經(jīng)皮穴位電刺激對卒中后抑郁大鼠行為學(xué)及前額葉皮質(zhì)BDNF、CREB表達(dá)的影響

何佳,王勇軍,曹辰虹,趙紅

(1.天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院,天津 300381;2.國家中醫(yī)針灸臨床醫(yī)學(xué)研究中心,天津 300381;3.天津市北辰醫(yī)院,天津 300400)

卒中后抑郁(post-stroke depression, PSD)是卒中后最常見的精神疾病,表現(xiàn)出卒中癥狀以外的一系列以情緒低落、興趣缺失為主要特征的情感障礙綜合征,常伴有軀體癥狀。中國的一項研究表明,21.2%～34.4%卒中后患者會發(fā)生抑郁[1],PSD對中風(fēng)后運(yùn)動功能和認(rèn)知缺陷的康復(fù)有負(fù)面影響,并顯著增加神經(jīng)血管事件復(fù)發(fā)的機(jī)會[2]。雖然選擇性5-羥色胺再攝取抑制劑是治療 PSD的常用首選藥物,但藥物的療效有限且存在副作用[3]。PSD的病理生理過程是復(fù)雜的,且涉及多因素,包括遺傳因素、病變部位、腦缺血引起的各種神經(jīng)生物學(xué)功能障礙以及由各種神經(jīng)病理引起的心理社會應(yīng)激[3-4]。針對PSD相關(guān)機(jī)制的研究及尋找更安全有效的治療方法是目前卒中領(lǐng)域丞待解決的問題。腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)對維持神經(jīng)元功能和情緒控制至關(guān)重要,在 PSD的病理過程及抗抑郁治療中發(fā)揮重要作用[5]。環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白(cAMP response element-binding protein, CREB)是一種與BDNF表達(dá)直接相關(guān)的核轉(zhuǎn)錄因子,參與抑郁癥的調(diào)控[6]。

本課題組前期臨床研究[7]發(fā)現(xiàn)經(jīng)皮穴位電刺激(transcutaneous electrical acupoint stimulation,TEAS)可有效改善PSD患者抑郁癥狀,與針刺療效無顯著性差異,說明 TEAS不僅可模擬針刺穴位的作用,還可減輕患者對針刺的緊張心理和畏懼感,無創(chuàng)而且安全。同時,有研究表明TEAS可上調(diào)癡呆大鼠腦部BDNF的表達(dá),減少細(xì)胞凋亡,進(jìn)而調(diào)節(jié)長時程增強(qiáng)效應(yīng)及突觸可塑性[8]。但TEAS是否能通過調(diào)節(jié)BDNF和CREB表達(dá)而改善PSD還需進(jìn)一步證實。本研究以BDNF和CREB為切入點(diǎn),觀察TEAS干預(yù)后PSD大鼠神經(jīng)功能、抑郁行為表現(xiàn),以及前額葉皮質(zhì)BDNF與CREB mRNA和蛋白相對表達(dá)量,探討TEAS治療PSD的可能作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

SPF級6～7周齡雄性Wistar大鼠54只,體質(zhì)量(200±50)g,購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司,生產(chǎn)許可證號為SCXK(京)2016-0006。于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所分籠飼養(yǎng),溫度 24～26 ℃,濕度50%～60%,12 h/12 h明暗周期,自由進(jìn)食和飲水。適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后,測曠場試驗基線值,篩選基線值相近的大鼠 48只,隨機(jī)分為 6組,空白(control, CON)組、腦缺血模型(middle cerebral artery occlusion,MCAO)組、PSD組、假針刺(sham acupuncture, SA)組、針刺(manual acupuncture, MA)組和 TEAS組,每組8只。實驗過程中對動物的處置嚴(yán)格遵照中華人民共和國科學(xué)技術(shù)部2006年發(fā)布的《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》。

