秦續(xù)緣,程志強(qiáng),于寒松
(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué),吉林 長(zhǎng)春 130118)
黑果腺肋花楸原產(chǎn)于北美,因其營養(yǎng)價(jià)值高而備受關(guān)注。20世紀(jì)90年代,我國引入黑果腺肋花楸,并相繼在遼寧、吉林、黑龍江等省市發(fā)展種植。王鵬等[1]研究表明,黑果腺肋花楸的果實(shí)富含還原糖、有機(jī)酸、花青素、黃酮和維生素等營養(yǎng)成分,而且黑果腺肋花楸還可用于釀造果酒、釀制保健醋、生產(chǎn)固體果茶。隨著人們對(duì)黑果腺肋花楸果實(shí)營養(yǎng)價(jià)值認(rèn)識(shí)的提高,其加工產(chǎn)品也有了較好的發(fā)展前景。由于黑果腺肋花楸被大量開發(fā)和使用,產(chǎn)生了大量副產(chǎn)物——黑果腺肋花楸果渣,而這些果渣不宜儲(chǔ)存和運(yùn)輸,大部分被丟棄,造成了嚴(yán)重的資源浪費(fèi)和環(huán)境污染。經(jīng)過大量研究發(fā)現(xiàn),黑果腺肋花楸果渣中含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì),如膳食纖維、花青素、蛋白質(zhì)、黃酮醇、多酚類化合物等[2]。因此,對(duì)黑果腺肋花楸果渣的有效利用不僅可以減輕對(duì)環(huán)境的影響,還可以提高黑果腺肋花楸副產(chǎn)物的附加值。
國際食品法典委員會(huì)(Codex Alimentarius Commission,CAC)將纖維定義為具有超過10個(gè)單體單元的聚合物,并且其不會(huì)被人體小腸中的消化酶分解。膳食纖維(dietary fiber,DF)是指從植物細(xì)胞壁中提取的一系列非消化性營養(yǎng)物質(zhì),它們?cè)谌梭w小腸中不易被消化和吸收,在大腸中能完全或部分發(fā)酵,主要有纖維素、半纖維素、木質(zhì)素、果膠、樹膠、低聚糖和其他多糖。根據(jù)其在水中的溶解性,膳食纖維通常分為可溶性膳食纖維(soluble dietary fiber,SDF)和不溶性膳食纖維(insoluble dietary fiber,IDF)[3]。IDF 能使食物快速在消化系統(tǒng)運(yùn)動(dòng),同時(shí)增加糞便體積,有益于便秘人群[4]。流行病學(xué)研究表明,高膳食纖維攝入量可以降低某些疾?。ㄈ缧难芗膊?、結(jié)腸癌和直腸癌)的發(fā)病率。糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化、乳腺癌、憩室炎、痔瘡等多種疾病以及肥胖也均與纖維攝入量密切相關(guān)[5]。
目前,復(fù)合酶法、化學(xué)法、酶化學(xué)法、超聲輔助法和微波輔助法提取IDF的途徑多種多樣,不同的加工條件可能會(huì)改變IDF的成分和結(jié)構(gòu)特征,從而影響IDF的功能和理化活性[6]。IDF的生理功能取決于其纖維基質(zhì)結(jié)構(gòu)、理化性能和功能性能以及粒度[7]。本文采用復(fù)合酶法提取黑果腺肋花楸中IDF,并進(jìn)一步比較提取的IDF功能活性和理化活性,以期為黑果腺肋花楸衍生膳食纖維的研究提供思路,為黑果腺肋花楸的深加工提供參考。
黑果腺肋花楸:采自長(zhǎng)白山;大豆油:市售;淀粉葡萄糖苷酶(100 000 U/g)、中性蛋白酶 60 000 U/g)、高峰α-淀粉酶(40 000 U/g):諾維信(中國)生物技術(shù)有限公司;其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。
高效液相色譜儀(Agilent 7890)、離心機(jī)(KL04-A):美國 Agilent公司;破壁機(jī)(XBLL-S01):中國西貝樂公司;掃描電鏡(SSX-550)、傅里葉紅外光譜儀(model IR Prestige-21)、示差檢測(cè)器(RI-10A):日本Shimadzu公司;鼓風(fēng)干燥箱(葉拓101系列):上海葉拓儀器儀表有限公司;酶標(biāo)儀(HBS-1096B):美國Molecular Devices公司;色差分析儀(CR-5):美能達(dá)投資有限公司;磁力攪拌器(ZNCL-G):鄭州予華儀器制造有限公司。
