一株菌草內(nèi)生細(xì)菌的分離鑒定及促生特性

邵登科, 呂正陽(yáng), 李望豪, 周瑞鵬, 賴(lài)澤成, 張春源, 樊改麗, 王榮波, 林占熺, 魯國(guó)東,5, 葉文雨

(1.福建農(nóng)林大學(xué)國(guó)家菌草工程技術(shù)研究中心，福建 福州 350002；2.福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，植物與微生物相互作用福建省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350002；3.廈門(mén)市綠化管理中心，福建 廈門(mén) 361004；4.福建省作物有害生物監(jiān)測(cè)與治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350013；5.福建農(nóng)林大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，福建 福州 350002)

巨菌草(CenchrusfungigraminusZ. X. Lin & D. M. Lin & S. R. Lan sp. nov.)是由福建農(nóng)林大學(xué)林占熺研究員從非洲引進(jìn)的一類(lèi)禾本科(Gramineae)的草本植物[1].巨菌草含有豐富的纖維素和粗蛋白，可以“以草代木”，為食用菌、藥用菌等提供大量養(yǎng)分，而且巨菌草具有生物量大、資源豐富、適應(yīng)性強(qiáng)、營(yíng)養(yǎng)成分高和不易受到生物入侵等優(yōu)點(diǎn)，目前在中國(guó)青海、新疆和內(nèi)蒙古的沙地和鹽堿地等都有巨菌草的栽培[2].

植物內(nèi)生菌是一類(lèi)能夠與宿主植物共生的細(xì)菌，在植物中的作用非常廣泛.內(nèi)生菌具有一定的抗病作用，如王蘭英等[3]在砂仁中分離和鑒定出一種能有效控制水稻紋枯病的內(nèi)生菌.內(nèi)生菌還能分泌一定量的植物生長(zhǎng)素吲哚乙酸(indoleacetic acid, IAA)、ACC脫氨酶(1-aminocyclopropane-1-carboxylicacid deaminase)等多種生理活性物質(zhì)，能夠幫助植物快速生長(zhǎng).

類(lèi)芽孢桿菌(Paenibacillus)是適用于生物防治、植物促生的重要菌種.有研究表明[4]，類(lèi)芽孢桿菌可產(chǎn)生IAA、細(xì)胞分裂素(cytokinin,CTK)、赤霉素(GA3) 和脫落酸(abscisic acid,ABA)等促生相關(guān)生長(zhǎng)因子，能夠提高植物的產(chǎn)量、品質(zhì)以及抗逆境生長(zhǎng)的能力.鄧云[5]在小麥赤霉病抗性鑒定圃土壤中篩選出1株多粘類(lèi)芽孢桿菌菌株DY04，其對(duì)小麥赤霉病的抑菌率高達(dá)58.43%，并且其促生作用可在一定程度上提高小麥的產(chǎn)量.牛永艷等[6]對(duì)污泥中分離出的1株多粘類(lèi)芽孢桿菌SWS-15進(jìn)行了一系列研究，發(fā)現(xiàn)其發(fā)酵液中存在IAA、CTK、GA3和ABA等生長(zhǎng)因子，能夠顯著提高玉米的生物量.

本試驗(yàn)通過(guò)稀釋涂布平板的方法，在巨菌草的健康葉片中分離并篩選出1株具有溶磷和分泌IAA能力的內(nèi)生細(xì)菌，對(duì)其16S rDNA序列進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，測(cè)定其產(chǎn)鐵載體、蛋白水解、淀粉水解等生理生化特性并對(duì)盆栽玉米的促生效果進(jìn)行研究.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌草 樣品于2022年1月8日在福建農(nóng)林大學(xué)后山菌草種植基地采集.