1.2 主要試劑與儀器

異氟烷(深圳市瑞沃德生命科技有限公司),總RNA提取試劑盒(康為世紀(jì)生物技術(shù)有限公司),RT-PCR試劑盒(南京諾唯贊生物科技股份有限公司),BDNF、CREB引物(蘇州金唯智生物科技有限公司),兔抗大鼠BDNF抗體(ab108319, Abcam公司)、CREB抗體(ab32515, Abcam公司)、β-tubulin抗體(ab179513,Abcam公司),HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗(65-6120,賽默飛世爾中國科技有限公司),RIPA裂解液(北京索萊寶科技有限公司),BCA蛋白濃度測定試劑盒(北京索萊寶科技有限公司),ECL試劑盒(美國Perkin Elmer公司),硝酸纖維素膜(美國Millipore公司)。Bio-Rad iQ5 PCR擴(kuò)增儀(美國伯樂公司),凝膠成像及分析系統(tǒng)(美國Labworks公司),R500通用型小動物麻醉機(jī)(深圳市瑞沃德生命科技有限公司),電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀(北京市六一儀器廠),SuperMaze動物行為視頻分析系統(tǒng)(上海欣軟信息科技有限公司),HANS-200A韓氏穴位神經(jīng)刺激儀(南京濟(jì)生醫(yī)療科技有限公司)。

1.3 模型制備

1.3.1 大鼠腦缺血模型

釆用大腦中動脈閉塞法制備大鼠腦缺血模型,具體過程參照改良Zea-Longa線栓法操作[9],用異氟烷麻醉大鼠(氧流量為每分鐘0.7 L,誘導(dǎo)濃度為3%,維持濃度為 1.5%),確認(rèn)大鼠處于完全麻醉狀態(tài)后,使其仰臥位固定于手術(shù)臺上,剃去頸部鼠毛,消毒術(shù)區(qū)皮膚,取頸正中即大鼠前肢連線上方與前正中線旁1 cm交叉處行一縱行切口,逐層分離頸部皮膚及皮下組織,在靠近氣管處游離出右側(cè)頸總動脈、頸外動脈、勁內(nèi)動脈,注意剝離迷走神經(jīng)。離頸總動脈分叉處近心端結(jié)扎頸外動脈,用動脈夾夾住頸總動脈和頸內(nèi)動脈兩端,于頸總動脈分叉部下方4 mm處剪一“V”型小口,將硅膠線栓插入頸內(nèi)動脈,直到遇到輕微阻力為止,插入深度為17～18 mm。最后固定線栓,將其血管外部分剪除,松開動脈夾,逐層縫合切口、消毒。手術(shù)過程中使用加熱墊使大鼠體溫在 36.5～37.5 ℃,手術(shù)后將動物置于放有清潔墊料的飼養(yǎng)盒內(nèi)并使室溫維持在 25 ℃,自由飲水、進(jìn)食。動物于清醒2 h后參照Bederson的評估方法[10]進(jìn)行神經(jīng)功能評分,0分為無神經(jīng)功能缺損,1分為前肢屈曲,2分為側(cè)推時阻力減小伴前肢屈曲,3分為側(cè)推時阻力減小、前肢屈曲伴轉(zhuǎn)圈。大鼠評分為1～3分提示造模成功,均納入研究。

1.3.2 制備大鼠PSD模型

除空白組、MCAO模型組外,其余4組大鼠進(jìn)行單籠孤養(yǎng),MCAO術(shù)后第3天采用慢性不可預(yù)知的溫和應(yīng)激法(chronic unpredictable mild stress, CUMS)[11]制備PSD模型,具體為①行為限制30 min,②禁食禁水21 h,③水平搖晃5 min,④晝夜顛倒24 h,⑤45°傾斜鼠籠24 h,⑥濕籠(100 g鋸屑加200 mL水)24 h,⑦聲電刺激8次/只(電壓0.9 mA)。每日隨機(jī)選取1種應(yīng)激,相同的應(yīng)激不應(yīng)連續(xù)出現(xiàn),總共 21 d,每種應(yīng)激平均出現(xiàn)3次。空白組除每日抓取1次外,不做其他處理。