1.3.1 黑果腺肋花楸的初步處理
將黑果腺肋花楸去梗,用破壁機(jī)打碎、過濾,分離果渣和果汁,在25℃室溫下,將樣品于95%乙醇中攪拌2 d,以去除游離糖。抽濾后在干燥箱(60℃)中干燥24 h。將干燥樣品進(jìn)行研磨,80目篩篩分,得到黑果腺肋花楸果渣(Aronia melanocarpa pomace,AMP),然后將黑果腺肋花楸果渣保存在干燥器中備用。
1.3.2 復(fù)合酶法提取IDF
IDF 的提取參考 Wang 等[6]、Hua 等[8]的方法,稍作修改。取5 g果渣粉(試樣樣品差<0.005 g)置于1 000 mL錐形瓶中,加入蒸餾水250 mL。向試樣液中加入0.5 mL高峰α-淀粉酶液,置于95℃恒溫振蕩水浴中持續(xù)振搖35 min,打開鋁箔,用刮勺輕輕地將附著于錐形瓶?jī)?nèi)壁的膠狀物刮下,并用少量水沖洗瓶壁。之后試樣液置于60℃水浴中,加入1.5 mL中性蛋白酶溶解液,蓋鋁箔,持續(xù)振搖30 min,用6 mol/L NaOH或6 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)pH值至4.50±0.02,加入2 mL淀粉葡萄糖苷酶酶解,繼續(xù)于60℃水浴中持續(xù)振搖30 min,提取液于5 000 r/min離心15 min,提取的殘余物用蒸餾水漂洗2次并冷凍干燥以獲得IDF。
為探究酶對(duì)膳食纖維結(jié)構(gòu)的影響,使用掃描電鏡對(duì)膳食纖維樣品的微觀結(jié)構(gòu)和形態(tài)進(jìn)行檢測(cè)。具體步驟:樣品臺(tái)用無水乙醇擦洗,之后將樣品覆蓋在導(dǎo)電膠體上,輕輕敲打樣品臺(tái),使樣品單層鋪于樣品臺(tái)表面,噴金處理后置于掃描電鏡觀察臺(tái),并在1 000倍和4 000倍的放大倍數(shù)下觀察微觀結(jié)構(gòu)[9]。
取干燥好的樣品粉末,采用溴化鉀壓片法制備樣品,獲得厚約1 mm、直徑約為10 mm的薄片。在4 000 cm-1~400 cm-1對(duì)壓片進(jìn)行掃描,獲得樣品的紅外吸收光譜[10]。
采用Dionex ICS-5000+系統(tǒng),以Carbo PACTM PA20(2.0 mm×150 mm)陰離子交換柱為分析柱,脈沖安培檢測(cè)器為檢測(cè)器,利用梯度洗脫方法進(jìn)行測(cè)定。稱量10 mg樣品置于安瓿瓶中,加入3 mol/L三氟乙酸10 mL,120℃水解3 h。準(zhǔn)確吸取酸水解溶液至試管中氮?dú)獯蹈?,加?0 mL水渦旋混勻,吸取100 μL酸水解溶液加入900 μL去離子水,12 000 r/min離心5 min。將上清液進(jìn)行高效液相色譜分析。
1.7.1 持水性(water holding capacity,WHC)的測(cè)定
根據(jù)Yu等[11]的方法進(jìn)行持水性的測(cè)定。將1.0 g IDF樣品加入至25 mL蒸餾水中,靜置24 h。5 000 r/min離心10 min,立即倒掉上清液,提取殘留物,并測(cè)量其質(zhì)量。持水性的計(jì)算公式如下。
WHC/(g/g)=(W2-W1)/W1
式中:W1為 IDF 樣品質(zhì)量,g;W2為殘留物質(zhì)量,g。
1.7.2 持油性(oil holding capacity,OHC)的測(cè)定
在室溫(25℃)條件下,將1 g樣品加入至25 mL大豆油中,靜置24 h。5 000 r/min離心10 min后立即倒掉上清液,提取沉淀物,然后立即測(cè)量其質(zhì)量。持油性的計(jì)算公式如下。
OHC/(g/g)=(O2-O1)/O1
式中:O1為 IDF 樣品質(zhì)量,g;O2為殘留物質(zhì)量,g。
1.7.3 水膨脹能力(waterswellingcapacity,WSC)的測(cè)定
參考He等[12]的方法檢測(cè)樣品的水膨脹能力,稍作修改。具體方法:稱取0.5 g樣品,倒入25 mL量筒中,與20 mL蒸餾水充分混合均勻,在室溫(25℃)下靜置24 h。記錄靜置前和靜置后體積,樣品的WSC表示樣品水膨脹后的體積變化,其計(jì)算公式如下。
WSC/(mL/g)=(V1-V)/0.5