1.1.2 培養(yǎng)基 細(xì)菌生長(zhǎng)LB 液體培養(yǎng)基[7]，配制固體時(shí)應(yīng)加2%瓊脂；King液體培養(yǎng)基[8]，用于測(cè)定菌株IAA分泌能力；有機(jī)磷細(xì)菌培養(yǎng)基[8]、無(wú)機(jī)磷細(xì)菌培養(yǎng)基[9]，用于測(cè)定菌株的溶磷能力；淀粉水解培養(yǎng)基[7]、明膠液化培養(yǎng)基[7]、營(yíng)養(yǎng)瓊脂(NA)培養(yǎng)基[7]、脫脂乳粉培養(yǎng)基[10]、 CAS檢測(cè)培養(yǎng)基(鐵載體)[10]、硅酸鹽細(xì)菌培養(yǎng)基[11]，用于菌株生理生化特性測(cè)定.

1.1.3 玉米種子 鄭單958品種由合肥市合豐種業(yè)有限公司提供.

1.2 方法

1.2.1 內(nèi)生細(xì)菌的分離與純化 表面消毒處理：將新鮮、健康的巨菌草葉片組織用自來(lái)水洗去表面的泥土和灰塵，洗凈后切成長(zhǎng)3 cm的片段，用75%酒精浸泡3 min，再用2%次氯酸鈉浸泡2 min，用無(wú)菌水沖洗葉片3次以上，取最后1次沖洗葉片的無(wú)菌水100 μL涂布于LB平板，28 ℃培養(yǎng)2 d，若LB平板上無(wú)菌落生長(zhǎng)則認(rèn)為表面消毒徹底，反之則不徹底.

取表面徹底消毒的巨菌草葉片組織5 g(去掉中脈)，用消毒剪刀剪碎，加入到無(wú)菌的研缽中，加無(wú)菌水研磨，將上清液稀釋至1、10、102、103、104，各取100 μL稀釋液涂布于LB平板上，28 ℃培養(yǎng)2 d后進(jìn)行編號(hào)、計(jì)數(shù).挑取不同形態(tài)的菌落于LB平板劃線純化3次以上，挑取最后1次純化的單菌落用60%的滅菌甘油于-20 ℃保存[12-14].

1.2.2 內(nèi)生細(xì)菌形態(tài)學(xué)鑒定 (1)菌落形態(tài):將巨菌草健康葉片中分離的內(nèi)生細(xì)菌用LB液體培養(yǎng)基活化，將菌懸液劃線于LB平板并置于28 ℃培養(yǎng)箱，培養(yǎng)12 h后觀察平板中菌落的形狀大小、顏色變化、邊緣完整和凸起情況等指標(biāo)，拍照并記錄特征[15].

(2)革蘭氏染色:吸取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的10 μL菌懸液于載玻片中固定，用結(jié)晶紫對(duì)其進(jìn)行初染，1 min后用無(wú)菌水進(jìn)行沖洗，吸干水分后用碘液對(duì)其進(jìn)行媒染，1 min后再次進(jìn)行沖洗，吸干水分并用95%乙醇脫色，輕輕晃動(dòng)載玻片30 s后沖洗，最后番紅染色1 min，水洗后吸干水分在顯微鏡下觀察.

1.2.3 內(nèi)生細(xì)菌的篩選 將分離、純化的內(nèi)生細(xì)菌接種于LB液體培養(yǎng)基中活化12～18 h，使其處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，通過(guò)溶磷能力的測(cè)定以及IAA分泌試驗(yàn)篩選出1株促生效果好的內(nèi)生細(xì)菌[16].

(1)溶磷能力的測(cè)定:吸取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌懸液5 μL，分別接種到無(wú)機(jī)磷和有機(jī)磷細(xì)菌培養(yǎng)基中心，28 ℃培養(yǎng)5 d后，觀察菌落周?chē)该魅芙馊χ睆?，判定菌株的溶磷能力[17].對(duì)產(chǎn)生的透明溶磷圈和菌落直徑進(jìn)行測(cè)量并計(jì)算出菌株的溶解指數(shù)(solubilization index,SI)和溶解效率(solubilization efficiency,SE).

