不同毒力傳染性支氣管炎病毒誘導(dǎo)SPF雞炎癥反應(yīng)的免疫機制

馬得瑩，范佳慧, ，任夢婷, ，謝晶晶, ，王芳芳，焦亞茹, ，韓宗璽

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，哈爾濱 150030；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所，獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點實驗室，哈爾濱 150001）

天然免疫系統(tǒng)是機體抵御病原微生物感染的第一道防線。病原入侵機體后，最初的相互作用是宿主細(xì)胞通過模式識別受體（Pattern recognition receptors，PRRs）識別病原體相關(guān)分子模式（Pathogen associated molecule patterns，PAMPs）[1]。目前，研究最深入的PRRs 是Toll 樣受體（Toll-like receptors，TLRs），在禽體內(nèi)，已發(fā)現(xiàn) 10 種 TLRs 基因[2]。TLRs 胞外區(qū)通過識別PAMPs 或受損細(xì)胞的分子向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)識別信號，募集相應(yīng)接頭蛋白，通過 MyD88（Myeloid differentiation factor 88，MyD88）和 TRIF（Toll-like receptor adaptor molecule，TRIF）依賴性途徑激活誘導(dǎo)趨化因子、細(xì)胞因子及共刺激分子等信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，抵御入侵的病原體[3]。細(xì)胞因子具有免疫調(diào)節(jié)、細(xì)胞損傷修復(fù)及促進(jìn)細(xì)胞生長等功能，在免疫系統(tǒng)發(fā)揮相互聯(lián)系的介導(dǎo)作用[4]。白細(xì)胞介素（Interleukin，IL）具有免疫調(diào)節(jié)、細(xì)胞損傷修復(fù)及活化T 細(xì)胞、B 細(xì)胞等功能，在免疫系統(tǒng)發(fā)揮介導(dǎo)作用[5]。IL-1β、IL-6 和IL-8是促炎細(xì)胞因子，可誘導(dǎo)多種免疫細(xì)胞增殖、分化及不同靶基因轉(zhuǎn)錄[5]。淋巴細(xì)胞是主要免疫細(xì)胞之一，按照功能可分為T 細(xì)胞、B 細(xì)胞和NK 細(xì)胞。CD4分子主要在Th細(xì)胞表達(dá)[6]，當(dāng)外源病原體入侵機體，CD4T細(xì)胞通過T細(xì)胞受體（T cell receptor，TCR）識別多肽-MHC Ⅱ復(fù)合物，增強CD8T細(xì)胞清除病毒以及被病毒感染的細(xì)胞活性，間接發(fā)揮抗病毒作用[7]。

傳染性支氣管炎病毒（Infectious bronchitis virus，IBV）是一種正向單鏈RNA病毒，屬于冠狀病毒科（Coronaviridae）冠狀病毒屬γ-冠狀病毒，基因組全長約27.6 kb[8]。IBV 基因具有5'帽子和3'poly（A）尾巴結(jié)構(gòu)，基因組3'端編碼4 種結(jié)構(gòu)蛋白，包括纖突蛋白（S）、核衣殼蛋白（N）、膜蛋白（M）和小分子蛋白（E），4 種輔助蛋白（3a、3b、5a 和5b）[9]。1931年，Schalk和Hawn最早對IBV進(jìn)行報道[10]。禽傳染性支氣管炎（Infectious bronchitis，IB）是由IBV引起的一種急性、高度傳染性疾病，可引起各日齡雞呼吸道疾病、間質(zhì)性腎炎和生殖障礙。Kameka等發(fā)現(xiàn)，雞感染IBV后，通過誘導(dǎo)TLR7 mRNA表達(dá)，啟動宿主天然免疫反應(yīng)[11]。De Silva等用TLR21配體CpG ODN預(yù)處理后，雛雞感染IBV后發(fā)病率及死亡率顯著降低，且氣管和肺臟巨噬細(xì)胞、CD4T 細(xì)胞和CD8T細(xì)胞均有不同程度增加[12]。體外研究發(fā)現(xiàn)，雞傳染性支氣管炎病毒M41株感染雞巨噬細(xì)胞后，干擾素（Interferon，IFN-α）、IL-1β、IL-6 均顯著增加，并由病毒復(fù)制觸發(fā)細(xì)胞凋亡[13]。