式中:V1為靜置后的體積,mL;V為靜置前的體積,mL;0.5 為樣品質(zhì)量,g。
1.7.4 亞硝酸根離子吸附能力(nitrite ion adsorption capacity,NIAC)的測(cè)定
將0.1 g樣品與5 mL 10 μg/mL NaNO2溶液混合,并分別將pH值調(diào)節(jié)至7.0和2.0以模擬小腸和胃環(huán)境。然后將混合溶液在37℃水浴鍋中靜置3 h,4 800 r/min離心10 min,取0.4 mL上清液于試管中。根據(jù)劉靜娜等[13]的方法,進(jìn)行反應(yīng),之后使用色差儀進(jìn)行測(cè)定。亞硝酸根離子吸附能力的計(jì)算公式如下。
NIAC/(mg/g)=(C1-C2)×0.005/Μ
式中:C1、C2分別為吸附前、后上清液中NaNO2的濃度,mg/L;M 為樣品質(zhì)量,0.1 g;0.005 為 NaNO2溶液的體積,L。
1.7.5 葡萄糖吸附能力(glucose adsorption capacity,GAC)的測(cè)定
參考Wu等[14]的方法進(jìn)行測(cè)定,稍作修改。具體方法:取1 g樣品加入至100 mL的50、100、150 mmol/L葡萄糖溶液中,然后在37℃水浴鍋中攪拌6 h。將混合物5 000 r/min離心10 min,取上清液0.5 mL于離心管中。根據(jù)Wang等[15]的方法,使用二硝基水楊酸鹽顯色試劑測(cè)定上清液中葡萄糖水平來計(jì)算樣品葡萄糖吸附量(GAC),計(jì)算公式如下。
GAC/(mmol/g)=(C3-C4)×0.1/Μ
式中:C3、C4分別為吸附前、后上清液中葡萄糖水平,mmol/L;M 為樣品質(zhì)量,1 g;0.1 為葡萄糖溶液體積,L。
所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)測(cè)定3次并利用Origin 2018軟件處理數(shù)據(jù)、作圖;采用SPSS 20軟件進(jìn)行顯著性分析(P<0.05),結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。
利用掃描電鏡觀測(cè)復(fù)合酶法提取黑果腺肋花楸不溶性膳食纖維顯微結(jié)構(gòu)。圖1為AMP和IDF的掃描電鏡圖。
圖1 AMP和IDF的電鏡圖Fig.1 Electron micrograph of AMP and IDF
膳食纖維的功能特性和結(jié)構(gòu)特性,主要由其內(nèi)部結(jié)構(gòu)和表面性質(zhì)決定[14]。由圖1可知,AMP表面較為平整且大顆粒較多,可能是由于蛋白質(zhì)和脂肪含量過高,其與纖維以結(jié)合形式或游離形式存在,并進(jìn)一步聚集成團(tuán),相比之下IDF的微觀結(jié)構(gòu)出現(xiàn)明顯的變化,結(jié)構(gòu)出現(xiàn)層次,顆粒數(shù)量也有所減少,并且在相同放大倍數(shù)下,粒徑較APM小,這可以解釋IDF比AMP具有更強(qiáng)的持水性、持油性、亞硝酸根離子吸附和葡萄糖的吸附能力[16]。掃描電鏡結(jié)果表明,提取方法可能會(huì)改變黑果腺肋花楸膳食纖維的功能特性。
圖2為傅里葉紅外光譜,可以分析不同官能團(tuán)的光譜特征。
圖2 IDF和AMP的紅外光譜Fig.2 Infrared spectra of IDF and AMP
由圖2可知,IDF和AMP在吸收峰上沒有明顯變化,均在3 400 cm-1附近出現(xiàn)一個(gè)較寬的吸收峰,是典型的纖維素和半纖維素的O-H伸縮振動(dòng)帶,說明分子間存在氫鍵作用力;在2 900 cm-1附近出現(xiàn)的較弱吸收峰,主要為糖類甲基和亞甲基上的C-H基團(tuán)伸縮振動(dòng)吸收峰[17]。IDF在1 652 cm-1的吸收峰可能是苯環(huán)的特征吸收峰,在1 048 cm-1處出現(xiàn)的較強(qiáng)吸收峰,是纖維素和半纖維素中醚鍵(C-O-C)的伸縮振動(dòng)吸收峰[18],這些區(qū)域的吸收峰均來自IDF的特征吸收峰。IDF的峰形沒有明顯變化,表明提取后主要成分沒有變化,IDF的活性成分在處理過程中沒有被破壞。
IDF的單糖組成如圖3所示。
