基于16S rRNA 測序技術(shù)研究染料木素和大豆苷元對大鼠腸道菌群的影響

高蔥蔥 ，葛 穩(wěn) ，方怡超，劉筱婧，陳衛(wèi)東，周婷婷*

1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，安徽 合肥 230012

2.中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué) 藥學(xué)系，上海 200433

淡豆豉源于《本草卉言》，為豆科植物大豆Glycine max(L.) Merr.的干燥成熟種子（黑豆）的發(fā)酵加工品，染料木素和大豆苷元是淡豆豉異黃酮中具有藥理作用的主要活性成分，均具有抗腫瘤、抗氧化、抑菌、調(diào)血脂、雌激素樣和抗雌激素等作用[1-2]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，淡豆豉異黃酮能與腸道菌群相互作用，直接或間接地改變機(jī)體腸道菌群結(jié)構(gòu)，使腸道中乳桿菌等多種有益菌群的豐度增加[3-4]。腸道菌群作為寄居在機(jī)體腸道內(nèi)的微生物群落，是機(jī)體后天形成的一個重要的“器官”，不僅參與機(jī)體的生理病理過程[5]，也參與藥物在體內(nèi)的代謝過程[6-7]。乳桿菌是一種廣泛用于人和動物疾病預(yù)防和治療中的重要益生菌，它不僅可以調(diào)節(jié)體內(nèi)β-葡萄糖苷酶的豐度[8-9]，還能調(diào)節(jié)II 相代謝酶的豐度[10-11]；前者有利于糖苷代謝為苷元，后者有利于苷元進(jìn)一步代謝為II 相代謝物排出體外。本研究從組分配伍的角度出發(fā)，利用淡豆豉異黃酮中具有藥理作用的主要活性成分染料木素和大豆苷元的不同比例來調(diào)節(jié)大鼠腸道菌群，嘗試找到能比擬淡豆豉調(diào)節(jié)大鼠腸道菌群中乳桿菌豐度的最佳條件，為后續(xù)進(jìn)一步研究淡豆豉異黃酮成分奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 動物

SPF 級雄性SD 大鼠24 只，6～8 周齡，體質(zhì)量（160±20）g，由杭州醫(yī)學(xué)院提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號SCXK（浙）2019-0002。動物于海軍軍醫(yī)大學(xué)動物實驗中心適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，每天接受12 h 光照，室溫（24±2）℃，相對濕度（50±10）%。動物實驗經(jīng)海軍軍醫(yī)大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 藥品與試劑

染料木素（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 98%，批號AF21021508）、大豆苷元（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98%，批號AF21021507）購自成都埃法生物科技有限公司；羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）購自生工生物股份有限公司；75%乙醇購自上海泰坦科技股份有限公司。

1.3 儀器

FA224 型電子天平（上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司）；HITECH 純水儀（上海泰和儀器有限公司）；KQ-800DE 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；-80 ℃超低溫冰箱（Panasonic 公司）。

2 方法

2.1 動物實驗

參考前期課題組淡豆豉異黃酮提取率和異黃酮中染料木素和大豆苷元所占比例，固定大豆苷元比例為1，給藥劑量折合生藥材0.2 g/kg。SD 大鼠隨機(jī)分為對照組、染料木素-大豆苷元（1∶1）組、染料木素-大豆苷元（2∶1）組和染料木素-大豆苷元（3∶1）組，每組6 只。染料木素-大豆苷元（1∶1）組ig 1.6 mg/mL 染料木素（8 mg/kg）和1.6 mg/mL大豆苷元（8 mg/kg），染料木素-大豆苷元（2∶1）組ig 3.2 mg/mL 染料木素（16 mg/kg）和1.6 mg/mL大豆苷元（8 mg/kg），染料木素-大豆苷元（3∶1）組ig 4.8 mg/mL 染料木素（24 mg/kg）和1.6 mg/mL大豆苷元（8 mg/kg），對照組ig 等體積0.5% CMCNa 溶液，1 次/d，連續(xù)28 d。

2.2 樣本收集

每7 天收取一次大鼠糞便，用棉簽蘸取75%乙醇于肛周消毒，并通過腹部按摩法促使大鼠排便，用滅菌鑷子無菌采集每組糞便于滅菌凍存管中，并置于-80 ℃保存，以待后續(xù)進(jìn)行16S rRNA 測序。

由于樣本量較大，故將各給藥組每次收集的大鼠糞便混合集中作為一個樣本，排除樣本間差異。除對照組外，各給藥組每個時間點收集的樣本為一組，分析不同給藥時間的大鼠菌群變化。