IBV血清型眾多，不同血清型疫苗交叉保護(hù)力低，易造成疫苗免疫失敗，且野毒株和疫苗毒株可能出現(xiàn)病毒重組，產(chǎn)生“新”毒株，導(dǎo)致免疫失敗，雞群發(fā)病。本試驗研究不同毒力IBVs 對雞天然免疫和獲得性免疫反應(yīng)的影響，深入探討IBV致雞免疫炎癥反應(yīng)及機體內(nèi)免疫因子通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制的抗病毒作用。

1 材料與方法

1.1 材料

選取1日齡無特定病原體（SPF）的雌雄混合白來航雞120只，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所提供，無菌飼養(yǎng)至7日齡。IBV 毒株：106EID50CK/CH/LDL/140520毒株（IBV強毒株）、104EID50γCoV/ck/China/I0718/17毒株（IBV弱毒株）均由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所禽呼吸道病創(chuàng)新團(tuán)隊保存。

1.2 主要試劑及儀器

PrimeScriptTMOne-Step RT-PCR 試劑盒、One Step SYBR?PrimeScriptTMRT-PCR Kit Ⅱ試劑盒、RNAiso Plus 均購自TaKaRa（大連）公司，ELISA 試劑盒購自美國BioChek公司，所用試劑異丙醇、無水乙醇、苯酚、三氯甲烷和冰乙酸均為分析純。LightCycler?480 II 熒光定量 PCR 儀、瑞士 Roche 酶標(biāo)儀BioTek。

1.3 動物實驗

將120 只7 日齡SPF 白來航雞隨機分為三組，分別為對照組和兩個感染組，每組40 只。感染組分別通過滴鼻點眼途徑接種IBV強毒株、IBV弱毒株0.1 mL·只-1，對照組接種同等劑量PBS。隔離飼養(yǎng)，自由采食和飲水。分別在攻毒后12、36 h 和3、7、14 d，每組隨機選取5 只心臟采血處死，檢測血清抗體水平。采集腎臟、氣管、法氏囊和脾臟冷凍保存，用于RNA提取。

1.4 組織總RNA提取

采用TRIzol 方法提取組織樣品總RNA。經(jīng)鑒定后用100 μL DEPC處理水吹吸溶解混勻，超低溫冰箱（-80 ℃）保存。

1.5 引物設(shè)計及合成

根據(jù)GenBank中已發(fā)表IBV序列、雞內(nèi)參基因18S rRNA、TLRs 基因、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子和細(xì)胞因子序列，利用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計特異性引物，引物序列見表1。

1.6 實時熒光定量PCR

以各臟器組織提取總RNA 為模板，18S rRNA為內(nèi)參基因，使用表1 特異性引物進(jìn)行RT-qPCR檢測，PCR 反應(yīng)體系 25 μL：2X one step buffer 12.5 μL；RNA Free dH2O 7.5 μL；PrimeScript one step Enzyme Mix 1 μL；Forward Primer（2.5 μmol·L-1）1 μL；Reverse Primer（2.5 μmol·L-1）1 μL；RNA 2 μL。PCR 反應(yīng)程序：42 ℃反轉(zhuǎn)錄 5 min；95 ℃預(yù)變性 10 s；95 ℃變性 5 s，60 ℃退火 30 s，共40 個循環(huán)；40 ℃延伸30 s。標(biāo)準(zhǔn)品為參考Woods等[14]方法制備的各基因重組質(zhì)粒，標(biāo)準(zhǔn)品按照10 倍梯度稀釋構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。每個樣品重復(fù)3 次，取其平均值。標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)（copies·μL-1）=（6.023×1023copies·mol-1×質(zhì)粒濃度g·μL-1）（/堿基數(shù)×660 g·mol-1）?；蛳鄬Ρ磉_(dá)量計算公式：基因相對表達(dá)量（校正值）＝Lg（目標(biāo)基因拷貝數(shù)/內(nèi)參基因拷貝數(shù)）。

表1 熒光定量PCR引物序列及產(chǎn)物長度Table 1 Quantitative real-time PCR primer sequences and product length

1.7 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)均以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。所得數(shù)據(jù)采用SPSS（24.0）軟件進(jìn)行方差分析，F(xiàn)檢驗顯著性，P＜0.05為統(tǒng)計顯著性，以a、b、c表示。

在建設(shè)新工科這一宏偉藍(lán)圖之下，產(chǎn)教融合也具有了新的時代特征。從《國務(wù)院辦公廳關(guān)于深化產(chǎn)教融合的若干意見》中可以總結(jié)出以下幾點。

