珍珠粟WOX家族全基因組鑒定及表達(dá)

蔣定坤, 易 超,2, 羅 琳,2, 朱方捷,2,3, 肖嘉靖,3, 林占熺,2

(1.福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院；2.福建農(nóng)林大學(xué)國家菌草工程技術(shù)研究中心;3.福建農(nóng)林大學(xué)海峽聯(lián)合研究院，福建 福州350002)

在非洲、南亞的干旱和半干旱地區(qū)，玉米、高粱等作物均無法種植，珍珠粟(Cenchrusamericanus)則是這些地區(qū)重要的作物之一.季節(jié)間和季節(jié)內(nèi)的降雨量變化往往是限制珍珠粟產(chǎn)量的重要環(huán)境因素之一[1-2].珍珠粟是干旱地區(qū)農(nóng)村貧困人口糧食安全的重要組成部分，但近年來也因其可作為飼料逐漸受到重視.

含有同源結(jié)構(gòu)域蛋白的同源異形盒轉(zhuǎn)錄因子被分為14個家族，其中包括與WUSCHEL(WUS)蛋白相關(guān)的同源異形盒(WOX)轉(zhuǎn)錄因子家族.WOX家族基因編碼的轉(zhuǎn)錄因子是植物特異性轉(zhuǎn)錄因子，具有由60～66個對植物特定功能至關(guān)重要的氨基酸組成的“螺旋—環(huán)—螺旋—轉(zhuǎn)角—螺旋”保守結(jié)構(gòu)域.根據(jù)擬南芥WOX的進(jìn)化關(guān)系將WOX家族基因成員分為3個進(jìn)化分支，即現(xiàn)代支、中間支、古代支.除了擬南芥，WOX家族基因在核桃[3]、花生[4]、桃樹、梨、杏[5]、楊樹[6]、水稻、玉米等植物中被廣泛研究.在這些植物中，WOX家族基因參與植物生長發(fā)育的整體調(diào)控，包括莖頂端分生組織發(fā)育、側(cè)生器官發(fā)育、植物干細(xì)胞的形成與維持、花器官生長等.WOX1同源基因已被證實可以控制玉米、矮牽牛、苜蓿、煙草的葉片生長[7-9].近年來，一些研究也表明了WOX家族基因可以在旱稻、棉花、蕓苔等作物中響應(yīng)非生物脅迫和激素刺激.雖然WOX家族基因在多個植物中均有研究，但目前對珍珠粟WOX家族基因成員的鑒定和表達(dá)特征研究尚未見報道.

本研究利用生物信息學(xué)方法對珍珠粟WOX家族基因進(jìn)行系統(tǒng)鑒定，并對其編碼的蛋白理化性質(zhì)、保守基序、基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析及啟動子區(qū)域順式作用元件預(yù)測；通過構(gòu)建珍珠粟和其他代表性植物WOX家族成員系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹解析珍珠粟WOX家族基因成員的進(jìn)化歷史；同時使用實時熒光定量PCR檢測珍珠粟WOX家族基因成員的表達(dá)模式，旨在為進(jìn)一步探究珍珠粟WOX家族基因功能及其在珍珠粟生長發(fā)育中的作用提供有價值的信息.

1 材料與方法

1.1 序列數(shù)據(jù)下載

珍珠粟、紫象草(Pennisetumpurpureumcv. ‘Purple’)的全基因組數(shù)據(jù)和基因組注釋文件分別來源于NCBI數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)和國家基因組科學(xué)數(shù)據(jù)中心(CNCB)(https://bigd.big.ac.cn/).擬南芥(Arabidopsisthaliana)、水稻(Oryzasativa)的WOX蛋白序列來源于植物轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫PlantTFDB(http://planttfdb.gao-lab.org/).

1.2 珍珠粟WOX家族基因成員的鑒定

使用HMMER 3.0軟件和Pfam數(shù)據(jù)庫(http://pfam-legacy.xfam.org/)中的WOX隱馬爾科夫模型文件(PF00046)檢索珍珠粟WOX家族基因成員，并以PlantTFDB數(shù)據(jù)庫(http://planttfdb.gao-lab.org/index.php)中的擬南芥WOX蛋白為檢索序列在候選珍珠粟WOX家族成員中利用BLAST工具進(jìn)行比對，設(shè)置閾值為1×10-5.利用結(jié)構(gòu)域預(yù)測工具SMART(http://smart.embl.de/smart/batch.pl)、NCBI-CDD(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi)驗證候選珍珠粟WOX蛋白是否含有WOX結(jié)構(gòu)域，參數(shù)為默認(rèn)參數(shù).

