產(chǎn)胞外谷胱甘肽釀酒酵母的誘變選育及發(fā)酵優(yōu)化

吳崢，雷敏，蔡俊

（發(fā)酵工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，工業(yè)微生物湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，工業(yè)發(fā)酵省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北工業(yè)大學(xué)，湖北 武漢 430068）

谷胱甘肽（glutathione，GSH）即 γ-谷氨酸-L-半胱氨酸-甘氨酸，是由3種氨基酸（谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸）在谷氨酰半胱氨酸合成酶和谷胱甘肽合酶的連續(xù)作用下合成的非蛋白硫醇三肽[1]，具有保護(hù)細(xì)胞抵抗氧化性損害，維持胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的重要作用[2-4]。GSH廣泛應(yīng)用于食品[5-7]、化妝品[8]和醫(yī)藥[9-12]等工業(yè)領(lǐng)域，可作為抗氧化劑和調(diào)味劑，能夠有效防止食品的褐變、保持食品獨(dú)特風(fēng)味[13-16]，也可以作為自由基清除劑，具有保護(hù)腎臟、增強(qiáng)肝臟解毒能力的功效[17-18]。

微生物發(fā)酵法是目前工業(yè)化生產(chǎn)GSH最普遍的方法[19-20]，然而GSH作為一種胞內(nèi)產(chǎn)物，在發(fā)酵下游提取GSH的生產(chǎn)力和經(jīng)濟(jì)效益無法有效滿足市場(chǎng)需求，在一定程度上制約其產(chǎn)業(yè)化發(fā)展，若發(fā)酵菌株胞內(nèi)GSH能有效分泌至胞外，則可以在發(fā)酵液中直接制備純化GSH，簡化提取工藝，降低下游分離純化GSH的難度，從而提高GSH的生產(chǎn)力。近年來，如何獲得產(chǎn)胞外GSH的發(fā)酵菌株受到國內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注[21]。如利用基因工程技術(shù)來增強(qiáng)發(fā)酵菌株對(duì)GSH的胞外運(yùn)輸作用[22-24]，或是通過改善細(xì)胞膜通透性促進(jìn)谷胱甘肽的外泌與積累。但構(gòu)建胞外發(fā)酵谷胱甘肽工程菌的改造成本和技術(shù)要求較高，且細(xì)胞膜通透性的調(diào)節(jié)為有機(jī)試劑化學(xué)滲透法[25]，考慮到對(duì)菌株生長活性和環(huán)境的影響，此方法不宜應(yīng)用在工業(yè)化生產(chǎn)。

利用傳統(tǒng)紫外誘變育種技術(shù)，不僅能簡便快速地篩選得到目的菌株，而且能確保突變株遺傳穩(wěn)定性[26]，然而目前研究報(bào)道中，通過紫外誘變只篩選出胞內(nèi)高產(chǎn)谷胱甘肽的突變株，未得到產(chǎn)胞外谷胱甘肽的突變株[27-29]。因此，本研究以釀酒酵母（Saccharmyces Cerevisiae）GAQ4為出發(fā)菌株，采用紫外迭代誘變，選育出發(fā)酵產(chǎn)胞外谷胱甘肽且遺傳穩(wěn)定的突變株，并通過優(yōu)化其發(fā)酵條件進(jìn)一步提高胞外GSH產(chǎn)量，為GSH胞外發(fā)酵策略和實(shí)現(xiàn)GSH胞外發(fā)酵工業(yè)化生產(chǎn)提供新的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）GAQ4：湖北工業(yè)大學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室工業(yè)發(fā)酵，湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心A610實(shí)驗(yàn)室保藏菌株。

葡萄糖、酵母粉、蛋白胨、硫酸銨、磷酸二氫鉀、無水硫酸鎂、瓊脂粉、磷酸（均為分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；1-庚烷磺酸鈉、谷胱甘肽（均為分析純）：上海麥克林生化科技有限公司；甲醇（色譜級(jí)）：賽默飛世爾科技（中國）有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-1D型單人凈化工作臺(tái)：蘇州凈化設(shè)備有限公司；ZSD-12全自動(dòng)生化培養(yǎng)箱：上海智城分析儀器有限公司；ZHWY系列雙層恒溫培養(yǎng)振蕩器：中國科學(xué)院武漢科學(xué)儀器廠；LC-20AD型高效液相色譜儀：日本島津公司；Sartorius普及型PH計(jì)（PB-10）：賽多利斯（上海）貿(mào)易有限公司；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 培養(yǎng)方法

