基于SystemXc-/GPX4軸調控的鐵死亡在腦卒中后的研究進展

吳 松,楊悅悅,陳 凈綜述,任彬彬審校

0 引 言

細胞是除病毒外所有生物體結構和功能的基本單位,對維持新陳代謝、促進生長發(fā)育、執(zhí)行機體生理功能、維持內環(huán)境穩(wěn)態(tài)等有重要的作用。生理狀態(tài)下,細胞可在基因調控下發(fā)生主動性死亡,如凋亡等;隨著研究的深入,越來越多的細胞死亡形式被發(fā)現(xiàn)。近年來,鐵死亡成為腦卒中后損傷神經(jīng)細胞的重要機制。也有研究表明,鐵螯合劑等可抑制鐵死亡的發(fā)生[1]。本文就鐵死亡在腦卒中后的作用機制與抑制鐵死亡的相關研究作一綜述。

1 鐵死亡的提出

鐵死亡方式與以往人們所能認識到的細胞自噬、壞死和凋亡有所不同,實際上是一個較新出現(xiàn)的細胞程序性死亡方式,表現(xiàn)出細胞對金屬鐵離子有很強程度的依賴性及胞內有大量脂質過氧化物(lipid hydroperoxide,LPO)累積的特點[2]。LPO是由多不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acid,PUFA)鏈經(jīng)自由基或活性氧(ROS)作用后形成帶有過氧基的脂質。即在鐵死亡過程中鐵和LPO的積累起著關鍵作用。當細胞線粒體內的鐵含量超載時,因PUFA的氧化過程可被抑制劑所抑制(如鐵螯合劑-去鐵胺DFO、親脂抗氧化劑和維生素E等),因此Dixon 等[3]在2012年正式將其命名為鐵死亡。鐵死亡在基因、形態(tài)學、生化水平上有別于凋亡、自噬等已知的死亡方式。從基因層面講:鐵死亡過程受到多種基因調控,主要通過鐵代謝紊亂、脂質過氧化物堆積、氨基酸代謝、氧化應激等途徑。在形態(tài)學上:鐵死亡以線粒體結構變化為主,線粒體皺縮變小和體內嵴膜減少、消失是常見的特征;此外,也會出現(xiàn)膜密度增加、線粒體外膜破裂等現(xiàn)象;但細胞核的形態(tài)和結構常常不會發(fā)生變化,這呈現(xiàn)出了與其他死亡形式所不同的典型特征[4]。在生化水平上,胞內谷胱甘肽(glutathione,GSH)常因耗竭而表現(xiàn)為含量較低,因此谷胱甘肽過氧化物酶4(glutathione peroxidase 4,GPX4)本身的抗氧化活性也將會受到影響(即抗氧化的能力會減弱);由于二者本身都具有很強的抗氧化能力以有效對抗膜的脂質過氧化。所以在其濃度降低或抗氧化活性又遭到嚴重抑制時,GPX4就無法及時有效降解胞內LPO,最終直接造成了細胞的鐵死亡[2]。綜上,細胞是否發(fā)生了鐵死亡,檢測鐵依賴性的LPO堆積量是最重要的標志[5]。