1.3 珍珠粟WOX家族基因結(jié)構(gòu)及蛋白保守序列的預(yù)測

使用MEME軟件(http://meme-suite.org/tools/meme)分析珍珠粟WOX蛋白的保守序列.最大基序數(shù)量設(shè)置為10個，最佳基序?qū)挾仍O(shè)置為6～50[10].使用TBtools軟件展示W(wǎng)OX家族基因結(jié)構(gòu)和保守基序展示圖.提取WOX家族成員結(jié)構(gòu)域序列，使用DNAMAN軟件比對并使用SWISS-MODEL網(wǎng)站(https://swissmodel.expasy.org)預(yù)測WOX蛋白結(jié)構(gòu)域模型.

1.4 珍珠粟WOX蛋白質(zhì)理化性質(zhì)的分析及亞細(xì)胞定位的預(yù)測

利用在線網(wǎng)站ExPASyProtParam(https://web.expasy.org/protparam/)對所有候選的WOX蛋白序列進(jìn)行分子質(zhì)量、等電點、不穩(wěn)定系數(shù)、親水系數(shù)等理化性質(zhì)分析.利用CELLO網(wǎng)站(http://cello.life.nctu.edu.tw/)對各蛋白質(zhì)進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測[11].

1.5 珍珠粟WOX家族基因啟動子區(qū)域順式作用元件預(yù)測

選取珍珠粟WOX家族基因上游2 000 bp的序列為基因啟動子序列，利用在線分析網(wǎng)址PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)進(jìn)行順式作用元件預(yù)測并利用TBtools軟件進(jìn)行可視化展示.

1.6 珍珠粟WOX家族基因染色體定位

根據(jù)基因組注釋信息分析珍珠粟WOX家族基因染色體定位及相關(guān)結(jié)構(gòu)[12].

1.7 珍珠粟WOX家族基因系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹的構(gòu)建

為解析珍珠粟WOX家族基因的進(jìn)化歷史，對珍珠粟、擬南芥、水稻、紫象草等物種WOX家族成員進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化分析.根據(jù)PlantTFDB數(shù)據(jù)庫中已鑒定的擬南芥、水稻W(wǎng)OX蛋白序列及本地鑒定的珍珠粟、紫象草WOX蛋白序列，利用MUSCLE算法(默認(rèn)參數(shù))對4個物種WOX蛋白進(jìn)行多序列比對，并利用IQ-TREE軟件(http://www.cibiv.at/software/iqtree)使用最大似然法(MLE)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，其中，校驗參數(shù)Bootstrap值設(shè)置為1 000次重復(fù)[13-14].使用在線網(wǎng)站EvolView對進(jìn)化樹進(jìn)行美化.利用MCScanX工具鑒定珍珠粟與水稻、紫象草之間的共線性關(guān)系，使用TBtools、Cricos軟件進(jìn)行可視化展示.

1.8 珍珠粟WOX家族基因表達(dá)水平的檢測

從NCBI數(shù)據(jù)庫下載干旱處理1～144 h共8個時間點的珍珠粟根部轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)(登錄號:SRX13533560)[15].干旱處理設(shè)置為：珍珠粟在播種生長14 d后，用20%聚乙二醇6000(PEG-6000)溶液澆灌.利用Fastp工具對下機(jī)數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制[16]，將過濾后的測序數(shù)據(jù)利用Hisat2工具比對到珍珠粟參考基因組中[17]，再利用HTSEQ工具計算各個基因的序列數(shù)，并進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，得到不同條件下的基因表達(dá)水平(FPKM).利用R包Pheatmap工具對WOX家族基因成員的表達(dá)量進(jìn)行繪圖.從上述有表達(dá)的WOX家族基因成員中挑選5個進(jìn)行表達(dá)量分析.按照Omega Plant RNA kit試劑盒說明書的步驟提取珍珠粟不同組織(根、莖、葉片、花、種子)樣品中的總RNA，用全式金反轉(zhuǎn)錄試劑盒ransScript?One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix合成cDNA.采用β-肌動蛋白(β-actin)作為實時熒光定量PCR檢測的內(nèi)參基因，測定基因在不同組織中的相對表達(dá)水平[18].WOX基因和內(nèi)參基因擴(kuò)增所用的引物序列如附件表Ⅰ(掃OSID碼可見)所示.PCR反應(yīng)體系(20 μL)：8.2 μL超純水(ddH2O)、上下游引物(10 μmol·L-1)各0.4 μL、1 μL cDNA、10 μL 2×SYBR Green qPCR Master Mix.PCR反應(yīng)程序:樣品預(yù)變性95 ℃ 30 s、變性95 ℃ 5 s、退火和延伸60 ℃ 30 s(在此階段收集熒光信號),總共進(jìn)行45個循環(huán)；60 ℃緩慢遞增到95 ℃，每隔0.5 s采集熒光信號構(gòu)建熔解曲線.采用2-ΔΔCt法對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，基因表達(dá)水平取來自3個生物學(xué)重復(fù)樣本的平均值.