種子液體培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，蛋白胨20 g/L，酵母粉10 g/L，pH值自然。

種子固體培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，蛋白胨20 g/L，酵母粉10 g/L，瓊脂粉20 g/L，pH值自然。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，酵母粉10 g/L，硫酸銨8 g/L，磷酸二氫鉀3 g/L，硫酸鎂0.15 g/L，pH值自然。

種子培養(yǎng)：取甘油管保藏的菌懸液接入種子培養(yǎng)基中，于溫度30℃、搖瓶轉(zhuǎn)速180 r/min條件下進(jìn)行培養(yǎng)。

發(fā)酵培養(yǎng)：取處于對(duì)數(shù)生長期的種子液，以體積分?jǐn)?shù)為10%接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基，于溫度30℃、搖瓶轉(zhuǎn)速180 r/min條件下培養(yǎng)。

1.3.2 紫外誘變

誘變過程：將15 W紫外燈預(yù)熱20 min。取處于對(duì)數(shù)生長期的種子菌懸液，將菌懸液稀釋至細(xì)胞數(shù)為107CFU/mL～108CFU/mL，取 200 μL 稀釋液涂布至種子固體培養(yǎng)基后，立即將培養(yǎng)基平板放置距離紫外燈30cm處進(jìn)行紫外照射，照射時(shí)間分別為10、20、30、40、50、60 s，每組設(shè)置3個(gè)平行，照射結(jié)束后立即將平板倒置于30℃培養(yǎng)箱避光培養(yǎng)，統(tǒng)計(jì)各平板生長的單菌落數(shù)。將未經(jīng)紫外照射的稀釋菌懸液涂布在固體培養(yǎng)基后避光培養(yǎng)，作為對(duì)照組。計(jì)算紫外誘變致死率，以紫外照射時(shí)間為橫坐標(biāo)，紫外誘變致死率為縱坐標(biāo)，繪制紫外誘變致死曲線。誘變致死率計(jì)算公式如下。

紫外迭代誘變：以菌株胞外GSH含量為篩選指標(biāo)，對(duì)出發(fā)菌株GAQ4進(jìn)行紫外迭代誘變處理，即下一次誘變以上一次誘變后篩選得到符合篩選指標(biāo)的突變株為出發(fā)菌株，再次進(jìn)行誘變篩選。每次誘變的試驗(yàn)組設(shè)置3個(gè)平行，以獲得足夠突變株數(shù)量，提高正向突變率。每一次紫外誘變均需繪制紫外誘變致死曲線，以便選擇各代誘變菌株最適誘變劑量。

遺傳穩(wěn)定性試驗(yàn)：為確認(rèn)獲得的目的菌株具有良好的遺傳穩(wěn)定性，將篩選得到的目的菌株連續(xù)傳代8次，并對(duì)第1代、第4代和第8代進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，以出發(fā)菌株GAQ4為對(duì)照，檢測(cè)對(duì)比發(fā)酵產(chǎn)胞外谷胱甘肽含量。

1.3.3 發(fā)酵條件單因素試驗(yàn)

以胞外GSH含量為指標(biāo)，采用單因素試驗(yàn)研究發(fā)酵周期、搖瓶裝液量、初始pH值和發(fā)酵溫度、搖瓶轉(zhuǎn)速對(duì)突變株搖瓶發(fā)酵產(chǎn)胞外GSH含量的影響，試驗(yàn)水平分別為發(fā)酵周期 24、36、48、60、72 h；搖瓶裝液量50、75、100、125、150 mL/300 mL；初始 pH 值 5.0、5.5、6.0、6.5、7.0；發(fā)酵溫度 26、30、34、38、42 ℃；搖瓶轉(zhuǎn)速 120、140、160、180、200 r/min。對(duì)突變株搖瓶發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，各因素設(shè)置3個(gè)平行，取平均值，確定最優(yōu)搖瓶發(fā)酵條件。

1.3.4 生物量的測(cè)定

取一定體積菌懸液于8 000 r/min離心5 min后收集濕菌體，用無菌水洗滌菌體3次后，置于65℃烘箱烘干至恒重，稱量得到細(xì)胞干重，生物量計(jì)算公式如下。