2 腦卒中和鐵死亡

“腦卒中”(cerebral stroke)又名為"中風"、"腦血管意外"(cerebralvascularaccident,CVA),是患者大腦毛細血管的驟然痙攣斷裂(腦出血)或血管阻塞(腦梗死)而造成大量血液無法從大血管流入腦部,進而使受損傷部位的腦組織缺血、缺氧而導致腦神經(jīng)細胞死亡的一種急性腦血管病變。我們知道,人肢體的運動功能和深、淺感覺等均由神經(jīng)支配。神經(jīng)系統(tǒng)受損后,患者就無法自主支配肢體運動,嚴重的甚至將喪失聽理解能力、言語能力和吞咽能力;給家人和社會帶來沉重的負擔[6]。腦卒中有出血性卒中和缺血性卒中兩種發(fā)病形式;其中缺血性腦卒中最為常見,約占85%[7]。目前,治療腦卒中的手段種類繁多,如針對缺血性腦卒中可采用溶栓療法、抗凝治療和抗血小板療法等[8]。腦卒中后的繼發(fā)性損傷機制,在近年來的研究中也日漸明了。腦卒中后神經(jīng)細胞損傷是給身體帶來嚴重危害的元兇,現(xiàn)據(jù)報道的損傷途徑包括傳統(tǒng)的細胞凋亡、自噬、氧化應激等[9];有研究表明,抑制以上途徑并不能完全改善受損的腦組織和神經(jīng)細胞[10]。于是推斷:在腦卒中發(fā)生后很可能還存在其他使得神經(jīng)細胞死亡的方式。幸運的是在一項針對雄性蒙古沙鼠腦損傷后腦皮質微量元素的研究中發(fā)現(xiàn):使小鼠右大腦中動脈和右頸總動脈閉塞1h,致腦缺血,后檢測得出腦皮質中鐵(Fe)含量顯著升高(鐵超載),缺血腦中超氧化物歧化酶和過氧化氫酶的抗氧化活性顯著降低[11]。在Park等[12]和Ding等[13]的研究中也得到了類似的結論;然而,在使用了鐵螯合劑、自由基清除劑或抗氧化劑后能有效預防這種損傷[14],以上實驗都給我們的推斷提供了有力證據(jù)?？傊?當缺血性腦卒中發(fā)生后,所引發(fā)的神經(jīng)細胞中抗氧化因子(如GSH和GPX4)的生成減少及缺血腦組織中LPO含量累積增加均可加快對神經(jīng)細胞的毒性反應,加重腦組織損傷[15-16]。種種證據(jù)表明:鐵死亡對于腦卒中后續(xù)進展至關重要。因此,抑制鐵死亡進程是減輕腦卒中后繼發(fā)性神經(jīng)損傷和改善預后的有效途徑。

3 鐵死亡的發(fā)生機制

鐵死亡因其復雜的反應過程導致人們很難探究出其明確的分子發(fā)生機制。近年來,經(jīng)研究人員的不懈努力,可確定的是,鐵死亡主要與以下幾種機制有關:鐵代謝紊亂、脂質代謝紊亂、氨基酸抗氧化系統(tǒng)失衡(System Xc-/GPX4軸的抑制或失活)等[17]。

3.1鐵代謝紊亂鐵死亡是鐵依賴性的脂質過氧化物累積所致,因此探究鐵與脂質過氧化物在此過程中的作用就顯得格外重要。鐵元素對于維持生物體內環(huán)境的穩(wěn)態(tài)和生理功能是必不可少的礦物質,且在腦組織中廣泛存在,在氧的運輸、ATP及DNA的合成方面發(fā)揮著重要作用[18]。但鐵超載即胞質內游離的Fe2+增多卻會對細胞有損害作用。神經(jīng)細胞攝取和排出鐵在轉鐵蛋白( transferrin,Tf)的作用下保持動態(tài)平衡,在PH為7.4時,每分子Tf以最高效率結合兩分子Fe3+,Transferrin Receptor(TfR1)是介導此轉運過程的受體。TfR1是位于細胞表面的糖蛋白,其在結構上是通過二硫鍵將兩個同源的二聚體的亞基連接而成。在攝取Fe3+時,其可將由Tf與Fe3+結合形成的全鐵-Tf以細胞內吞的方式攝入胞內。而后,在弱酸環(huán)境下,Fe3+脫落成游離態(tài);與此同時,在STEAP3的作用下,Fe3+被還原為以Fe2+的形式存在,進而被二價金屬離子轉運蛋白1(DMT1)釋放到胞質內的不穩(wěn)定鐵池(LIP)中進行儲存。最終,完成使命的Tf/TfR1以復合物的形式通過胞吐作用重新回到細胞表面,二者分離成脫鐵-Tf。繼而為下一環(huán)節(jié)的Fe3+轉運做準備。在胞質內的二價鐵離子,生理狀態(tài)下,除滿足正常的細胞代謝和儲存外,多余的將被膜鐵轉運蛋白(ferroportin,Fpn)轉移至細胞外,Fpn是目前已知的哺乳動物體內唯一可將Fe2+轉出細胞的蛋白[19]。攝入、排出和儲存鐵在多種蛋白的共同作用下,維持細胞內鐵元素含量的動態(tài)穩(wěn)定。Tang等[20]和Jiang等[21]研究發(fā)現(xiàn),通過p53/TfR1和PI3K/IPR2途徑可增強TfR1攝取鐵的能力,從而加重鐵超載,造成鐵死亡。儲存鐵的鐵蛋白也可通過自噬降解作用,Ferritin將Fe2+釋放造成鐵超載,誘發(fā)鐵死亡[22]。同樣的,若蛋白表達能力或活性受到抑制造成了胞內鐵超載,也會通過誘導過氧化氫(H2O2)與Fe2+發(fā)生的芬頓反應(Fenton),進而產(chǎn)生大量的脂質ROS,破壞細胞DNA造成鐵死亡。另一方面,Fe2+也參與脂氧合酶(lipoxygenase,LOX)催化脂質過氧化反應過程,也可導致細胞鐵死亡[23]。