2 結(jié)果與分析

2.1 珍珠粟WOX家族基因成員的鑒定

為了系統(tǒng)鑒定珍珠粟WOX家族基因成員，先通過HMMER軟件和BLAST工具比對搜索得到珍珠粟候選WOX家族基因成員，再通過NCBI-CDD和SMART網(wǎng)站對其是否含有WOX結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測篩選，最終鑒定到15個WOX家族基因成員.

2.2 珍珠粟WOX家族基因結(jié)構(gòu)及蛋白保守序列

通過MEME軟件對珍珠粟WOX蛋白進(jìn)行保守基序預(yù)測，結(jié)果(圖1)顯示，WOX家族基因成員具有2個保守基序：基序1、2(附件圖Ⅰ，掃OSID碼可見).其中僅PMA5G03287缺失基序2，這可能導(dǎo)致該基因與其他WOX家族基因成員在功能上存在差異；而基序1在所有家族基因成員中均存在，為WOX家族基因成員所共有.基序1、2 共同組成了完整的WOX結(jié)構(gòu)域.此外，保守基序3～10僅存在于由PMA5G00052、PMA2G04992、PMA6G00316組成的亞群中，表明該亞群的成員可能存在與其他分支蛋白不同的生物學(xué)功能.提取包含WOX蛋白的同源異型結(jié)構(gòu)域序列并用DNAMAN軟件進(jìn)行多序列比對，結(jié)果(圖2A)顯示，位于螺旋1上的Q、L，螺旋2上的P，螺旋3上的W、F、Q、N、R這幾個氨基酸高度保守，這幾個氨基酸可能是WOX蛋白行使其功能所必需的.PMA2G04992、PMA5G00052、PMA5G03287、PMA6G00316在螺旋2上的氨基酸與其他WOX家族基因成員有差異，這可能影響其功能.使用SWISS-Model網(wǎng)站對WOX蛋白的同源異型結(jié)構(gòu)域進(jìn)行同源建模，結(jié)果(圖2B)顯示，同源異型結(jié)構(gòu)域由螺旋—環(huán)—螺旋—轉(zhuǎn)角—螺旋構(gòu)成，這一結(jié)構(gòu)在WOX家族基因中高度保守.其中，螺旋—轉(zhuǎn)角—螺旋所組成的HTH結(jié)構(gòu)通過氫鍵或疏水作用與DNA相結(jié)合.

2.3 珍珠粟WOX家族蛋白的理化性質(zhì)及亞細(xì)胞定位

對鑒定的珍珠粟WOX家族蛋白序列進(jìn)行理化性質(zhì)分析，結(jié)果(附件表Ⅱ，掃OSID碼可見)表明，珍珠粟WOX家族蛋白的氨基酸個數(shù)為216～859,蛋白質(zhì)分子質(zhì)量為24.51～93.10 ku,等電點為5.28～9.35，差異較大.其中，5個為酸性蛋白，等電點小于6.5；7個為堿性蛋白，等電點大于7.5；3個為中性蛋白，等電點為6.5～7.5.蛋白質(zhì)不穩(wěn)定系數(shù)為49.85～86.36，均大于40，為不穩(wěn)定蛋白；親水性指數(shù)大多為-0.779～ -0.059，均為負(fù)數(shù)，表明這些蛋白大多數(shù)為親水蛋白，但親水程度不同；脂肪系數(shù)為50.42～86.63，平均值為58.33，其中，PMA5G00052編碼的蛋白脂肪系數(shù)最大(86.63)，PMA4G01060編碼的蛋白脂肪系數(shù)最小(50.42).亞細(xì)胞定位預(yù)測顯示，PMA6G00316、PMA2G04992定位于細(xì)胞膜上，PMA5G00052定位于細(xì)胞質(zhì)上，其余定位于細(xì)胞核上.

