常規(guī)LB液體培養(yǎng)基其延滯期增長(圖1).

2.2 PT6-1的分子鑒定

對PT6-1進行菌液PCR后經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(圖2)，PT6-1的16S rRNA片段約1 600 bp.根據(jù)測序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站的Blast下載相似序列，MEGA X軟件鄰接法建樹(圖3)，結(jié)合其菌落平板形態(tài)，鑒定PT6-1為解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens).

2.3 PT6-1生理生化特性

PT6-1在LB平板上菌落呈白色，菌落不透明且黏性較強(圖4A)；PT6-1為革蘭氏陽性菌，經(jīng)革蘭氏染色后顯微鏡下菌體呈藍紫色，短桿狀(圖4B)，符合解淀粉芽孢桿菌的形態(tài)特征.PT6-1利用無機磷、解硅酸鹽、固氮、淀粉水解、蛋白水解、產(chǎn)鐵載體、產(chǎn)纖維素酶、產(chǎn)接觸酶等能力呈陽性(圖4C-4J)，固氮酶活性為(179.77±4.62) U·L-1.其余測定指標(biāo)：解有機磷能力、明膠液化能力、吲哚物質(zhì)產(chǎn)生能力為陰性.產(chǎn)生、利用效率(溶解比)=(透明圈直徑D)/(菌落直徑d)，PT6-1在解蛋白、解淀粉、解無機磷、產(chǎn)鐵載體、降解纖維素能力在各種培養(yǎng)基上的溶解比分別為3.87、2.08、1.26、2.49、4.95(圖5)，PT6-1的解蛋白、解淀粉、產(chǎn)鐵載體和降解纖維素能力較強，平板透明圈大且明顯，利用無機磷能力較弱，平板上僅有較小的透明圈.

圖1 菌株P(guān)T6-1在不同培養(yǎng)條件下的生長曲線Fig.1 Growth curves of strain PT6-1 under different culture conditions

圖3 PT6-1的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of PT6-1

A：平板生長形態(tài)；B：革蘭氏染色(藍紫色)，×100(放大倍數(shù))；C：利用無機磷能力測定；D：固氮能力測定；E：利用硅酸鹽能力測定；F：產(chǎn)蛋白酶能力測定；G：產(chǎn)淀粉水解酶能力測定；H：產(chǎn)接觸酶能力測定；I：產(chǎn)鐵載體能力測定；J：產(chǎn)纖維素酶能力測定.圖4 PT6-1生理生化特性Fig.4 Physiological and biochemical properties of PT6-1

圖5 PT6-1的幾種生理生化能力的產(chǎn)生、利用效率Fig.5 Production and utilization efficiency of several physiological and biochemical abilities of PT6-1

2.4 PT6-1菌液對巨菌草、玉米耐鹽堿生長的促進效果

施加PT6-1菌液組的巨菌草，相較于對照組株高、莖粗、總鮮質(zhì)量、地上鮮質(zhì)量、地下鮮質(zhì)量、總干質(zhì)量、地上干質(zhì)量、地下干質(zhì)量分別增加了23.1%、25.33%、45.73%、53.29%、27.24%、44.23%、46.19%、32.35%(表1、圖6).經(jīng)PT6-1菌液處理的玉米，相較于對照組株高、莖粗、總鮮質(zhì)量、地上鮮質(zhì)量、地下鮮質(zhì)量、總干質(zhì)量、地上干質(zhì)量、地下干質(zhì)量分別增加了38.03%、35.85%、123.02%、163.63%、56.27%、126.15%、153.66%、72.00%； PT6-1菌液處理組的巨菌草和玉米各項生物量指標(biāo)相較于其對照組均顯著增加，其中玉米相比于巨菌草的增加量更多，總鮮質(zhì)量、總干質(zhì)量達到對照組2倍多.施加PT6-1菌液顯著增加了巨菌草、玉米在鹽堿條件下生物量的積累，PT6-1菌液處理組的巨菌草、玉米葉片相比于對照組顏色更綠，植株更高，根系更加發(fā)達.

表1 施加PT6-1菌液的巨菌草、玉米耐鹽堿生長的生物量統(tǒng)計1)Table 1 Growth of C. fungigraminus and maize applied with PT6-1 aqueous solution under saline-alkali soils

A：巨菌草地上部分比較；B：對照組巨菌草根系；C：PT6-1處理組巨菌草根系；D：玉米地上部分比較；E：對照組玉米根系；F：PT6-1處理組玉米根系.圖6 施加PT6-1菌液對巨菌草、玉米在鹽堿條件下生長的影響Fig.6 Effect of PT6-1 aqueous solution on growth of C. fungigraminus and maize under saline-alkali soils