3.2脂質代謝脂質過氧化物堆積是造成細胞鐵死亡的首要因素。胞質內發(fā)生脂質過氧化的酶促反應,有研究已基本確定了誘導鐵死亡的有關基因,其中與脂質代謝有關的編碼蛋白有酰基輔酶A合成酶長鏈家族成員4(acyl-CoA synthetase long-chain familymember4,ACSL4)和溶血磷脂酰膽堿?；D移酶3(Lysophosphatidylcholine Acyltransferase3,LPCAT3)。PUFAs如花生四烯酸(arachidonic acid,AA) 或腎上腺酸(adrenic acid,AdA)在ACSL4和LPCAT3的共同催化作用下,成為被酯化轉變?yōu)榱字６掖及费苌?phosphatidyl ethanolamine,PE)的首選底物,生成產(chǎn)物花生四烯酸-磷脂酰乙醇胺(AA-PE)和腎上腺酸-磷脂酰乙醇胺(Ada-PE),而后存在于內質網(wǎng)相關的隔室中。最終在Fe2+的作用下脂氧合酶 15(15-lipoxygenase,15-LOX) 將AA-PE和AdA-PE氧化為PE-AdA-OOH和 PE-AA-OH等過氧化物[24]。這些脂質過氧化物的累積將造成細胞的鐵死亡,但維生素E可通過抑制15-LOX來調節(jié)此過程。據(jù)研究報道:極易氧化的PUFA的積累成為鐵死亡的標志,且發(fā)生鐵死亡的程度與其含量有密切關系[25]。因此,可得出結論:通過干預ACSL4/LPCTA3/15-LOX 脂質代謝通路可調節(jié)鐵死亡[26]。