生物量/（g/L）=細(xì)胞干重（g）/菌懸液體積（L）

1.3.5 谷胱甘肽的測(cè)定

利用高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）測(cè)定 GSH 含量[30]，色譜條件：色譜柱Inertsil ODS-SP C18，流動(dòng)相為庚烷磺酸鈉-磷酸鹽緩沖溶液（1-庚烷磺酸鈉6.8 g，磷酸二氫鉀2.2 g，用磷酸調(diào)節(jié)pH 3.0，超純水定容至1 L）和甲醇（磷酸鹽緩沖液與甲醇體積比為90∶10），流速為1.0 mL/min，進(jìn)樣量20 μL，紫外檢測(cè)波長為210 nm。

稱取谷胱甘肽標(biāo)品10 mg，用超純水定容至10 mL，分別稀釋到濃度為 200、400、600、800、1 000 mg/L，用HPLC法檢測(cè)出不同GSH溶液濃度對(duì)應(yīng)的峰面積，以GSH濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制HPLC法檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線（如圖1），得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸公式為y=18 045x+168 919，R2=0.999 3，以此進(jìn)行 GSH 含量的計(jì)算。

圖1 HPLC法檢測(cè)谷胱甘肽的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of glutathione determined by HPLC

2 結(jié)果與分析

2.1 誘變育種結(jié)果

2.1.1 出發(fā)菌株GAQ4胞外GSH含量

對(duì)出發(fā)菌株GAQ4進(jìn)行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)48 h后，檢測(cè)得到其胞外谷胱甘肽含量為7.37 mg/L，以出發(fā)菌株胞外谷胱甘肽含量為指標(biāo)，與誘變得到突變株產(chǎn)胞外谷胱甘肽含量進(jìn)行對(duì)照。

2.1.2 紫外誘變篩選結(jié)果

以胞外GSH含量為篩選指標(biāo)，根據(jù)1.3.2的方法對(duì)出發(fā)菌株GAQ4進(jìn)行紫外迭代誘變處理。第1次紫外誘變篩選結(jié)果見圖2。

圖2 第1次紫外誘變結(jié)果Fig.2 Results of first UV mutagenesis

如圖2A所示，根據(jù)第1次紫外誘變致死曲線，隨著紫外照射時(shí)間的延長，誘變致死率逐漸升高。在紫外照射時(shí)間為30 s時(shí)，出發(fā)菌株致死率達(dá)到74.5%，處于高概率正向突變的致死率范圍內(nèi)，選擇紫外照射30 s作為第1次紫外誘變的劑量。

第1次紫外照射處理后共挑取出200個(gè)單菌落，以發(fā)酵后具有較高胞外谷胱甘肽含量為指標(biāo)，從初篩菌株中挑選出15株突變株（圖2B），其中突變株UV1-6胞外谷胱甘肽含量為13.87 mg/L，相比出發(fā)菌株胞外谷胱甘肽含量提高了88.20%，選擇突變株UV1-6繼續(xù)進(jìn)行紫外誘變篩選。

以突變株UV1-6為第2次紫外誘變的出發(fā)菌株，第2次紫外誘變篩選結(jié)果見圖3。

圖3 第2次紫外誘變結(jié)果Fig.3 Results of second UV mutagenesis

由圖3A可知，突變株在紫外照射30 s時(shí)菌體致死率為78.6%，在相同誘變劑量下與前一次誘變效果相比，致死率提高，仍選取紫外照射30 s誘變劑量進(jìn)行第二次誘變處理。

由圖3B可知，經(jīng)第2次紫外誘變篩選，從中挑選出胞外谷胱甘肽含量相對(duì)較高的14株突變株，其中篩選得到的突變株UV2-2胞外谷胱甘肽含量為16.10 mg/L，比出發(fā)菌株GAQ4和突變株UV1-6胞外谷胱甘肽含量分別提高了118.45%、16.08%。

繼續(xù)對(duì)突變株UV2-2進(jìn)行第3次紫外誘變處理，結(jié)果見圖4。

圖4 第3次紫外誘變結(jié)果Fig.4 Results of third UV mutagenesis

由圖4A可知，相同誘變劑量作用后，第3次紫外誘變的致死率明顯提高，當(dāng)紫外照射10 s時(shí)致死率達(dá)到69.5%，紫外照射20s時(shí)致死率為81.9%，因此選取照射15 s作為第3次誘變處理時(shí)間。經(jīng)過篩選得到11株胞外GSH含量較高突變株。由圖4B可知，第3次誘變篩選得到的突變株UV3-10胞外GSH含量為19.08 mg/L，相比出發(fā)菌株、突變株UV1-6和突變株UV2-2胞外GSH含量分別提高了158.89%、37.56%和18.51%。