圖1 珍珠粟WOX家族基因結(jié)構(gòu)及保守基序Fig.1 Gene structure and conserved motifs of WOX gene family in C.americanus

圖2 珍珠粟WOX結(jié)構(gòu)域氨基酸序列比對(A)及三維模型預(yù)測(B)Fig.2 Amino acid sequence alignment (A) and three-dimensional model prediction (B) of WOX structural domain in C.americanus

2.4 珍珠粟WOX家族基因啟動子區(qū)域順式作用元件

為了研究珍珠粟WOX家族基因可能的調(diào)控機(jī)制，對其成員在啟動子區(qū)域(起始密碼子上游2 000 bp處)的植物激素響應(yīng)元件、光響應(yīng)元件、逆境響應(yīng)元件、生長發(fā)育調(diào)節(jié)元件等潛在順式作用元件進(jìn)行了預(yù)測.結(jié)果(圖3)顯示，啟動子區(qū)域主要存在光響應(yīng)元件、脫落酸響應(yīng)元件、茉莉酸甲酯響應(yīng)元件、玉米醇溶蛋白代謝元件、厭氧誘導(dǎo)響應(yīng)元件、生長素響應(yīng)元件、防御和應(yīng)激反應(yīng)元件、干旱誘導(dǎo)元件、胚乳發(fā)育元件、赤霉素響應(yīng)元件、低溫響應(yīng)元件、分生組織表達(dá)元件、水楊酸響應(yīng)元件、種子特異性響應(yīng)元件、根特異性元件、類黃酮生物合成基因調(diào)控元件等16種已知功能的順式作用元件.其中，光響應(yīng)元件、茉莉酸甲酯響應(yīng)元件、脫落酸響應(yīng)元件較多，分別為175、66、57個.PMA5G03287所含順式作用元件最少，為19個；PMA2G04992所含順式作用元件最多，為42個.啟動子區(qū)域均存在光響應(yīng)元件和脫落酸響應(yīng)元件，表明光和脫落酸可能調(diào)控WOX家族基因的表達(dá)；13個啟動子區(qū)域存在茉莉酸甲酯響應(yīng)元件.基于功能預(yù)測將順式作用元件劃分為不同類別的結(jié)果表明，與激素有關(guān)的順式作用元件最多(196個)，其次是光響應(yīng)元件(175個)、逆境響應(yīng)元件(53個)、生長發(fā)育調(diào)節(jié)元件(27個).

圖3 珍珠粟WOX家族基因啟動子區(qū)域順式作用元件預(yù)測Fig.3 Prediction of cis-element in promoter of WOX gene family in C.americanus

2.5 珍珠粟WOX家族基因染色體定位

基于全基因組對珍珠粟WOX家族基因進(jìn)行染色體定位并用TBtools軟件進(jìn)行可視化展示.結(jié)果(圖4)顯示：WOX家族基因成員在6條染色體上均有分布，且分布主要集中在各染色體近末端的位置；有2個基因分布在1號染色體上，1個基因分布在2號染色體上，2個基因分布在3號染色體上，2個基因分布在4號染色體上，3個基因分布在5號染色體上，5個基因分布在6號染色體上，7號染色體上沒有基因分布.

圖4 珍珠粟WOX家族基因染色體定位Fig.4 Chromosome location of WOX gene family in C.americanus

2.6 珍珠粟WOX家族基因系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化關(guān)系及共線性關(guān)系

為了進(jìn)一步分析珍珠粟WOX家族基因成員與其他物種同源基因的進(jìn)化關(guān)系，從PlantTFDB數(shù)據(jù)庫獲取了12個水稻家族基因成員(命名為OS-WOX01～12)、18個擬南芥WOX家族基因成員(命名為AT-WOX01～18)，并通過鑒定選取34個紫象草WOX家族基因成員(命名為CP-WOX01～34)，對上述4個物種WOX家族基因成員編碼的蛋白序列進(jìn)行比對并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹.結(jié)果(圖5)表明，4個物種79個WOX家族基因成員分為3個類群：古代支、中間支、現(xiàn)代支.古代支包含29個基因(水稻1個、紫象草20個、擬南芥3個、珍珠粟5個)；中間支包含16個基因(水稻5個、擬南芥7個、珍珠粟4個)；現(xiàn)代支包含34個基因(水稻6個、紫象草14個、擬南芥8個、珍珠粟6個)，為3個分支中最多的一個，且珍珠粟中的6個基因均包含WUS基序(T-L-X-L-F-P-X-X).每個分支均有水稻、擬南芥、珍珠粟的WOX家族基因成員分布，這說明珍珠粟物種的分化時間在WOX基因分化之后.