3.3氨基酸抗氧化系統(tǒng)鐵死亡與氨基酸代謝有十分緊密的聯(lián)系,氨基酸抗氧化系統(tǒng)調節(jié)鐵死亡主要通過System Xc-/GPX4軸發(fā)揮作用。研究證明,鐵死亡是LOX在鐵的作用下通過磷酸化酶激酶G2(PHKG2)將多不飽和脂肪酸過氧化造成的。GPX4是谷胱甘肽過氧化物酶(GPXs)家族的一員,其可通過清除生成的脂質過氧化物,從而使細胞對鐵死亡的敏感性降低;即將有毒性的脂質氫過氧化物(L-OOH)還原轉化為無毒的脂質醇(L-OH)[27]。若GPX4的生成受到阻礙或者活性被抑制,則由脂質過氧化物堆積產(chǎn)生的細胞毒性作用就無法被阻止,造成鐵死亡[28]。GSH是GPX4在清除過氧化物時充當還原劑的一種輔助因子,包括還原型(GSH)和氧化型(GSSG)。正常情況下,GPXs可催化GSH為GSSG,其中以還原型的GSH占比最大;在與GPX4的共同作用下可以與ROS發(fā)生化學反應,起到對細胞的抗氧化作用,保護細胞免受損傷。因此GSH的含量會直接影響GPX4的活性,若GSH耗竭,GPX4的抗氧化的能力也就無法完全消除體內脂質過氧化物,導致鐵死亡。System Xc-是一種位于細胞膜表面上胱氨酸和谷氨酸之間的特異性反向轉運的蛋白,是輕鏈溶質載體家族第七成員xCT(SLC7A11)和重鏈溶質載體家族3成員24F2hc(SLA3A2)通過二硫鍵連接而成[29],可1∶1的攝入胱氨酸(Cystine)的同時排出谷氨酸(Glutamate)[3],該轉運過程的能量由細胞內高濃度的谷氨酸順濃度差來提供而不消耗ATP,因此該轉運過程極易受到細胞外高谷氨酸的抑制。證據(jù)表明:在缺血性腦卒中發(fā)生后,損傷腦組織細胞外的谷氨酸含量會增高,直接抑制胱氨酸的攝入[30],影響后續(xù)反應:胱氨酸進入細胞后,經(jīng)過一系列酶促反應,迅速被還原為半胱氨酸,并分別借助半胱氨酸-谷氨酸連接酶、谷胱甘肽合成酶和ATP,最終合成GSH。因此,我們可以推斷:通過干預System Xc-/GPX4軸上的任一環(huán)節(jié),直接或間接的調節(jié)GPX4活性,可有效影響鐵死亡進程,以期探索更多治療腦卒中的靶點。

4 通過System Xc-/GPX4軸干預鐵死亡

4.1 直接作用于GPX4的鐵死亡與腦卒中硒元素是合成硒代半胱氨酸必須的微量元素,GPX4是GPXs家族中活性位點和調控區(qū)域含有硒代半胱氨酸的抗氧化劑之一。有學者發(fā)現(xiàn):藥理硒 (Se) 發(fā)揮保護神經(jīng)元的作用可通過兩個步驟實現(xiàn),第一步通過激活轉錄因子 TFAP2c 和 Sp1,第二步增強 GPX4的表達和該轉錄程序(硒組)中的其他基因[31]。研究發(fā)現(xiàn),將單劑量的硒輸送到大腦中會使抗氧化劑 GPX4 的表達增強,發(fā)揮保護神經(jīng)元的作用,從而有效改善卒中模型的神經(jīng)功能。由此可推斷:腦滲透性硒的全身給藥以抑制細胞的鐵死亡來改善功能是治療腦卒中的一種有效方法;而RSL3是首先被我們熟知的GPX4抑制劑,其通過與硒代半胱氨酸共價結合直接抑制GPX4的活性,誘導鐵死亡的發(fā)生[32]。

此外,GSH 是GPX4發(fā)揮抗氧化物的輔助因子,是GPX4的內源性誘導劑,直接影響GPX4的活性。在一項缺血性腦卒中小鼠模型中,有學者發(fā)現(xiàn),在成年雄性大鼠 MCAO 后,用芝麻素(SES)進行治療(30mg/kg bwt),結果表明大鼠缺血腦組織梗死體積減少、脂質過氧化物的生成減少、cleaved-caspase-3活化和GSH 活性增加;從而使GPX4的抗氧化性增強以提高腦卒中后神經(jīng)保護能力[33]。也有研究發(fā)現(xiàn),在對已建立的缺乏GPX4的模型鼠喂食缺乏維生素E(一種具有抗鐵死亡活性的脂溶性抗氧化劑)的飲食中,海馬神經(jīng)退行性變和行為功能障礙的發(fā)生率加快,在用了鐵死亡抑制劑后小鼠的神經(jīng)退行性變被明顯改善[34]。因此,維生素E可作為神經(jīng)細胞發(fā)生鐵死亡時的抑制劑。另外,FIN56能使誘導的細胞對鐵死亡的敏感性提高[35]。其能促進GPX4的降解過程,且可通過與角鯊烯合成酶直接結合,而后使內源抗氧化劑輔酶Q10(CoQ10)耗竭,從而誘發(fā)鐵死亡。FINO2可同時影響鐵和GPX4而導致鐵死亡:一方面,直接將不穩(wěn)定的鐵氧化,另一方面,直接將GPX4失活[36]。也有文獻報道,化合物DPI7和DPI10也直接作用于Gpx4并誘導鐵死亡[36]。