1.4 干預(yù)方法

CON組、MCAO組和PSD組大鼠不予穴位刺激。其余3組大鼠于MCAO術(shù)后第3天進(jìn)行穴位刺激。MA組取百會、雙側(cè)內(nèi)關(guān)和患側(cè)太沖穴,參照《大鼠穴位圖譜的研制》[12]進(jìn)行穴位定位。百會位于大鼠頂骨正中;內(nèi)關(guān)位于前肢內(nèi)側(cè),離腕關(guān)節(jié)約3 mm左右的尺橈骨縫間;太沖位于后肢足背第1和第2跖骨間凹陷處。針灸針的規(guī)格為0.25 mm×13 mm(華佗牌,蘇州醫(yī)療用品廠有限公司)。針刺雙側(cè)內(nèi)關(guān),直刺刺入約 2 mm,施以提插捻轉(zhuǎn)瀉法1 min;針刺百會時向后平刺約4 mm,施以行平補(bǔ)平瀉捻轉(zhuǎn)手法 1 min;針刺患側(cè)太沖,直刺約2 mm,施以提插捻轉(zhuǎn)瀉法1 min;各穴均留針20 min。SA組針刺雙側(cè)腋中線下3 mm各一非穴點(diǎn)及尾骨尖旁開3 mm一非穴點(diǎn)[13],直刺刺入約2 mm,留針20 min。TEAS組應(yīng)用HANS-200A韓氏穴位神經(jīng)刺激儀,先將大鼠穴位處毛剃凈后消毒皮膚,分別將4個直徑為5 mm的圓形導(dǎo)電壓敏膠電極片固定在兩根導(dǎo)線的正負(fù)極,一根導(dǎo)線的正負(fù)極分別用醫(yī)用膠帶固定于大鼠患側(cè)內(nèi)關(guān)及太沖穴,另一根導(dǎo)線的正負(fù)極固定于百會及健側(cè)內(nèi)關(guān)穴,給予頻率2/100 Hz,強(qiáng)度2 mA的經(jīng)皮穴位電刺激20 min。3組均每日1次,連續(xù)干預(yù)21 d。

1.5 指標(biāo)檢測

1.5.1 神經(jīng)功能評分

采用改良的神經(jīng)功能缺損量表(modified neurological severity score, mNSS)[14]評估大鼠神經(jīng)功能缺損程度,分別從感覺、運(yùn)動、反射和平衡4個方面進(jìn)行評估。6組大鼠均于造模前進(jìn)行訓(xùn)練,并于CUMS開始前1天及第21天干預(yù)結(jié)束后記錄mNSS評分。

1.5.2 蔗糖偏好實驗

在21 d干預(yù)結(jié)束后進(jìn)行蔗糖偏好實驗,實驗前訓(xùn)練大鼠飲用1%蔗糖水,即在每個鼠籠放置2個水瓶,在開始的24 h內(nèi)兩瓶均裝有1%蔗糖水,隨后第2個24 h內(nèi)1個瓶裝純凈水,另1個瓶裝1%蔗糖水;實驗測定前大鼠禁食禁水21 h,然后給予每只測試大鼠1瓶1%蔗糖水和1瓶純凈水,1 h后計算動物的蔗糖偏好率(糖水飲用率＝糖水消耗量/總液體消耗量×100%)。

1.5.3 曠場實驗(open field test, OFT)

6組大鼠于21 d干預(yù)結(jié)束后進(jìn)行曠場實驗。實驗開始時將大鼠放置于曠場箱底面的中心,用SuperMaze動物行為視頻分析系統(tǒng)記錄大鼠在 5 min內(nèi)移動距離和平均速度(不包含休息時間)。測試時在光線昏暗、安靜的環(huán)境下進(jìn)行,每只大鼠測定1次,實驗時間結(jié)束后通過錄像分析軟件統(tǒng)計結(jié)果。

每組隨機(jī)取6只大鼠于CUMS第21天行為學(xué)檢測結(jié)束后立即取材,完全麻醉后將大鼠仰臥位固定,于冰盤上快速斷頭剝離腦組織,取缺血側(cè)前額葉皮質(zhì)區(qū)腦組織,-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.4 實時熒光定量 PCR檢測大鼠前額葉皮質(zhì)區(qū)BDNF、CREB mRNA的相對表達(dá)量