通過以上分析，第3次誘變的正向突變效果不如前兩次明顯，篩選出的突變株中僅有少量突變株的胞外谷胱甘肽含量提高，部分突變株含量甚至低于第3次誘變前，且在相同誘變劑量作用下的紫外誘變致死率逐漸提升，超出處于高概率正向突變的致死率范圍內(nèi)，因此不再進(jìn)行第4次誘變篩選，選取3次紫外誘變篩選得到的突變株UV1-6、UV2-2、UV3-10進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

2.1.3 遺傳穩(wěn)定性結(jié)果

將3次紫外誘變篩選獲得的突變株UV 1-6、UV 2-2、UV 3-10連續(xù)傳代8次，分別測(cè)定第1代、第4代和第8代發(fā)酵培養(yǎng)后胞外谷胱甘肽含量，結(jié)果見表1。

表1 突變株遺傳穩(wěn)定性檢測(cè)結(jié)果Table 1 Genetic stability determination of mutants

在突變株傳至第8代時(shí)，突變株UV 3-10胞外谷胱甘肽含量最高，為18.56 mg/L，且突變株UV 3-10發(fā)酵產(chǎn)胞外谷胱甘肽的性能具有一定的遺傳穩(wěn)定性，因此選擇突變株UV 3-10作為目的菌株。

2.2 發(fā)酵條件優(yōu)化

突變株UV3-10在原始搖瓶發(fā)酵條件，即搖瓶裝液量100 mL/300 mL、發(fā)酵初始pH值為自然、發(fā)酵溫度30℃、轉(zhuǎn)速180 r/min的發(fā)酵條件下，突變株胞外GSH含量為18.56 mg/L，生物量為5.64 g/L。分別對(duì)突變株發(fā)酵條件的發(fā)酵周期、搖瓶裝液量、初始pH值、發(fā)酵溫度、搖瓶轉(zhuǎn)速進(jìn)行單因素優(yōu)化試驗(yàn)。發(fā)酵周期對(duì)目的菌株UV3-10產(chǎn)胞外谷胱甘肽的影響見圖5。

圖5 發(fā)酵周期對(duì)目的菌株UV3-10產(chǎn)胞外谷胱甘肽的影響Fig.5 Effect of fermentation cycle on extracellular GSH production by UV3-10

由圖5可知，突變株胞外谷胱甘肽含量隨著發(fā)酵時(shí)間的延長呈先上升后下降的趨勢(shì)。在發(fā)酵時(shí)間為48 h時(shí)，胞外谷胱甘肽含量為18.97 mg/L，隨著發(fā)酵時(shí)間繼續(xù)延長，胞外谷胱甘肽含量開始下降，因此選取48h為發(fā)酵時(shí)間，在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步優(yōu)化其他發(fā)酵條件。

搖瓶裝液量對(duì)目的菌株產(chǎn)胞外谷胱甘肽的影響見圖6。

圖6 搖瓶裝液量對(duì)目的菌株產(chǎn)胞外谷胱甘肽的影響Fig.6 Effect of shake flask volume on extracellular GSH production by UV3-10

由圖6可知，當(dāng)搖瓶裝液量為75 mL/300 mL時(shí)，目的菌株胞外谷胱甘肽含量最高，隨著搖瓶裝液量逐漸增加，胞外谷胱甘肽含量開始下降，搖瓶裝液量過高，影響搖瓶中的溶氧量從而影響目的菌株的發(fā)酵性能，故選擇最佳搖瓶裝液量為75 mL/300 mL。

突變株搖瓶初始pH值優(yōu)化結(jié)果見圖7。

圖7 初始pH值對(duì)目的菌株產(chǎn)胞外谷胱甘肽的影響Fig.7 Effect of initial pH on extracellular GSH production by UV3-10

當(dāng)發(fā)酵初始pH值從5.0升至6.0時(shí)，胞外谷胱甘肽含量變化不大，而pH值增至6.5時(shí)胞外谷胱甘肽含量迅速增高到36.42 mg/L，隨著pH值上升胞外谷胱甘肽含量又開始下降，在pH 6.5時(shí)胞外谷胱甘肽含量達(dá)到最大值，因此選擇最佳初始pH值為6.5。

發(fā)酵溫度對(duì)目的菌株產(chǎn)胞外谷胱甘肽的影響見圖8。

圖8 發(fā)酵溫度對(duì)目的菌株產(chǎn)胞外谷胱甘肽的影響Fig.8 Effect of fermentation temperature on extracellular GSH production by UV3-10