2 結(jié)果與分析

2.1 感染不同毒力IBVs后雞的臨床和剖檢癥狀

對感染組進(jìn)行病理剖解，觀察IBV強弱毒株剖檢病理變化差異（見圖1）。由圖1 可知，對照組未觀察到臨床癥狀和剖檢病理變化，在IBV弱毒感染后，SPF雞未表現(xiàn)出明顯臨床癥狀。剖解發(fā)現(xiàn)，腎臟未出現(xiàn)IBV感染后典型病理變化。IBV強毒株感染后3 d，病雞出現(xiàn)甩頭、精神沉郁、張嘴呼吸、翅膀下垂等臨床癥狀，感染后13 d 癥狀消失；在強毒株感染后5 d出現(xiàn)死亡（兩只），4、6、7、8和10 dpi 各死亡1 只，死亡率20%；剖解感染死亡的雞，可見其腎臟蒼白腫大，尿酸鹽沉積，呈“花斑腎”樣，呈現(xiàn)典型IBV病理剖解變化。

圖1 雞感染不同毒力IBV毒株腎臟剖檢癥狀Fig.1 Autopsy symptoms of kidney levels in chickens infected with different IBV virulent strains

2.2 感染不同毒力IBVs后雞組織病理變化

感染不同毒力IBVs后，采用4%福爾馬林溶液固定部分氣管和腎臟，選取感染IBVs后7 d的氣管和腎臟組織作組織病理檢測，組織病理切片結(jié)果如圖2所示。結(jié)果顯示，與對照組相比，IBV 弱毒株感染導(dǎo)致氣管黏膜層完整性破壞，固有層可見少量炎性細(xì)胞浸潤及炎性細(xì)胞壞死，腎臟髓質(zhì)近皮質(zhì)處可見炎性細(xì)胞浸潤灶；IBV強毒株感染表現(xiàn)為更加嚴(yán)重病變，氣管局部上皮細(xì)胞脫落，固有層增寬，內(nèi)可見較多炎性細(xì)胞浸潤，腎臟皮質(zhì)局部可見大量炎性細(xì)胞浸潤，浸潤區(qū)腎小管部分上皮細(xì)胞變性壞死。

圖2 雞感染不同毒力IBV毒株腎臟和氣管組織病理切片變化Fig.2 Histopathological changes of trachea and kidney in chickens infected with different IBV virulent strains

2.3 感染不同毒力IBVs后雞血清抗體水平

感染不同毒力IBVs 后 12 h、36 h、3 d、7 d 和14 d，采集血清，ELISA 檢測血清抗體水平，結(jié)果如圖3所示，對照組各時間點血清抗體水平均為陰性，IBV 強毒株組和IBV 弱毒株組在感染14 d 時，可檢測到感染雞血清抗體水平呈陽性。

圖3 雞感染不同毒力IBV毒株血清抗體水平Fig.3 Serum antibody levels of chickens in response to IBV virulent strains

2.4 感染不同毒力IBVs后雞組織病毒載量檢測

分別使用不同毒力IBVs 感染不同時間點，通過RT-qPCR 方法，檢測病毒在各臟器組織的病毒載量，如圖4所示。結(jié)果顯示對照組采集的所有臟器組織中，均未檢測到病毒。在IBV弱毒株感染組中，法氏囊在7和14 dpi，腎臟和氣管均在7 dpi檢測到病毒；在IBV強毒株感染組中，法氏囊和脾臟在 7 和 14 dpi，氣管在 36 hpi、3、7 和 14 dpi 均檢測到病毒，且病毒拷貝數(shù)高于IBV 弱毒株感染組。上述試驗結(jié)果說明各組均攻毒成功，雞可感染不同毒力的IBV，且不同毒力IBVs 在不同器官中感染情況存在差異。

圖4 感染不同毒力IBV后雞各組織病毒載量Fig.4 Viral load in tissues of chickens in response to different virulence IBV infection