2.3 生物信息學(xué)分析

對基于Illumina NovaSeq PE250 測序平臺得到的原始數(shù)據(jù)（Raw Data）進(jìn)行拼接、濾過，得到有效數(shù)據(jù)。然后再對有效數(shù)據(jù)進(jìn)行可操作分類單元（operational taxonomic units，OTUs）聚類和物種分類分析。利用Uparse 算法（Uparse v7.0.1001）對所有樣本的有效數(shù)據(jù)，以97%的一致性進(jìn)行OTUs 聚類并對OTUs 的序列進(jìn)行物種注釋。使用MUSCLE軟件（Version 3.8.31）進(jìn)行快速多序列比對，得到代表序列的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系的所有OTUs。最后再對各樣本的數(shù)據(jù)進(jìn)行均一化處理，以樣本中數(shù)據(jù)量最少的為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行均一化處理，后續(xù)的各種分析都是基于均一化處理后的數(shù)據(jù)。根據(jù)OTUs 聚類結(jié)果，對OTUs 進(jìn)行多樣性指數(shù)分析，包括單樣本的多樣性分析（α 多樣性分析）和基于unifrac 算法的各組樣本之間的多樣性分析（β 多樣性分析）；根據(jù)分類學(xué)信息，在各分類水平上完成群落結(jié)構(gòu)的統(tǒng)計分析。

2.4 統(tǒng)計學(xué)分析

使用SPSS 23.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，采用單因素方差分析用于多組數(shù)據(jù)組間比較，兩組之間比較采用t檢驗。數(shù)據(jù)用表示。

3 結(jié)果

3.1 稀釋曲線和等級聚類曲線

稀釋曲線反映的是測序數(shù)據(jù)量的合理性和樣本中物種的豐富程度。它以從樣本中隨機(jī)抽取的測序數(shù)據(jù)量與其對應(yīng)的物種數(shù)來構(gòu)建曲線，當(dāng)曲線趨向平坦時，說明測序數(shù)據(jù)量漸進(jìn)合理，各樣本的稀釋曲線見圖1-a，可見樣本的測序深度滿足分析要求。等級聚類曲線能反映樣本中物種的豐富度和均勻度，各樣本的等級聚類曲線見圖1-b，在水平方向上，物種的豐富度由曲線的寬度來反映，寬度越大，物種的豐富度越高；在垂直方向上，物種的均勻程度由曲線的平滑程度來反映，物種分布越均勻，曲線越平緩[12]。

圖1 各樣本稀釋曲線圖 (a) 和等級聚類曲線圖 (b)Fig.1 Rarefaction curve (a) and rank abundance (b) of each sample

3.2 α 多樣性指數(shù)分析

大鼠腸道微生物菌群的豐富度和多樣性主要通過α 多樣性指數(shù)來反映，其中Shannon 及Simpson 指數(shù)用于評價群落分布多樣性，Shannon 指數(shù)越大，群落多樣性越高，物種分布越均勻；Simpson 指數(shù)與之相反。Chao1 及Ace 指數(shù)用于評價群落分布豐度，數(shù)值越大說明群落中含有的OTUs 數(shù)目越多，群落的豐度越大。如表1 所示，與對照組比較，給藥7、14、21、28 d 樣本的Simpson 指數(shù)顯著升高（P＜0.05、0.01），給藥28 d 樣本的Shannon 指數(shù)顯著升高（P＜0.01），表明大鼠糞便菌群多樣性顯著增加；給藥7、14、21 d 樣本的Chao1 指數(shù)和Ace 指數(shù)均顯著降低（P＜0.01），表明群落豐度顯著減小，給藥28 d 樣本的Chao1 指數(shù)和Ace 指數(shù)均顯著升高（P＜0.01），表明群落豐度顯著增大。表明給予染料木素和大豆苷元干預(yù)后，大鼠腸道菌群分布多樣性發(fā)生了不同程度的改變。

表1 各組腸道菌群多樣性 (,n=3)Table 1 Diversity of gut microbiota in each group (,n=3)

表1 各組腸道菌群多樣性 (,n=3)Table 1 Diversity of gut microbiota in each group (,n=3)

R-對照組 A-給藥7 d 樣本 B-給藥14 d 樣本 C-給藥21 d 樣本 D-給藥28 d 樣本 與R 組比較：*P＜0.05 **P＜0.01R-control group A-sample of 7 d after administration B-sample of 14 d after administration C-sample of 21 d after administration D-sample of 28 d after administration *P ＜ 0.05 **P ＜ 0.01 vs R group