AT表示擬南芥；CP表示紫象草；OS表示水稻.圖5 WOX家族基因的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹Fig.5 Phylogenetic tree of WOX gene family

基因共線性是指由于基因組或者基因片段復(fù)制產(chǎn)生的同源基因，這些基因在序列上有相似性，且相鄰基因在染色體上的分布順序也相似.利用MCScanX軟件對珍珠粟WOX家族基因與水稻、紫象草所有基因之間進(jìn)行物種內(nèi)和物種間共線性分析，并使用TBtools、Cricos軟件將結(jié)果進(jìn)行可視化展示，結(jié)果如圖6所示.物種內(nèi)共線性分析(圖6A)表明，在珍珠粟WOX家族基因成員中，僅PMA6G04281、PMA1G06013經(jīng)歷了染色體片段復(fù)制.物種間共線性分析(圖6B)表明，珍珠粟、水稻、紫象草的共線性基因在各染色體上的分布不同，數(shù)量不一.珍珠粟5、6號染色體與水稻、紫象草之間的共線性基因較多.水稻與珍珠粟之間有15對基因具有共線性，紫象草與珍珠粟之間有34對基因具有共線性，表明這些基因是由同一個祖先分化而來，且珍珠粟與紫象草的親緣關(guān)系比與水稻的親緣關(guān)系更近.珍珠粟的基因數(shù)量是紫象草的一半，說明紫象草的二倍體祖先與珍珠粟具有高度相似的組成結(jié)構(gòu).

OS01～12表示水稻12條染色體序號；CA01～07表示珍珠粟7條染色體序號；CP01～14表示紫象草14條染色體序號.圖6 珍珠粟WOX家族基因物種內(nèi)(A)和物種間(B)的共線性關(guān)系Fig.6 Intra- (A) and inter-species (B) collinearity of WOX gene family in C.americanus

2.7 珍珠粟WOX家族基因成員的表達(dá)模式

干旱處理后對珍珠粟根部WOX家族基因成員表達(dá)量的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行了分析.結(jié)果(圖7)顯示，干旱處理144 h后，PMA6G04281、PMA6G00316、PMA5G03287、PMA5G01807的表達(dá)水平均有不同程度的上調(diào)，表明這4個基因可能在干旱脅迫的條件下發(fā)揮著重要作用.

D表示干旱處理，D_L表示干旱處理時間；CK表示對照處理，CK_L表示對照處理時間.圖7 不同時間干旱處理后珍珠粟根部WOX家族基因的表達(dá)圖譜Fig.7 Expression map of WOX gene family in C.americanus root after different durations of drought treatment

圖8 珍珠粟不同組織WOX家族基因的表達(dá)圖譜Fig.8 Expression map of WOX gene family in different tissues of C.americanus

為了明確WOX家族基因在珍珠粟不同組織中的表達(dá)特征，對種子、根、莖、葉、花序5個組織器官WOX家族基因的表達(dá)量進(jìn)行了分析.結(jié)果(圖8)表明，WOX家族基因成員在珍珠粟不同組織中的表達(dá)水平存在明顯差異.PMA6G05767、PMA6G05977、PMA2G04992、PMA5G00052、PMA5G03287在根、種子中均為低表達(dá)，推測這5個基因與根、種子的生長發(fā)育關(guān)系不大，其組織表達(dá)特性有待進(jìn)一步驗證；PMA6G05767、PMA6G05977、PMA5G00052、PMA5G03287在莖中均為高表達(dá)，推測這4個基因與莖的發(fā)育有關(guān)；PMA2G04992、PMA5G00052、PMA5G03287在花序中均為高表達(dá)，而在根、葉、種子、莖中相較于花序均為低表達(dá)，推測這3個基因在花序的發(fā)育過程中發(fā)揮了作用.綜上可知，珍珠粟WOX家族基因具有明顯的組織表達(dá)特異性，暗示著它們在不同組織中的生物學(xué)功能可能存在較大差異.