(2)IAA分泌:試驗(yàn)中采用改良Salkowski比色法，參照林國(guó)欽等[18]方法進(jìn)行菌株培養(yǎng)、比色等，用King液體培養(yǎng)基代替菌懸液作空白對(duì)照，向King液體培養(yǎng)基中加入等體積的0、10、30、50、80 μg·mL-1的3-吲哚乙酸溶液作陽(yáng)性對(duì)照.每個(gè)處理3次重復(fù)，用酶標(biāo)儀測(cè)量530 nm波長(zhǎng)下的光密度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出各菌株的IAA含量(mg·L-1).

1.2.4 分子鑒定 將篩選出的菌株FJU3進(jìn)行活化，以菌懸液作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增.所用的引物27F和1492R由天根生化科技有限公司合成[19].PCR反應(yīng)體系參照劉彥超等[19]方法進(jìn)行，檢測(cè)基因片段約1 542 bp，電泳條帶正確并送往福州擎科生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序.

將擴(kuò)增獲得的基因序列提交至NCBI的GenBank基因庫(kù)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)進(jìn)行BLAST 對(duì)比，利用MEGA-X軟件，最大似然方法(maximum likelihood)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù).

1.2.5 內(nèi)生細(xì)菌生理生化特性測(cè)定 將菌株FJU3接種于LB液體培養(yǎng)基活化12～18 h，使其處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，測(cè)定其生理生化特性，包括蛋白酶能力試驗(yàn)、淀粉水解酶試驗(yàn)、產(chǎn)鐵載體能力測(cè)定、解硅酸鹽能力測(cè)定、明膠液化試驗(yàn)、接觸酶試驗(yàn).以上試驗(yàn)按照文獻(xiàn)[20]的方法.

1.2.6 內(nèi)生細(xì)菌對(duì)玉米的促生能力測(cè)定 先將玉米種子浸泡于75%酒精3 min，置于2%次氯酸鈉中再浸泡5 min，用無(wú)菌水沖洗至表面無(wú)包衣，置于含有等量營(yíng)養(yǎng)土的盆栽，每個(gè)處理5次重復(fù).待玉米長(zhǎng)至三葉一心時(shí)，每盆分別灌根20 mL(D600 nm=1)的菌液，用等量的LB液體培養(yǎng)基灌根作為空白對(duì)照，之后每隔7 d灌根1次，待處理組與對(duì)照組植株長(zhǎng)勢(shì)出現(xiàn)顯著差異時(shí)(20 d)分別測(cè)量鮮質(zhì)量、干質(zhì)量、根長(zhǎng)、株高和莖粗等生理指標(biāo)，并進(jìn)行拍照記錄[21-22].

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)生細(xì)菌的分離

從巨菌草健康葉片中分離出5株內(nèi)生細(xì)菌，分別編號(hào)為FLV1、FLV2、FJU3、FJU4和FJU5.

2.2 內(nèi)生細(xì)菌形態(tài)學(xué)鑒定

形態(tài)學(xué)分析表明(圖1A)，在LB平板中5株內(nèi)生細(xì)菌的菌落邊緣整齊，呈黃色，為黏稠狀，不透明，形狀規(guī)則；革蘭氏染色(圖1B)中菌株FLV2、FJU3和FJU4為G+菌(藍(lán)紫色)，菌株FLV1和FJU5為G-菌(紅色).

A.內(nèi)生細(xì)菌的菌落形態(tài)(A1-A5:菌株FLV1、FLV2、FJU3、FJU4、FJU5);B.內(nèi)生細(xì)菌的革蘭氏染色(B1-B5:菌株FLV1、FLV2、FJU3、FJU4、FJU5)，×100(顯微鏡倍數(shù)).圖1 內(nèi)生細(xì)菌的菌落形態(tài)及革蘭氏染色Fig.1 Colony morphology and Gram-staining of endophytic bacteria