3.3 β 多樣性分析

β 多樣性能反映不同組間的群落多樣性，主要用于樣本組間差異的比較。與unweighted unifrac 算法相比，weighted unifrac 算法在計算群落樣品之間的距離時候會考慮到樣品中OTUs 的豐度信息，而前者不考慮相對豐度信息，因此利用weighted unifrac 算法來分析樣本群落的多樣性。β 多樣性指數(shù)組間差異檢驗中，給藥7、21 d 樣本的菌群多樣性相對于對照組有顯著性變化（P＜0.05），但給藥14、28 d 樣本的菌群多樣性沒有顯著性變化。主坐標(biāo)分析（principal coordinates analysis，PCoA）評估了5 組樣本菌群結(jié)構(gòu)和組成中的β 多樣性，該分析的前2 個主成分分別解釋了總變量的51.9%和20.83%（圖2）。β 多樣性指數(shù)組間差異檢驗和PCoA結(jié)果表明，不同處理組中樣本在群落結(jié)構(gòu)和組成上和對照組之間的存在差異。

圖2 基于weighted unifrac 算法的PCoA 圖Fig.2 PCoA graph based on weighted unifrac algorithm

3.4 物種組成分析與差異性分析

如圖3 所示，門水平上，大鼠糞便菌群主要由擬桿菌門（Bacteroidota）和厚壁菌門（Firmicutes）組成，兩者約占全部菌群的90%，其中對照組中擬桿菌門占比約為 65.5%，厚壁菌門相對豐度為25.1%；給藥 7 d 樣本的擬桿菌門相對豐度為38.2%，厚壁菌門占比約為50.7%；給藥14 d 樣本的擬桿菌門相對豐度為53.2%，厚壁菌門相對豐度為40.6%；給藥21 d 樣本的擬桿菌門相對豐度為35.7%，厚壁菌門相對豐度為55.7%；給藥28 d 樣本的擬桿菌門相對豐度為44.3%，厚壁菌門相對豐度為41.5%。此外，還有unidentified_Bacteria、疣微菌門（Verrucomicrobiota）、變形菌門（Proteobacteria）和放線菌門（Actinobacteria）等主要菌門組成。

圖3 大鼠腸道菌群在門水平上的相對豐度Fig.3 Relative abundance of gut microbiota at phylum level of rats

如圖4 所示，與對照組比較，給藥7、14、21、28 d 樣本的菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯的變化，給藥7 d樣本的厚壁菌門相對豐度較對照組有顯著升高，而擬桿菌門、變形菌門和放線菌門相對豐度顯著降低；給藥14 d 樣本的放線菌門、Chloroflexi 和芽單胞菌門（Gemmatimonadota）的相對豐度均顯著降低；給藥21 d 樣本的擬桿菌門相對豐度顯著降低，而厚壁菌門相對豐度顯著增加；給藥28 d 樣本的擬桿菌門相對豐度顯著降低，厚壁菌門、unidentified_Bacteria以及Nitrospirota 相對豐度顯著增加?？梢?，染料木素和大豆苷元暴露能使大鼠糞便菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯改變，多表現(xiàn)為擬桿菌門相對豐度的降低和厚壁菌門相對豐度的增加。

圖4 染料木素-大豆苷元干預(yù)的大鼠腸道菌群相對豐度在門水平上的差異Fig.4 Difference of relative abundance of gut microbiota in rats at phylum level induced by genistein-daidzein

給藥14 d 樣本在屬水平上與對照組沒有明顯差異。如圖5 所示，屬水平上，相較于對照組，給藥7 d 樣本的MND1 相對豐度顯著降低，而顫螺菌屬Oscillibacter、[Eubacterium]_xylanophilum_group、GCA-900066575 和Lachnospiraceae_UCG-001 相對豐度顯著增加；給藥21 d 樣本的MND1 相對豐度也顯著降低，而乳酸桿菌Lactobacillus和[Eubacterium]_xylanophilum_group 的相對豐度顯著增加；給藥28 d 樣本的Colidextribacter、Blautia、[Eubacterium]_xylanophilum_group、Clostridium_sensu_stricto_1 等菌屬的相對豐度均顯著增加。表明染料木素和大豆苷元暴露使腸道菌群物種組成發(fā)生了顯著性改變。此外，在根據(jù)總體豐度前35 的屬在各樣品中豐度水平制作的熱圖（圖6）中得到了類似的結(jié)果，且熱圖中可以看到染料木素-大豆苷元（1∶1）給藥21 d 樣本中乳桿菌屬豐度最高。