3 討論

WOX家族基因編碼的植物所特有的轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育及非生物脅迫過程中扮演著重要角色.目前已有研究解析了擬南芥WOX家族基因成員的數(shù)量和相關(guān)功能.如：WUS基因在擬南芥花藥器官的發(fā)生過程中能夠調(diào)控其分化[19]；WOX3基因的突變會導(dǎo)致擬南芥花瓣變窄或缺失[20]；WOX2基因在維持?jǐn)M南芥胚胎頂細(xì)胞正常功能和胚后發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用[21-22].

目前，WOX家族基因在水稻、高粱、玉米、擬南芥、油菜、棉花等植物中具有相關(guān)功能研究[23-25]，但對珍珠粟WOX家族基因的鑒定與分析尚未見報道.本研究鑒定得到了15個WOX家族基因成員，與水稻(13個)[23]、油茶(18個)[26]、中華獼猴桃(16個)[27]中的WOX家族基因成員數(shù)量接近，但遠(yuǎn)少于玉米(31個)[28]、陸地棉(37個)[24]、大豆(33個)[29]的數(shù)量.就WOX家族基因而言，珍珠粟具有更大的基因組和更少的基因數(shù)量，物種內(nèi)共線性分析顯示僅有一對基因有片段復(fù)制，表明珍珠粟在物種演化過程中沒有多次基因組倍增事件.蛋白理化性質(zhì)分析顯示，WOX家族基因所編碼的蛋白長短不一，分子質(zhì)量和等電點也存在差異，表明不同WOX家族基因成員可能存在生物學(xué)功能差異.其中，絕大多數(shù)珍珠粟WOX家族蛋白成員為不穩(wěn)定的親水性蛋白且定位于細(xì)胞核中，這與蒺藜苜蓿、鷹嘴豆、棉花、蘋果、烏拉爾圖小麥相似.本研究結(jié)果還顯示：珍珠粟WOX家族基因成員有2個保守基序(基序1、2)，這兩個保守基序共同組成了完整的同源異型結(jié)構(gòu)域；基序1中的W、F、Q、N、R及基序2中的Q、L、P在不同植物(中華獼猴桃、水稻、玉米、擬南芥、甘藍(lán)型油菜)WOX家族基因成員中均高度保守；且這些氨基酸位于結(jié)構(gòu)域的第2、3個α螺旋上，與DNA大溝中堿基的相互作用密切相關(guān).結(jié)合珍珠粟和其他植物(玉米、棉花、水稻)染色體定位結(jié)果表明，大部分植物WOX家族基因成員在進(jìn)化過程中在染色體上的位置分布依然保守.

基于最大似然法構(gòu)建珍珠粟、擬南芥、水稻、紫象草4個物種79個WOX家族蛋白成員系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，結(jié)合保守基序和基因結(jié)構(gòu)表明，聚類在同一分支下基因成員基序的個數(shù)、次序和基因結(jié)構(gòu)均相似，表明珍珠粟WOX家族基因在進(jìn)化中高度保守.古代支的3個家族基因成員基序個數(shù)和外顯子個數(shù)均遠(yuǎn)多于現(xiàn)代支和中間支，推測其參與調(diào)控的過程，功能與其他成員有所不同.值得注意的是,紫象草WOX家族基因與大多數(shù)植物均含有3個分支不同，僅在現(xiàn)代支和古代支有分布，缺少中間支成員，這與毛竹[30]類似，可能存在獨特的進(jìn)化方式.

本研究結(jié)果表明：在WOX家族基因啟動子區(qū)域存在著大量與植物生長發(fā)育、激素響應(yīng)、環(huán)境脅迫相關(guān)的順式作用元件；在15個啟動子區(qū)域中均發(fā)現(xiàn)脫落酸響應(yīng)元件，脫落酸具有降低和抵御干旱的作用[31]，推測珍珠粟WOX家族基因主要受脫落酸調(diào)控，從而抵御干旱；大部分珍珠粟WOX家族基因成員含有多個相同的順式作用元件.在啟動子區(qū)域存在著數(shù)量和種類不同的順式作用元件可能反映了基因在轉(zhuǎn)錄水平上的功能差異.

已有研究表明，擬南芥WOX13、WOX14在花中均有表達(dá)[32]，參與花器官的形成和花藥發(fā)育.WOX同源基因在矮牽牛[33]、番茄[34]的花瓣發(fā)育過程中也發(fā)揮著重要作用.本研究結(jié)果表明，在珍珠粟花序、莖中分別存在3和4個高表達(dá)WOX家族基因成員，推測其在花器官和莖尖分生組織中發(fā)揮了調(diào)控作用.