2.5 PT6-1對巨菌草、玉米在鹽堿脅迫下光合色素含量、抗氧化酶活性的影響

施加PT6-1菌液組的巨菌草和玉米相比于對照組(圖7)，葉片總光合色素含量、葉綠素含量、根系POD活性、葉片CAT活性均顯著提高，巨菌草分別提高了156.37%、155.69%、68.14%、11.84%，玉米分別提高了77.26%、81.06%、18.25%、9.59%，但是巨菌草、玉米葉片的SOD活性與對照組無顯著差異.在PT6-1處理下，巨菌草和玉米相比于對照組植株，POD、CAT活性顯著提高，葉片的葉綠素和光合色素總量顯著升高，說明施加PT6-1菌液能提高巨菌草、玉米的POD、CAT活性，幫助其清除自身氧化損傷，增強其耐鹽堿生長能力和抗逆性.PT6-1菌液的施加提高了巨菌草、玉米的光合色素和葉綠素的含量，增加了植物的光合作用強度，提高了植物的代謝水平，進而提高植物的干物質(zhì)積累和植株抗逆性.

A：SOD活性；B：POD活性；C：CAT活性；D：總光合色素含量；E：葉綠素含量.*代表菌液處理組與同植物對照組數(shù)據(jù)間存在顯著差異(P<0.05).圖7 施加PT6-1菌液對巨菌草、玉米的光合色素及抗氧化酶活性的影響Fig.7 Effect of PT6-1 aqueous solution on photosynthetic pigments and antioxidant enzyme activities of C. fungigraminus and maize

3 討論

從福建莆田火龍果根際鹽堿土壤中分離、篩選出1株耐鹽堿能力最強的解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)PT6-1，其最高耐受2.4 mol·L-1的NaCl，最高耐堿pH值為12.PT6-1擁有固氮、溶解無機磷、產(chǎn)鐵載體等多種促進植物生長相關(guān)的生理生化能力，且能夠增加巨菌草、玉米在鹽堿脅迫下的生物量積累，可以定義PT6-1是耐鹽堿能力較強的根際促生菌.近年來，根際促生菌在促進植物生長、改良生態(tài)環(huán)境方面被廣泛報道.研究表明，貝萊斯芽孢桿菌GB03可以顯著提高擬南芥、棉花等植株的抗逆性，促進植物生長，還能參與調(diào)控苜蓿結(jié)瘤固氮[26].馮健等[27]研究表明，施加解磷細菌能夠促進黃瓜吸收土壤中的微量元素，促進黃瓜生長.李艷梅等[28]研究表明，產(chǎn)鐵載體芽孢桿菌HSGJ1可以顯著提高花生對金屬鎳脅迫的抗性，提高花生的生物量，鐵載體在植物促生、環(huán)境修復(fù)、臨床中具有較大的應(yīng)用空間[29].

細菌通常通過離子滲透調(diào)節(jié)和積累小分子化合物幫助自身應(yīng)對鹽堿脅迫[30].微生物、植物和土壤在自然環(huán)境中存在著廣泛的相互作用[31-32]，細菌對植物耐鹽堿能力的影響主要有滲透調(diào)節(jié)、酶活性調(diào)節(jié)、激素調(diào)節(jié)和促生作用等[7].PT6-1主要通過促生作用增強代謝和提高抗氧化酶活性以幫助植物耐鹽堿脅迫.施加PT6-1菌液顯著提高了巨菌草、玉米在鹽堿脅迫下生長的生物量，提高了植株P(guān)OD活性、CAT活性和總光合色素含量，POD、CAT是植物清除體內(nèi)氧化損傷的關(guān)鍵酶，反映著植物的抗逆水平和代謝強度[25].鹽堿脅迫會降低植物的代謝強度、抑制根系營養(yǎng)吸收、導(dǎo)致葉片氣孔關(guān)閉.植物的光合作用在鹽堿脅迫下會被明顯抑制，表現(xiàn)為葉片發(fā)黃，光合色素含量、葉綠素含量顯著降低等[7].施加PT6-1菌液，顯著增加了植株在鹽堿脅迫生長條件下的光合色素含量，增強了植物光合作用，PT6-1增強植物耐鹽堿的其他機理還有待進一步研究.有研究表明，利用微生物參與改良鹽堿地是可行的，并且有較好效果，微生物聯(lián)合植物治理鹽堿地具有成本低、生態(tài)和經(jīng)濟效益好等優(yōu)點，在未來可以逐步替代物理法、化學(xué)法而廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)實踐[33-35].

解淀粉芽孢桿菌被國內(nèi)外學(xué)者研究后報道為一種益生菌[36]，被廣泛應(yīng)用于抑制動植物病原菌.但其耐鹽堿促生能力和治理鹽堿地的應(yīng)用卻鮮有報道，PT6-1作為分離自鹽堿地且耐鹽堿能力和促生能力較強的根際益生菌，具有較好的科學(xué)研究和應(yīng)用前景.