取剪碎的大鼠缺血側(cè)前額葉皮質(zhì)區(qū)腦組織 50 mg加入1 mL TRIzon總RNA提取試劑,反復(fù)勻漿磨碎組織,使樣本充分裂解,室溫放置5 min,加入0.2 mL氯仿溶液,劇烈震蕩15 s,室溫放置3 min。4 ℃ 12 000 rpm離心 15 min,把上層水相轉(zhuǎn)移到新的離心管中。在得到的水相溶液中加入等體積異丙醇溶液,顛倒混勻,室溫放置10 min。4 ℃ 12 000 rpm離心10 min后棄上清。加入1 mL 75%乙醇溶液洗滌沉淀。4 ℃ 12 000 rpm離心3 min,小心吸棄上清,室溫放置3 min,晾干。加入50 μL無RNase水充分溶解RNA后-70 ℃保存?zhèn)溆?。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒步驟反向轉(zhuǎn)錄成 cDNA, cDNA經(jīng)過梯度稀釋后擴(kuò)增曲線呈線性關(guān)系。采用 SYBR Green法進(jìn)行實時熒光定量PCR反應(yīng),反應(yīng)條件依次為94 ℃ 4 min,94 ℃ 5 s,56 ℃ 15 s,72 ℃ 30 s,40個循環(huán)。以β-actin為內(nèi)參,通過 2-△△Ct法分析目的mRNA相對表達(dá)量。BDNF mRNA PCR引物序列見表1。

表1 BDNF、CREB mRNA引物序列

1.5.5 Western blot法檢測大鼠前額葉皮質(zhì)區(qū)BDNF、CREB蛋白表達(dá)

每1 mL RIPA裂解液加入10 μL蛋白酶抑制劑。取20 mg剪切成細(xì)小的碎片組織加入200 μL RIPA裂解液,用玻璃勻漿器進(jìn)行勻漿,至充分裂解后,4 ℃下在微型離心機(jī)中以12 000 r/min離心5 min,取出離心管置于冰上,將上清液轉(zhuǎn)移至放置在冰上的新離心管中,棄去沉淀后取出小部分裂解物,用于蛋白分析。用BCA蛋白定量試劑盒對樣本中蛋白質(zhì)進(jìn)行定量分析后,進(jìn)行 SDS-PAGE凝膠電泳,電泳分離后的蛋白電轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上,100 mA,90 min。將硝酸纖維素膜浸入封閉液中,室溫?fù)u床上輕輕搖動2 h。4 ℃過夜孵育一抗(BDNF 1:1 000,CREB 1:500,β-tubulin 1:2 000),洗膜,孵育二抗(1:10 000)。最后用ECL試劑盒檢測,進(jìn)行顯影定影處理。計算每個樣品條帶亮度值與對應(yīng)內(nèi)參條帶亮度值的比值,得到校正后條帶亮度值。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

釆用SPSS24.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。若計量資料數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布,以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,多組間比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用最小顯著差值法(LSD法);數(shù)據(jù)不服從正態(tài)分布,則采用非參數(shù)檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 6組大鼠死亡情況及mNSS評分比較

在PSD大鼠模型復(fù)制過程中,共死亡8只(3只術(shù)中出血過多、2只術(shù)后解剖發(fā)現(xiàn)蛛網(wǎng)膜下腔出血、3只術(shù)后感染)。各組納入神經(jīng)功能及行為學(xué)檢測并進(jìn)行統(tǒng)計的大鼠數(shù)量為CON組8只,MCAO組、PSD組和SA組均為6只,MA組和TEAS組均為7只。

CON組大鼠各項生命體征正常,不同時間點(diǎn)無神經(jīng)功能缺損。造模后,與 CON組比較,其余各組大鼠mNSS評分均升高(P＜0.01);其余各組大鼠mNSS評分比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。干預(yù)后,與 CON組比較,其余各組大鼠mNSS評分均升高(P＜0.01);與PSD組比較,MCAO組、SA組大鼠mNSS評分無明顯變化(P＞0.05),MA組和 TEAS組大鼠 mNSS評分明顯降低(P＜0.01);與MCAO組比較,SA組大鼠mNSS評分無明顯變化(P＞0.05),MA組和TEAS組大鼠mNSS評分均降低(P＜0.01);與SA組比較,MA組和TEAS組大鼠mNSS評分均降低(P＜0.01);MA組和TEAS組大鼠mNSS評分比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。詳見表2。