2.5 感染不同毒力IBVs 后雞組織中TLRs 表達(dá)量

感染不同毒力IBV 后不同時間SPF 雞組織TLRs 基因表達(dá)差異結(jié)果如圖5 所示。與對照組相比，TLR7在強弱毒株感染組中法氏囊（12 hpi）和氣管（14 dpi）基因表達(dá)量顯著升高（P＜0.05），TLR7在IBV強毒株組中脾臟（3 dpi）基因表達(dá)水平顯著下調(diào)（P＜0.05）。與對照組相比，TLR15 在強弱毒株感染組中法氏囊（12 hpi）基因表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05），在IBV 弱毒株感染組中法氏囊和腎臟（12 hpi）基因表達(dá)水平顯著高于IBV 強毒株組（P＜0.05），在感染后期，IBV 強毒株誘導(dǎo)TLR15 在法氏囊和脾臟（14 dpi）的基因表達(dá)水平顯著高于IBV弱毒株（P＜0.05）。與對照組相比，TLR21在強弱毒株感染組中法氏囊（3 dpi）、腎臟和氣管（14 dpi）的基因表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05），IBV強毒株誘導(dǎo)TLR21 在法氏囊和脾臟（14 dpi）的基因表達(dá)水平顯著高于 IBV 弱毒株（P＜0.05），IBV 弱毒株誘導(dǎo)TLR21 在脾臟（3 dpi）的基因表達(dá)水平顯著高于IBV強毒株（P＜0.05）。

圖5 感染不同毒力IBV后雞各組織中TLR基因相對表達(dá)水平變化Fig.5 Relative expression of TLR in the tissue samples of chicken in response to different virulence IBV infection

2.6 感染不同毒力IBVs后雞組織中信號轉(zhuǎn)導(dǎo)基因的表達(dá)量

感染不同毒力IBV后不同時間SPF雞組織信號轉(zhuǎn)導(dǎo)基因表達(dá)水平差異結(jié)果如圖6所示。與對照組相比，MyD88在兩個感染組的法氏囊（12 hpi）基因表達(dá)水平顯著高于對照組（P＜0.05），IBV強毒株誘導(dǎo)MyD88在脾臟（12 hpi）的基因表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05）。IBV 強毒株在法氏囊（14 dpi）和腎臟（3 dpi、14 dpi）誘導(dǎo)MyD88基因表達(dá)水平顯著高于IBV 強毒株（P＜0.05）。與對照組相比，P65 在強弱毒株感染組的法氏囊（12 hpi）基因表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05），IBV 強毒株誘導(dǎo)P65 在腎臟（14 dpi）的基因表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05），IBV強毒株在法氏囊（14 dpi）和腎臟（3 dpi）誘導(dǎo)P65 基因表達(dá)水平顯著高于IBV 強毒株（P＜0.05）。與對照組相比，Rel-B在強弱毒株感染組中法氏囊（12 hpi）基因表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05），IBV 強毒株誘導(dǎo)Rel-B在腎臟（14 dpi）基因表達(dá)水平顯著高于IBV 弱毒株（P＜0.05）。C-Rel在強弱毒株感染組的腎臟和氣管（14 dpi）的基因表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05）。IBV 強毒株誘導(dǎo)C-Rel在脾臟和腎臟（3 dpi）的基因表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05），對照組和IBV弱毒株組均未檢測到表達(dá)。

圖6 感染不同毒力IBV后雞各組織中信號轉(zhuǎn)導(dǎo)因子基因相對表達(dá)水平變化Fig.6 Relative expression of signal transduction factor in the tissue samples of chicken in response to different virulence IBV infection

2.7 感染不同毒力IBVs后雞組織中細(xì)胞因子的表達(dá)量

感染不同毒力IBVs 后不同時間SPF 雞組織細(xì)胞因子表達(dá)差異結(jié)果見圖7。與對照組相比，IL-1β在強弱毒株感染組中法氏囊（12 hpi）和氣管（12 hpi、14 dpi）基因表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05），其中IL-1β在IBV弱毒株組法氏囊（12 hpi）基因表達(dá)水平顯著高于對照組和強毒株感染組（P＜0.05）。與對照組相比，IL-6在強弱毒株感染組中法氏囊（12 hpi）基因表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05）。IL-8在IBV弱毒株組中法氏囊（12 hpi、3 dpi）基因表達(dá)水平顯著高于對照組和IBV強毒株感染組（P＜0.05），在IBV強毒株組中腎臟（3 dpi）的基因表達(dá)水平顯著高于對照組和IBV弱毒株感染組（P＜0.05）。強弱毒株感染組在腎臟（14 dpi）和氣管（14 dpi）的IL-8基因均未檢測到表達(dá)。IBV弱毒株誘導(dǎo)IL-6、IL-8在脾臟（3 dpi）的基因表達(dá)水平顯著高于IBV強毒株（P＜0.05）。