2.3 內(nèi)生細(xì)菌的篩選

2.3.1 溶磷能力 除菌株FJU5外，其余4株內(nèi)生細(xì)菌均能在無(wú)機(jī)磷細(xì)菌培養(yǎng)基中出現(xiàn)透明溶磷圈(圖2A)；有機(jī)磷細(xì)菌培養(yǎng)基中菌株FJU3和FJU5出現(xiàn)了透明溶磷圈(圖2B)；菌株FJU3均能在無(wú)機(jī)磷和有機(jī)磷細(xì)菌培養(yǎng)基中出現(xiàn)透明溶磷圈，則證明菌株FJU3具有一定的溶磷能力，即能將難溶性磷轉(zhuǎn)變?yōu)榭扇苄粤?圖2A-A3和圖2B-B3)；菌株FJU3在無(wú)機(jī)磷細(xì)菌培養(yǎng)基中SI和SE最高，分別為2.34和1.38，且顯著高于其他菌株(圖2C和2D)；菌株FJU3在有機(jī)磷細(xì)菌培養(yǎng)基中SI和SE最高，分別為2.76和1.79，且略高于菌株FJU5(圖2E和F).

A-B.內(nèi)生細(xì)菌在無(wú)機(jī)磷和有機(jī)磷細(xì)菌培養(yǎng)基中的透明溶磷圈(A1,B1:菌株FLV1;A2,B2:菌株FLV2;A3,B3:菌株FJU3;A4,B4:菌株FJU4;A5,B5:菌株FJU5);C-D.內(nèi)生細(xì)菌在無(wú)機(jī)磷中的溶解指數(shù)(SI)和溶解效率(SE),不同小寫(xiě)字母表示不同處理間差異顯著(P<0.05);E-F.內(nèi)生細(xì)菌在有機(jī)磷中的溶解指數(shù)(SI)和溶解效率(SE).圖2 內(nèi)生細(xì)菌的溶磷分析Fig.2 Analysis of phosphorus solubilization by endophytic bacteria

2.3.2 IAA分泌 通過(guò)改良Salkowski比色法研究表明，5株內(nèi)生細(xì)菌均出現(xiàn)不同程度的紅色(圖3A).對(duì)5株內(nèi)生細(xì)菌分泌IAA的能力進(jìn)行定量分析，與對(duì)照組相比，菌株FJU3分泌IAA的濃度達(dá)到了14.2 mg·L-1，且顯著高于其他菌株(圖3B).因此，結(jié)合菌株的溶磷和IAA分泌能力，挑選菌株FJU3進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn).

A.內(nèi)生細(xì)菌分泌 IAA能力的定性分析(0～80:IAA標(biāo)準(zhǔn)液的濃度梯度,顏色越深其濃度越高,單位為mg·L-1;CK:King液體培養(yǎng)基;處理組:菌株FLV1、FLV2、FJU3、FJU4、FJU5);B.內(nèi)生細(xì)菌分泌IAA能力的定量分析(CK:King液體培養(yǎng)基;處理組:菌株FLV1、FLV2、FJU3、FJU4、FJU5),不同小寫(xiě)字母表示不同處理間差異顯著(P<0.05).圖3 內(nèi)生細(xì)菌的IAA分析Fig.3 Analysis of IAA secreted by endophytic strain

2.4 分子鑒定

M:Marker D2000;1～5:菌株FJU3的電泳條帶.圖4 菌株FJU3 16S rDNA電泳結(jié)果Fig.4 Electropherogram of 16S rDNA from strain FJU3

采用細(xì)菌通用引物擴(kuò)增菌株FJU3的保守序列，擴(kuò)增后得到片段約1 542 bp，獲得16S rDNA序列(圖4).根據(jù)NCBI中BLAST搜索結(jié)果，與數(shù)據(jù)庫(kù)內(nèi)的已知序列進(jìn)行比對(duì)分析.系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)表明(圖5)，菌株FJU3與解淀粉類(lèi)芽孢桿菌(Paenibacillusamylolyticus)16S rDNA基因序列在同一分支內(nèi)，親緣關(guān)系最近，同源性為98%，因此可初步判斷菌株FJU3為解淀粉類(lèi)芽孢桿菌.

2.5 內(nèi)生細(xì)菌生理生化特性

2.5.1 產(chǎn)蛋白酶能力 在蛋白酶能力試驗(yàn)中，菌株FJU3經(jīng)過(guò)28 ℃培養(yǎng)5 d后，觀察發(fā)現(xiàn)脫脂乳粉培養(yǎng)基中菌落周?chē)霈F(xiàn)了透明圈(圖6A).因此，菌株FJU3能夠產(chǎn)生一定的蛋白水解酶.