由圖8可知，發(fā)酵溫度對(duì)目的菌株胞外谷胱甘肽含量的影響高于其他因素，發(fā)酵溫度適當(dāng)升高對(duì)突變株分泌胞外谷胱甘肽有促進(jìn)作用[31]。隨著發(fā)酵溫度的升高，胞外谷胱甘肽含量也在不斷增加，當(dāng)發(fā)酵溫度升至34℃時(shí)，胞外谷胱甘肽含量達(dá)到40.63 mg/L，是發(fā)酵溫度30℃時(shí)胞外谷胱甘肽含量的1.68倍。若發(fā)酵溫度繼續(xù)升高，胞外谷胱甘肽含量不再增加，溫度升至42℃時(shí)突變株胞外谷胱甘肽含量僅為17.15 mg/L，此時(shí)生物量降至最低，僅有3.16 g/L。因此，選擇發(fā)酵溫度34℃為最優(yōu)發(fā)酵溫度。

搖瓶轉(zhuǎn)速對(duì)目的菌株產(chǎn)胞外谷胱甘肽的影響見圖9。

圖9 搖瓶轉(zhuǎn)速對(duì)目的菌株產(chǎn)胞外谷胱甘肽的影響Fig.9 Effect of shaking speed on extracellular GSH production by UV3-10

搖瓶溶氧量受到搖瓶裝液量和轉(zhuǎn)速的影響，搖瓶轉(zhuǎn)速產(chǎn)生的剪切力、傳質(zhì)速度以及裝液量的大小對(duì)菌株的接種量、生長狀態(tài)和發(fā)酵產(chǎn)物的合成與積累均有影響，由圖9可知，當(dāng)搖瓶轉(zhuǎn)速為140 r/min時(shí)，胞外谷胱甘肽含量最高，目的菌株產(chǎn)胞外谷胱甘肽含量為52.05 mg/L，是優(yōu)化前胞外谷胱甘肽含量的2.80倍。

經(jīng)上述搖瓶發(fā)酵條件優(yōu)化后，突變株在搖瓶裝液量75 mL/300 mL、發(fā)酵初始pH值6.5、發(fā)酵溫度34℃、轉(zhuǎn)速140 r/min時(shí)，發(fā)酵48 h后，胞外GSH含量達(dá)到52.05 mg/L，是優(yōu)化前胞外GSH含量的2.80倍。

3 討論與結(jié)論

本研究利用紫外迭代誘變法，篩選出能產(chǎn)胞外GSH的突變株UV3-10，其胞外GSH含量為18.56 mg/L，通過單因素試驗(yàn)得到其最優(yōu)搖瓶發(fā)酵條件為發(fā)酵周期48 h、裝液量75 mL/300 mL、發(fā)酵初始pH值6.5、發(fā)酵溫度34℃、轉(zhuǎn)速140 r/min，經(jīng)過搖瓶發(fā)酵條件優(yōu)化后突變株胞外GSH含量為52.05 mg/L，是優(yōu)化前胞外GSH含量的2.80倍。

關(guān)于突變株UV3-10的胞外分泌機(jī)制提出以下猜想：誘變處理后的突變株細(xì)胞通透性發(fā)生改變，即誘變后使某種GSH輸出蛋白的活性得到加強(qiáng)，或者抑制了某種GSH降解蛋白的活性，使酵母細(xì)胞胞內(nèi)物質(zhì)向胞外特異性溢出，在正常發(fā)酵條件下產(chǎn)生了GSH胞外積累的現(xiàn)象。后續(xù)研究可探究突變株的谷胱甘肽運(yùn)輸?shù)鞍准癎SH合成酶系的活性與其胞外分泌機(jī)制的關(guān)聯(lián)性，另外，在發(fā)酵下游如何維持胞外GSH穩(wěn)定性也是有待研究的問題。

突變株UV3-10能將胞內(nèi)合成的GSH分泌至胞外，實(shí)現(xiàn)了胞外GSH的有效積累，使在發(fā)酵液中進(jìn)行GSH工業(yè)化制備的可能性大大提升，相較于胞內(nèi)GSH的提取，其純化分離難度降低，節(jié)省生產(chǎn)成本和能源消耗。另外，釀酒酵母又是食品安全生產(chǎn)菌株，備受食品研發(fā)者們的青睞，釀酒酵母發(fā)酵生產(chǎn)胞外GSH的研究結(jié)果為其在食品加工、貯藏保鮮以及功能性調(diào)味品等方面的應(yīng)用提供了新前景和經(jīng)濟(jì)效益。