表2 6組大鼠mNSS評分比較(±s) 單位:分

表2 6組大鼠mNSS評分比較(±s) 單位:分

注:與 CON組比較 1)P＜0.01;與 PSD組比較 2)P＜0.01;與MCAO組比較3)P＜0.01;與SA組比較4)P＜0.01。

組別 n 造模后 干預(yù)后CON組 8 0.00±0.00 0.00±0.00 PSD組 6 10.17±1.471) 6.83±1.471)MCAO組 6 9.17±1.171) 6.17±1.171)SA組 6 9.50±1.871) 5.83±1.471)MA組 7 9.29±1.251) 3.29±0.761)2)3)4)TEAS組 7 9.57±1.511) 3.14±1.221)2)3)4)

2.2 6組大鼠蔗糖偏好率比較

造模前,6組大鼠蔗糖偏好率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。干預(yù)后,與CON組比較,PSD組、MCAO組與 SA組蔗糖偏好率明顯降低(P＜0.01),MA組和TEAS組無明顯變化(P＞0.05);與PSD組比較,SA組大鼠蔗糖偏好率無明顯變化(P＞0.05),MA組和TEAS組大鼠蔗糖偏好率明顯升高(P＜0.01);與 MCAO組比較,PSD組和 SA組蔗糖偏好率明顯降低(P＜0.01),MA組和TEAS組大鼠蔗糖偏好率均升高(P＜0.01);與SA組比較,MA組和TEAS組大鼠蔗糖偏好率均明顯升高(P＜0.01);MA組和TEAS組大鼠蔗糖偏好率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。詳見表3。

表3 6組大鼠蔗糖偏好率比較(±s)

表3 6組大鼠蔗糖偏好率比較(±s)

注:與 CON組比較 1)P＜0.01;與 PSD組比較 2)P＜0.01;與MCAO組比較3)P＜0.01;與SA組比較4)P＜0.01。

組別 n 造模前(%) 干預(yù)后(%)C O N組 8 8 2.2 9±6.0 2 7 9.8 7±5.9 7 P S D組 6 8 0.6 7±5.9 7 3 9.6 2±8.9 1 1)3)M C A O組 6 7 9.1 6±9.6 6 6 3.1 5±5.0 7 1)2)4)S A組 6 8 1.2 7±4.0 6 4 6.0 7±6.2 5 1)3)M A組 7 7 9.8 6±7.3 0 7 6.0 3±3.3 0 2)3)4)T E A S組 7 8 2.3 9±5.1 0 7 7.3 3±5.4 8 2)3)4)

2.3 6組大鼠曠場實驗結(jié)果比較

造模前,6組大鼠曠場實驗移動距離比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。干預(yù)后,與CON組比較,PSD組、MCAO組和SA組移動距離明顯減少(P＜0.01)，MA組和TEAS組無明顯變化(P＞0.05);與PSD組比較,MCAO組、SA組、MA組和 TEAS組大鼠移動距離明顯增加(P＜0.01);與MCAO組比較,MA組和TEAS組大鼠移動距離明顯增加,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01);與 SA組比較,MCAO組移動距離無明顯變化(P＞0.05),MA組和TEAS組大鼠移動距離均明顯增加(P＜0.01);MA組和TEAS組大鼠移動距離比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。詳見表4。

表4 6組大鼠移動距離比較(±s) 單位:cm

表4 6組大鼠移動距離比較(±s) 單位:cm

注:與 CON組比較 1)P＜0.01;與 PSD組比較 2)P＜0.01;與MCAO組比較3)P＜0.01;與SA組比較4)P＜0.01。

組別 n 造模前 干預(yù)后CON組 8 3162.25±193.97 2998.50±252.24 PSD組 6 2937.17±349.67 686.50±135.671)MCAO組 6 3009.67±446.11 1301.67±269.491)2)SA組 6 2923.33±366.31 1337.83±254.591)2)MA組 7 2978.29±198.29 2695.43±346.312)3)4)TEAS組 7 3019.57±243.93 2761.71±411.622)3)4)