圖7 感染不同毒力IBV后雞各組織中細(xì)胞因子基因相對表達(dá)水平變化Fig.7 Relative expression of cytokine in the tissue samples of chicken in response to different virulence IBV infection

2.8 感染不同毒力IBVs后雞組織中獲得性免疫相關(guān)基因的表達(dá)量

感染不同毒力IBVs 后不同時間SPF 雞組織CD4、CD8基因表達(dá)差異結(jié)果如圖8所示。

圖8 感染不同毒力IBV后雞各組織中獲得性免疫因子基因相對表達(dá)水平變化Fig.8 Relative expression of specific immune factor in the tissue samples of chicken in response to different virulence IBV infection

與對照組相比，CD4在強弱毒株感染組中法氏囊（12 hpi）基因表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05），IBV弱毒株感染組表達(dá)更高水平的CD4基因表達(dá)（P＜0.05），強弱毒株在氣管（14 dpi）誘導(dǎo)CD4基因表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05），IBV 弱毒株在脾臟（3 dpi）誘導(dǎo)CD4基因表達(dá)水平顯著高于IBV 強毒株（P＜0.05），IBV強毒株在脾臟（14 dpi）誘導(dǎo)CD4基因表達(dá)水平顯著高于IBV弱毒株（P＜0.05）。與對照組相比，強弱毒株感染組在法氏囊（3 dpi）的CD8基因表達(dá)水平均顯著升高（P＜0.05）。IBV 弱毒株誘導(dǎo)CD8 基因在法氏囊（14 dpi）的基因表達(dá)水平顯著高于IBV 強毒株（P＜0.05）；CD8基因在IBV弱毒株法氏囊（12 hpi）的基因表達(dá)水平顯著高于對照組和強毒株感染組（P＜0.05）。

3 討 論

傳染性支氣管炎嚴(yán)重威脅家禽健康，阻礙養(yǎng)禽業(yè)發(fā)展。本試驗研究發(fā)現(xiàn)，IBV 強毒株感染SPF雞后，出現(xiàn)明顯臨床癥狀，死亡率達(dá)20%，感染后死亡的SPF雞剖檢可觀察到典型IBV誘導(dǎo)的病理變化，但在IBV弱毒株感染SPF雞后，并無明顯臨床癥狀和剖檢病理變化，與本研究結(jié)果相似。Gao等發(fā)現(xiàn)，1 日齡SPF 雞感染腎型IBV 強毒株后，出現(xiàn)較明顯臨床癥狀，發(fā)病率100%，死亡率60%[15]。IBV 強毒株和弱毒株感染組14 d 均出現(xiàn)抗體轉(zhuǎn)陽現(xiàn)象，但I(xiàn)BV強毒株組抗體陽性值更高，說明IBV強毒株誘導(dǎo)更強免疫反應(yīng)。

TLRs 可啟動細(xì)胞內(nèi)信號級聯(lián)反應(yīng)和產(chǎn)生炎癥介質(zhì)如IL-6和TNF-α[16]。研究發(fā)現(xiàn)，感染IBDV 和AIV后，雞體內(nèi)TLR15基因表達(dá)水平顯著上調(diào)，啟動和誘導(dǎo)免疫反應(yīng)[2,17]。本研究中，IBV 弱毒株感染前期，可誘導(dǎo)TLR15基因表達(dá)上調(diào)，與上述研究結(jié)果一致，表明IBV 弱毒株感染前期，通過誘導(dǎo)TLR15基因表達(dá)啟動宿主天然免疫反應(yīng)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在IBV強毒株感染組雞其法氏囊、脾臟和腎臟的TLR7、TLR15、TLR21基因表達(dá)量顯著高于IBV 弱毒株感染組雞。Kapczynski 等發(fā)現(xiàn)，強毒株NDV 在禽類體內(nèi)感染時間更長，可增強機體免疫力并增加免疫持續(xù)時間[18]，與本研究結(jié)果類似，IBV強毒株在感染后期所誘導(dǎo)更強的免疫反應(yīng)與其自身毒力關(guān)系密切，即IBV強毒株毒力更強，感染誘導(dǎo)激活的TLRs種類更多，導(dǎo)致感染后期TLRs表達(dá)上調(diào)，引起宿主持續(xù)免疫反應(yīng)。