2.5.2 產(chǎn)淀粉水解酶能力 在淀粉水解培養(yǎng)基的菌落周?chē)渭舆m量碘液，觀察發(fā)現(xiàn)菌落周?chē)饾u出現(xiàn)黃色透明圈，證明菌株FJU3能夠產(chǎn)生淀粉水解酶(圖6B).

圖5 菌株FJU3的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.5 Phylogenetic tree of strain FJU3

2.5.3 產(chǎn)鐵載體能力 在產(chǎn)鐵載體能力試驗(yàn)中，菌株FJU3經(jīng)過(guò)28 ℃培養(yǎng)3 d后，觀察發(fā)現(xiàn)CAS檢測(cè)培養(yǎng)基中出現(xiàn)較小的橘黃色透明圈，說(shuō)明菌株FJU3能夠產(chǎn)生一定的鐵載體，但較弱(圖6C).

2.5.4 解硅酸鹽能力 將菌株FJU3菌懸液于硅酸鹽培養(yǎng)基進(jìn)行劃線，28 ℃培養(yǎng)5 d后，觀察發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中有大量的菌落生長(zhǎng)(圖6D).因此，菌株FJU3具有降解硅酸鹽能力，能夠?yàn)橹参锾峁┮恍┪⒘吭?

2.5.5 明膠液化 菌株FJU3菌懸液處理后的明膠液化培養(yǎng)基中未出現(xiàn)液化現(xiàn)象，說(shuō)明菌株FJU3不能產(chǎn)生明膠酶，不能使其明膠分解為氨基酸后使其失去凝聚力，此試驗(yàn)為陰性反應(yīng)(圖6E).

2.5.6 接觸酶反應(yīng) 取菌株FJU3菌落于載玻片，將3%的H2O2滴在載玻片上并靜置3 min后進(jìn)行觀察，與無(wú)菌落的對(duì)照組相比，菌株FJU3具有過(guò)氧化氫酶，能形成大量氧分子，從而有氣泡產(chǎn)生(圖6F).因此，該試驗(yàn)為陽(yáng)性反應(yīng).

A.產(chǎn)蛋白酶能力;B.淀粉水解酶試驗(yàn);C.產(chǎn)鐵載體能力;D.解硅酸鹽能力;E.明膠液化試驗(yàn);F.接觸酶試驗(yàn)[處理組(左),對(duì)照組(右)].圖6 菌株FJU3的生理生化特性Fig.6 Physiological and biochemical characteristics of strain FJU3

2.6 玉米的盆栽試驗(yàn)

在玉米長(zhǎng)到三葉一心后用菌懸液灌根處理，每7 d灌根1次，玉米生長(zhǎng)出現(xiàn)明顯差異時(shí)(20 d)進(jìn)行指標(biāo)測(cè)量.通過(guò)觀察玉米幼苗的生長(zhǎng)情況可知，經(jīng)菌株FJU3菌懸液灌根處理的玉米苗干質(zhì)量、鮮質(zhì)量、根長(zhǎng)、株高、莖粗等生理指標(biāo)均優(yōu)于對(duì)照組的玉米苗(圖7A、7B).與對(duì)照組相比，菌株FJU3處理的玉米苗的地上部各項(xiàng)指標(biāo)均有所提升，地上部鮮質(zhì)量(圖9A)和株高(圖8C)的提升效果較顯著，分別提升了76%和41%，干質(zhì)量(圖9B)和莖粗(圖8D)分別提高38%和27%(圖7C、7D和圖8).菌株FJU3處理的地下部鮮質(zhì)量(圖9A)最高且顯著高于對(duì)照組，增加了24%；干質(zhì)量(圖9B)與對(duì)照組相比提高了15%；根長(zhǎng)(圖10C)略有增加，僅增加了3%(圖7E、7F和圖9).