造模前各組大鼠曠場實驗移動速度比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。干預(yù)后,與CON組比較,PSD組、MCAO組與SA組移動速度明顯減慢(P＜0.01),MA組和TEAS組無明顯變化(P＞0.05);與PSD組比較,SA組、MCAO組、MA組和TEAS組大鼠移動速度明顯增快,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01);與MCAO組比較,SA組無明顯變化(P＞0.05),MA組和 TEAS組大鼠移動速度增快(P＜0.01);與SA組比較,MA組和TEAS組大鼠移動速度增快,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01);MA組和TEAS組大鼠移動速度比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。詳見表5。

表5 6組大鼠移動速度比較(±s) 單位:cm/s

表5 6組大鼠移動速度比較(±s) 單位:cm/s

注:與CON組比較1)P＜0.01;與PSD組比較2)P＜0.01;與MCAO組比較3)P＜0.01;與SA組比較4)P＜0.01。

組別 n 造模前 干預(yù)后CON組 8 12.87±1.44 12.22±0.97 PSD組 6 12.24±1.84 5.85±0.571)MCAO組 6 11.61±1.81 8.61±1.331)2)SA組 6 11.52±1.19 8.64±0.991)2)MA組 7 12.07±1.31 11.85±2.022)3)4)TEAS組 7 13.05±1.87 12.02±1.582)3)4)

2.4 6組大鼠前額葉皮質(zhì)BDNF、CREB mRNA相對表達(dá)量比較

干預(yù)后,與CON組比較,其余各組大鼠前額葉皮質(zhì)BDNF mRNA相對表達(dá)量均降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01);與PSD組比較,MCAO組、SA組BDNF mRNA相對表達(dá)量升高(P＜0.01),MA組與TEAS組BDNF mRNA相對表達(dá)量明顯升高(P＜0.01);與 MCAO組比較,SA組BDNF mRNA相對表達(dá)量無明顯變化(P＞0.05),MA組與TEAS組BDNF mRNA相對表達(dá)量均升高(P＜0.01);與SA組比較,MA組與TEAS組BDNF mRNA相對表達(dá)量均升高(P＜0.01);MA組與TEAS組BDNF mRNA相對表達(dá)量比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。詳見圖1。

圖1 6組大鼠干預(yù)后前額葉皮質(zhì)BDNF mRNA相對表達(dá)量比較(±s, n＝6)

與 CON組比較,其余各組大鼠前額葉皮質(zhì)CREB mRNA相對表達(dá)量均降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01);與PSD組比較,SA組、MCAO組CREB mRNA相對表達(dá)量升高(P＜0.01),MA組與TEAS組CREB mRNA相對表達(dá)量明顯升高(P＜0.01);與 MCAO組比較,SA組CREB mRNA相對表達(dá)量無明顯變化(P＞0.05),MA組與TEAS組CREB mRNA相對表達(dá)量均升高(P＜0.01);與SA組比較,MA組與TEAS組CREB mRNA相對表達(dá)量均升高(P＜0.01);MA組與TEAS組CREB mRNA相對表達(dá)量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。詳見圖2。

圖2 6組大鼠干預(yù)后前額葉皮質(zhì)CREB mRNA相對表達(dá)量比較(±s, n＝6)

2.5 6組大鼠前額葉皮質(zhì)BDNF、CREB蛋白相對表達(dá)量比較

干預(yù)后,與CON組比較,其余各組大鼠前額葉皮質(zhì)BDNF蛋白表達(dá)均降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。與PSD組比較,SA組、MCAO組、MA組與TEAS組BDNF蛋白表達(dá)明顯升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。與MCAO組比較,SA組BDNF蛋白相對表達(dá)量無明顯變化(P＞0.05),MA組與TEAS組BDNF蛋白表達(dá)均升高(P＜0.01);與SA組比較,MA組與TEAS組BDNF蛋白相對表達(dá)量均升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01);MA組與TEAS組BDNF蛋白相對表達(dá)量比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

干預(yù)后,與CON組比較,其余各組大鼠前額葉皮質(zhì)CREB蛋白相對表達(dá)量均降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。與PSD組比較,MCAO組、SA組、MA組與TEAS組CREB蛋白相對表達(dá)量明顯升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01);與MCAO組比較,SA組CREB蛋白相對表達(dá)量無明顯變化(P＞0.05),MA組與TEAS組CREB蛋白相對表達(dá)量均升高(P＜0.01);與SA組比較,MA組與TEAS組 CREB蛋白相對表達(dá)量均升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01);MA組與TEAS組CREB蛋白相對表達(dá)量比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。詳見圖3～5。