4.2作用于System Xc-的鐵死亡與腦卒中在一項高良姜對沙土鼠I/R后海馬神經(jīng)元影響的研究中,學者發(fā)現(xiàn),高良姜可通過激活 SLC7A11/GPX4 軸抑制鐵死亡,使腦組織脂質過氧化物水平降低,以達到對海馬神經(jīng)元的保護作用[37]。

Erastin是一種直接作用在System Xc-轉運體上的鐵死亡誘導劑,通過抑制胱氨酸的攝取來減少GSH的生成,從而降低GPX4的活性,導致鐵死亡[38]。p53在鐵死亡中也扮演者極為重要的角色。其作用除所熟知的介導細胞周期停滯、衰老和凋亡等外。Jiang等[39]研究表示,p53 還可抑制System Xc-中的SLC7A11,導致胱氨酸進入胞內合成半胱氨酸的過程受到抑制,GSH的生成減少,間接影響GPX4的活性致使細胞對鐵死亡敏感性增強。在一項鐵死亡對蛛網(wǎng)膜下腔出血(SAH)后早期腦損傷(EBI)的影響研究中,Kuang等[40]在使用鐵死亡抑制劑Ferrostatin-1(Fer-1)對模型大鼠治療后,發(fā)現(xiàn)大鼠SAH后上調P53抑制SLC7A11表達、降低GPX4活性的作用被抑制了。在小鼠MCAO模型中,Fer-1抑制鐵死亡和增強神經(jīng)保護作用也得到了印證[41]。

另外,核因子E2相關因子 2(Nrf2)也是鐵死亡的重要調控因子,對GPX4、SLC7A11、TfR1等都有明顯的影響[42-43]。黎玉環(huán)等[44]在試驗中發(fā)現(xiàn),對腦出血大鼠使用柚皮素(NAR)后,促進了Nrf2和SLC7A11表達,從而GSH、GPX4蛋白水平顯著升高,抑制了神經(jīng)細胞的鐵死亡。有學者發(fā)現(xiàn),Nrf2-Keap1 信號的激活上調SystemXc-中的SLC7A11表達,使其活性增加,轉運氨基酸功能增強,提高腫瘤發(fā)生時細胞對鐵死亡的抵抗力[45]。因此Nrf2也可為腦卒中的治療提供新靶點。

5 結語與展望

綜上表明,自鐵死亡被發(fā)現(xiàn)以來,就在心血管疾病和癌癥中扮演著極為重要的角色。通過本文綜述,可知鐵死亡機制與鐵代謝、脂質代謝和氨基酸代謝通路有密切的聯(lián)系;以及維生素E、硒元素、GSH、GPX4、脂質過氧化物、鐵螯合劑、抗氧化劑等在鐵死亡中的作用。盡管大量的試驗證明腦卒中與鐵死亡息息相關,但仍然有許多問題需要被進一步研究:鐵死亡過程中最關鍵的啟動因子是什么?已知調控鐵死亡中發(fā)揮作用的物質的深層分子機制是怎樣的?除動物實驗等基礎研究外,能否提供更多的臨床證據(jù)?除此之外,基于已知的鐵死亡機制研發(fā)更多的中藥制劑以及鐵死亡抑制劑如何在臨床上使用,從而改善患者預后,將是治療腦卒中的一個大膽嘗試。