當(dāng)病原體侵襲激活TLRs 信號后，MyD88 激活NF-κB信號通路，激活天然免疫應(yīng)答和炎癥免疫反應(yīng)。趙文均研究發(fā)現(xiàn)，雞感染FAdV-4 后TLR1、TLR4、TLR5、TLR15 和 TLR21 主要通過 MyD88 信號通路發(fā)揮免疫作用[19]。本研究中，IBV強毒株和IBV 弱毒株均可有效激活MyD88 信號通路，且MyD88 與P65、Rel-B 表達(dá)量變化趨勢一致。說明其分別在感染前期和后期通過MyD88/P65/Rel-B途徑，調(diào)控機體天然免疫。上述研究表明，IBV弱毒株和強毒株感染早期均可有效激活包括TLR7、TLR15 和TLR21 在內(nèi)的天然免疫反應(yīng)。但在感染早期，IBV 弱毒株相比于強毒株，可更強烈誘導(dǎo)TLR15激活；在感染后期，IBV強毒株可持續(xù)誘導(dǎo)活化TLR7、TLR15 和TLR21 信號以維持宿主持續(xù)免疫反應(yīng)。弱毒株因其致病性差異，后期誘導(dǎo)TLR7、TLR15和TLR21活化能力顯著減弱。

細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、IL-8等的表達(dá)，在炎癥天然免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[20]。當(dāng)天然免疫系統(tǒng)識別體內(nèi)病原體時，會激活產(chǎn)生細(xì)胞因子，引發(fā)相應(yīng)炎癥反應(yīng)，適度炎癥反應(yīng)有助于消除病原微生物。Zhao 等研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)FAdV-4 感染雞后，感染早期脾臟中IL-1β、IL-6基因表達(dá)上調(diào)，抑制病毒復(fù)制，法氏囊作為重要免疫器官，在病毒感染后期IL-1β、IL-6、IL-8 參與宿主抗病毒反應(yīng)，快速清除病原體[21]。本研究發(fā)現(xiàn)IBV弱毒株在感染早期誘導(dǎo)法氏囊中IL-1β、IL-8 基因高表達(dá)，IBV強毒株在感染后期誘導(dǎo)脾臟中IL-6 基因高表達(dá)，上述細(xì)胞因子在宿主抗IBV感染過程中發(fā)揮重要作用。與此同時，在宿主獲得性免疫反應(yīng)過程中，T細(xì)胞免疫在禽類感染中發(fā)揮重要作用，CD4T細(xì)胞可直接產(chǎn)生抗病毒細(xì)胞因子，也可提高B 細(xì)胞活性，促進(jìn)細(xì)胞毒性CD8T 細(xì)胞成熟和增殖[22]。本研究發(fā)現(xiàn)，CD4、CD8在強毒株感染雞脾臟中基因表達(dá)量顯著高于弱毒株感染；在弱毒株感染雞法氏囊中CD4、CD8基因表達(dá)量顯著高于IBV強毒株感染。說明在IBV強毒株感染所激活的獲得性免疫反應(yīng)主要由脾臟調(diào)控，弱毒株IBV感染所激活獲得性免疫反應(yīng)主要由法氏囊調(diào)控。綜上，本研究發(fā)現(xiàn)不同毒力傳染性支氣管炎病毒誘導(dǎo)SPF雞炎癥反應(yīng)的免疫機制存在差異，且強弱毒株感染宿主所誘導(dǎo)的獲得性免疫反應(yīng)發(fā)生由不同免疫器官介導(dǎo)。為進(jìn)一步揭示IBV強弱毒株的致病性差異及誘導(dǎo)宿主不同免疫反應(yīng)的激活機理提供新的參考依據(jù)。

4 結(jié) 論

本研究表明SPF 雞人工感染IBV 強毒株CK/CH/LDL/140520 和 IBV 弱毒株 γCoV/ck/China/I0718/17后，IBV強毒株比IBV弱毒株誘導(dǎo)更強烈更持久的免疫反應(yīng)，IBV 強毒株組在感染后期通過TLR7、TLR15、TLR21，IBV 弱毒株組在感染前期通過TLR15 經(jīng)MyD88 途徑活化促炎細(xì)胞因子和免疫因子發(fā)揮免疫作用，且強弱毒株感染宿主所誘導(dǎo)的獲得性免疫反應(yīng)發(fā)生由不同免疫器官介導(dǎo)。