圖3 6組大鼠干預(yù)后前額葉皮質(zhì)BDNF、CREB蛋白條帶圖

圖4 6組大鼠干預(yù)后前額葉皮質(zhì)BDNF蛋白相對表達(dá)量比較(±s, n＝6)

圖5 6組大鼠干預(yù)后前額葉皮質(zhì)CREB蛋白相對表達(dá)量比較(±s, n＝6)

3 討論

卒中后抑郁(PSD)的發(fā)生機(jī)制復(fù)雜,其可能是由中風(fēng)患者的心理社會因素和生物學(xué)損傷這兩種機(jī)制相互作用決定的。一方面,卒中康復(fù)期間日常生活活動減少與缺乏家庭或社會支持會導(dǎo)致 PSD發(fā)生,且如果殘疾得不到改善,社會聯(lián)系的持續(xù)缺乏會導(dǎo)致 PSD持續(xù)存在[15]。另一方面,中風(fēng)后的生物學(xué)障礙可能在一定程度上促進(jìn)了 PSD的發(fā)展,參與情緒行為大腦區(qū)域的直接損傷以及腦缺血性損傷后谷氨酸介導(dǎo)的興奮毒性增強(qiáng)和炎癥因子的釋放均會影響單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的合成和活性,從而導(dǎo)致PSD的發(fā)生發(fā)展[16-19]。

采用大腦中動脈閉塞與慢性不可預(yù)知的溫和應(yīng)激法聯(lián)合制備PSD模型,造模后大鼠 mNSS評分均升高,而蔗糖偏好比率、曠場實驗移動距離和移動速度均明顯降低,說明造模成功,PSD大鼠神經(jīng)功能受損且出現(xiàn)抑郁行為學(xué)表現(xiàn)。進(jìn)一步觀察發(fā)現(xiàn),造模后大鼠大腦前額葉皮質(zhì)BDNF與CREB mRNA和蛋白含量均明顯降低。提示BDNF與CREB可能參與了PSD的情緒變化。

BDNF是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中含量最豐富、分布最廣的神經(jīng)營養(yǎng)因子,在神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)的形成和可塑性中起關(guān)鍵作用,對維持參與情緒和認(rèn)知功能的關(guān)鍵腦回路中神經(jīng)元的生存、生長起著至關(guān)重要的作用[20]。BDNF水平和功能的改變導(dǎo)致了抑郁癥相關(guān)腦回路的萎縮、突觸斷開和功能障礙;相反,BDNF水平的提升有助于突觸的可塑性和重塑,誘導(dǎo)長時程增強(qiáng),調(diào)節(jié)可塑性的基因表達(dá),促進(jìn)神經(jīng)元損傷的恢復(fù)以及緩解抑郁癥狀[21]。CREB是一種與BDNF表達(dá)直接相關(guān)的核轉(zhuǎn)錄因子,參與了抑郁癥的調(diào)控。研究表明,CREB轉(zhuǎn)錄因子家族是皮層神經(jīng)元BDNF轉(zhuǎn)錄自動調(diào)節(jié)的主要介質(zhì)[22]。此外,前額葉皮層作為大腦中重要的思維和行為調(diào)節(jié)神經(jīng)中樞,與抑郁癥密切相關(guān)。前額葉皮層分為腹內(nèi)側(cè)前額葉皮層和背外側(cè)前額葉皮層,前者涉及情感的調(diào)節(jié),包括負(fù)面情緒的產(chǎn)生,而后者介導(dǎo)認(rèn)知功能,如意圖形成、目標(biāo)導(dǎo)向的行動和注意力控制,這兩者都被證明在抑郁癥中發(fā)揮著重要作用,該部位受損會使人或動物產(chǎn)生抑郁情緒和行為[23]。缺血性卒中發(fā)生后,參與情緒行為的大腦區(qū)域可能會受到直接損傷,同時,由血腦屏障破壞和組織損傷引發(fā)的神經(jīng)炎癥、腦缺血所致的低氧環(huán)境以及由于患者身體活動和日常生活能力受損后應(yīng)激水平的增加等,均可導(dǎo)致 BDNF的表達(dá)下調(diào),從而影響PSD的發(fā)生[24]。卒中患者入院時血清低 BDNF水平與3個月內(nèi)PSD的發(fā)展之間存在密切關(guān)系,卒中早期血清BDNF濃度的顯著降低可能使患者易患PSD[25-26]。