A.盆栽對(duì)照組(等量的LB液體培養(yǎng)基);B.盆栽處理組(菌株FJU3菌懸液);C.對(duì)照組株高;D.處理組株高;E.對(duì)照組根部;F.處理組根部.圖7 菌株FJU3對(duì)玉米的促生作用Fig.7 Growth-promoting effect of strain FJU3 on maize

圖8 菌株FJU3對(duì)玉米地上部生理指標(biāo)的影響Fig.8 Effect of strain FJU3 on physiological indexes of maize aboveground part

圖9 菌株FJU3對(duì)玉米地下部生理指標(biāo)的影響Fig.9 Effect of strain FJU3 on physiological indexes of maize underground part

3 討論

巨菌草作為一種“致富脫貧”草，經(jīng)20余年的發(fā)展和選育，為幾內(nèi)亞等眾多貧困國(guó)家和地區(qū)的農(nóng)業(yè)發(fā)展提供了幫助[23-24].鄧振山等[25]在巨菌草根部共分離出103株內(nèi)生細(xì)菌，在小麥盆栽試驗(yàn)中與對(duì)照組相比，有4株菌株能夠促進(jìn)小麥生長(zhǎng)，同時(shí)也證明了用混合菌液處理小麥幼苗，其生長(zhǎng)狀況要優(yōu)于單菌處理的觀點(diǎn).

類(lèi)芽孢桿菌(Paenibacillus)作為生防菌和根際促生菌中重要的一類(lèi)，能夠在一定程度上提高植物干質(zhì)量和鮮質(zhì)量等生長(zhǎng)指標(biāo)[26].董愛(ài)菊等[27]將類(lèi)芽孢桿菌菌株QHZ11-gfp定殖在馬鈴薯體內(nèi)，使馬鈴薯的塊莖產(chǎn)量得到了一定的增加.王希等[28]通過(guò)用海洋多粘類(lèi)芽孢桿菌L1-9的發(fā)酵液處理黃瓜種子，發(fā)現(xiàn)其對(duì)黃瓜幼苗具有一定的促生效果.喬俊卿等[29]證實(shí)了芽孢桿菌菌株B1619能夠促進(jìn)番茄葉片的光合、蒸騰作用.崔文艷等[30]研究表明，能夠促進(jìn)玉米生長(zhǎng)的解淀粉芽孢桿菌B1619-Y2同時(shí)具有分泌IAA、溶磷、解鉀和固氮的性能.何碧珀等[31]研究表明，經(jīng)解淀粉芽孢桿菌B10-26稀釋一定倍數(shù)的發(fā)酵液對(duì)芝麻進(jìn)行處理，其種子的發(fā)芽率以及幼苗鮮質(zhì)量、干質(zhì)量等均得到提高.

本試驗(yàn)從巨菌草的健康葉片中分離并篩選出1株具有溶磷和IAA分泌能力的內(nèi)生細(xì)菌，經(jīng)形態(tài)學(xué)和16S rDNA分子生物學(xué)鑒定為解淀粉類(lèi)芽孢桿菌(Paenibacillusamylolyticus)，并命名為FJU3.此外，菌株FJU3在產(chǎn)鐵載體、接觸酶、淀粉水解酶和解硅酸鹽的生理生化特性試驗(yàn)中均為陽(yáng)性反應(yīng).玉米盆栽促生試驗(yàn)結(jié)果表明，用菌株FJU3菌懸液處理玉米幼苗，與對(duì)照相比，促生效果比較顯著的是地上部鮮質(zhì)量和株高，分別提高了76%和41%，干質(zhì)量和莖粗分別增加了38%和27%，在地下部中鮮質(zhì)量提高了24%，干質(zhì)量增加了15%，根長(zhǎng)略有增加，僅增加了3%.因此，解淀粉類(lèi)芽孢桿菌FJU3可促進(jìn)玉米生物量積累，使玉米產(chǎn)量得到一定的提高，并可制作成微生物菌肥，減少農(nóng)藥以及化肥的使用，從而對(duì)改善環(huán)境起到重要作用.