圖5 染料木素-大豆苷元干預(yù)的大鼠腸道菌群相對豐度在屬水平上的差異Fig.5 Difference of relative abundance of gut microbiota in rats at genus level induced by genistein-daidzein

4 討論

淡豆豉中染料木素和大豆苷元的比例是固定的，本研究從組分配伍的角度出發(fā)，采用了3 種給藥比例，在此基礎(chǔ)上探討了給藥時間對腸道菌群微生態(tài)的影響。微生物在體內(nèi)定植需要一定的時間，據(jù)此對給藥7、14、21、28 d 后的大鼠糞便菌群進(jìn)行16S rRNA 測序并分析各組α 多樣性、β 多樣性及門或?qū)偎缴系奈锓N組成差異。

α 多樣性分析顯示，與對照組比較，各給藥組的Shannon 及Simpson 指數(shù)并非都有顯著變化，提示腸道菌群的多樣性是處于動態(tài)平衡的，并不會隨著給藥時間的變化而發(fā)生較大改變。而Chao1 及Ace 指數(shù)較于對照組均有顯著性變化，提示染料木素和大豆苷元可以使微生物群落豐度增加。

在物種組成分析與差異性分析中，發(fā)現(xiàn)給藥組中腸道菌群豐度均發(fā)生不同程度的改變，其中以擬桿菌門與厚壁菌門的豐度變化為主，給藥7、21、28 d 后的大鼠糞便菌群中厚壁菌門均顯著增加，同時，各組中擬桿菌門均顯著減少；但在給藥14 d 時，大鼠糞便菌群中擬桿菌門與厚壁菌門卻并無顯著性變化，這表明在28 d 給藥周期內(nèi)腸道菌群并沒有隨著給藥時間的延長而呈現(xiàn)趨勢變化，猜測可能在給藥前期，新生菌群與機(jī)體自身的腸道菌群之間存在一定的“競爭”，這種“競爭”可能包括宿主營養(yǎng)供給、生存空間和各菌群生長速度等[13]，繼續(xù)給藥后，維持了新生菌群的生長條件，從而使新生菌群能夠在腸道內(nèi)定植，成為優(yōu)勢菌群。在屬水平上，乳桿菌也沒有隨著給藥時間的延長而持續(xù)增長，而是在給藥21 d 時，乳桿菌豐度相較于對照組有顯著增加。熱圖中也可以看到各菌群沒有隨著給藥時間無限增長或減少，而是在宿主自身環(huán)境的作用下處于動態(tài)平衡。

本研究還發(fā)現(xiàn)，在屬水平上，與對照組比較，給藥7、21、28 d 樣本的[Eubacterium]_xylanophilum_group 的相對豐度均顯著增加。[Eubacterium]_xylanophilum_group 屬于厚壁菌門毛螺菌科，李鑫萍[14]在研究乳酸菌對瀉劑結(jié)腸的緩解作用中發(fā)現(xiàn)，瀉劑結(jié)腸小鼠菌群中[Eubacterium]_xylanophilum_group 的豐度顯著降低且菌群結(jié)構(gòu)明顯紊亂；而乳酸菌干預(yù)后能使瀉劑結(jié)腸小鼠糞便中[Eubacterium]_xylanophilum_group 豐度顯著增加，腸道穩(wěn)態(tài)恢復(fù)。還有研究表明，[Eubacterium]_xylanophilum_group 可能與支鏈氨基酸和短鏈脂肪酸的產(chǎn)生有關(guān)[15-16]。這為淡豆豉異黃酮成分的進(jìn)一步開發(fā)與利用提供一定的參考價值。

綜上，染料木素和大豆苷元能夠改變大鼠腸道菌群的結(jié)構(gòu)和組成，主要表現(xiàn)在抑制擬桿菌門中部分細(xì)菌生長，促進(jìn)厚壁菌門相關(guān)細(xì)菌繁殖。根據(jù)實驗結(jié)果，最終選定了染料木素-大豆苷元（1∶1）給藥21 d的方式進(jìn)行給藥來調(diào)控大鼠腸道菌群中乳桿菌的豐度，但體內(nèi)β-葡萄糖苷酶和II 相代謝酶的豐度，以及糖苷及苷元在體內(nèi)的代謝是否受到乳桿菌的影響還有待于進(jìn)一步研究。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突