近年來,針灸在改善PSD患者抑郁狀態(tài)、提高其日常生活能力方面均優(yōu)于抗抑郁藥物,且針刺能升高患者血清 BDNF水平以提高神經(jīng)功能[27-28]。同時,基礎(chǔ)研究亦表明,針刺不僅能通過調(diào)節(jié)抑郁癥大鼠 CREBBDNF受體后信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路而改善其行為學(xué)表現(xiàn)[29],還能明顯提升PSD大鼠不同腦區(qū)BDNF和CREB的表達(dá),改善神經(jīng)元損傷,緩解大鼠抑郁行為[30-31]。電針可通過調(diào)控BDNF/ERK/CREB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中CREB、p-CREB、ERK、p-ERK、p-RSK等關(guān)鍵因子,來調(diào)節(jié)PSD大鼠海馬BDNF的表達(dá)[32]。針刺治療PSD,以“調(diào)神”為核心思想,選穴以督脈穴為主,以局部取穴與上下配穴為原則,百會、內(nèi)關(guān)和太沖是治療PSD應(yīng)用頻率較高的前三位腧穴[33]。百會,位于巔頂之上,《針灸甲乙經(jīng)》中稱其為“三陽五會”,為督脈、足太陽經(jīng)、足少陽經(jīng)、手少陽經(jīng)和足厥陰經(jīng)的交會穴,具有醒腦調(diào)神、宣陽開郁的功能。內(nèi)關(guān)為八脈交會穴之一,通于陰維脈,屬心包經(jīng)絡(luò)穴,具有調(diào)理心氣以安養(yǎng)元神之功。太沖為足厥陰肝經(jīng)原穴,肝主藏血,體陰而用陽,屬“少氣多血”之經(jīng),有行氣調(diào)血、疏肝解郁之功。因此,本研究選取以上腧穴。

TEAS是將經(jīng)皮神經(jīng)電刺激與針灸學(xué)理論相結(jié)合的一種安全、無創(chuàng)的穴位治療方法,其通過貼在穴位上的電極片傳遞電流以治療疾病,已被廣泛應(yīng)用于各種神經(jīng)精神疾病,如圍術(shù)期焦慮、產(chǎn)后抑郁等[34-35]。TEAS比TENS在調(diào)節(jié)大腦活動方面更有效,因為穴位區(qū)域含有比非穴位區(qū)域相對更密集的神經(jīng)和神經(jīng)活性成分。神經(jīng)影像學(xué)研究也證明了長周期 TEAS可能會調(diào)節(jié)大腦功能網(wǎng)絡(luò)和邊緣系統(tǒng)的短程連接[36]。既往研究已證明,TEAS不但可改善卒中后患者的肢體功能障礙,還可減輕PSD患者抑郁癥狀,改善其P300潛伏期和波幅,相較于藥物和傳統(tǒng)針刺療法,具有無創(chuàng)、安全、操作簡便及依從性好特點(diǎn)[7,37]。

本研究結(jié)果顯示,TEAS與針刺均可在一定程度上提升PSD大鼠前額葉皮質(zhì)BDNF與CREB mRNA和蛋白相對表達(dá)量,改善大鼠神經(jīng)功能缺損評分,提升其蔗糖偏好率、曠場實驗移動距離和移動速度。由此可見,經(jīng)皮穴位電刺激百會、內(nèi)關(guān)、太沖可明顯改善PSD模型大鼠神經(jīng)功能損傷和抑郁癥狀,取得與針刺相同的效應(yīng),其機(jī)制可能與上調(diào)大腦前額葉BDNF與CREB的基因和蛋白表達(dá)有關(guān)。