圖3 IDF的單糖組成Fig.3 Composition of IDF monosaccharides
由圖3可知,IDF含有巖藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、半乳糖醛酸7種單糖。其中單糖含量最高的是木糖(45.3%),說明黑果腺肋花楸膳食纖維中含有較多的木聚糖半纖維素,而木糖是無熱量甜味劑,市場(chǎng)上可以將木糖應(yīng)用于無糖食品的開發(fā),適合肥胖和糖尿病患者食用。阿拉伯糖、半乳糖醛酸和半乳糖的含量也相對(duì)較高。其中阿拉伯糖(低熱量甜味劑)能夠抑制小腸中蔗糖酶活性、延緩血糖升高、降低血清中葡萄糖含量。半乳糖醛酸多數(shù)為甲酯,是果膠酸的組成單位,也是果膠的主要成分,而IDF中的半乳糖醛酸含量較高,也表明復(fù)合酶法可以使部分可溶性膳食纖維轉(zhuǎn)化為不溶性膳食纖維,從而提高不溶性膳食纖維的得率。
2.4.1 持水性、持油性和水膨脹能力測(cè)定結(jié)果
IDF和AMP的持水性、持油性和水膨脹能力結(jié)果如表1所示。
表1 IDF和AMP的持水性、持油性和水膨脹能力Table 1 Water holding capacity,oil holding capacity and water swelling capacity for IDF and AMP
持水性是指受到外力作用時(shí)保持原有水分的能力,膳食纖維的持水性不僅影響滋味、香氣、營養(yǎng)成分、顏色等食用品質(zhì),而且還直接影響膳食纖維制品的成品率,較低的持水性會(huì)給膳食纖維產(chǎn)品帶來較大的經(jīng)濟(jì)損失。而持水性越高,膳食纖維的生理活性越好。膳食纖維的持水性、持油性與親水部位的化學(xué)性質(zhì)、數(shù)量以及IDF的表面積、密度和結(jié)構(gòu)有關(guān)[19]。由表1可知,IDF的WHC 為(3.59±0.10)g/g,較AMP有所增加,表明復(fù)合酶法提取使AMP的分子形態(tài)發(fā)生改變,暴露出更多極性基團(tuán)等可與水分子結(jié)合的位點(diǎn),提高了IDF的持水能力,同時(shí),與IDF的微觀結(jié)構(gòu)也密切相關(guān)。
IDF的持油性在各種食品應(yīng)用中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用,如加工食品的過程中防止脂肪流失;人體食用后其吸附大量脂肪后排出體外。膳食纖維與油脂的結(jié)合能力取決于IDF的表面性質(zhì)和纖維顆粒的疏水性[20]。IDF 的持油性顯著強(qiáng)于 AMP(P<0.05),持油性分別為(3.28±0.11)g/g和(1.52±0.14)g/g。這可能是由于提取過程中的復(fù)合酶提高了IDF和油脂之間的接觸面積,使其對(duì)油的保持能力增強(qiáng)。
在壓強(qiáng)、溫度保持恒定的情況下,待測(cè)樣品不斷吸水,體積不斷增加即為膨脹性。水膨脹性是衡量膳食纖維功能特性的重要指標(biāo)之一。黑果腺肋花楸IDF具有較高的膨脹能力,可歸因于其纖維密度低,且通過紅外光譜可以看出其支鏈含有極性基團(tuán)和糖醛酸基團(tuán)。由表 1可知,IDF的水膨脹能力為(3.15±0.08)mL/g,顯著高于AMP的水膨脹能力(P<0.05)。結(jié)果表明,復(fù)合酶法提取可以使黑果腺肋花楸的功能特性增加,而這些功能特性在食品中有良好的應(yīng)用前景。
2.4.2 亞硝酸根離子吸附能力測(cè)定結(jié)果
IDF和AMP的亞硝酸根離子吸附能力如圖4所示。
圖4 IDF和AMP的亞硝酸根離子吸附能力Fig.4 Nitrite ion adsorption capacity of IDF and AMP
硝酸鹽和亞硝酸鹽廣泛存在于人體環(huán)境中,是自然界中最常見的含氮類化合物。人體內(nèi)硝酸鹽在胃酸作用下可被還原為亞硝酸鹽、N-亞硝基化合物的前體物質(zhì)。內(nèi)源性亞硝化條件下攝入的硝酸鹽或亞硝酸鹽被列入2A類致癌物清單[21]。從圖4可以看出,IDF在pH2.0環(huán)境下的NIAC比pH7.0環(huán)境下有所增加,說明膳食纖維對(duì)NO2-的吸附發(fā)生在胃中,腸中基本不吸附NO2-。pH2.0時(shí),IDF的亞硝根離子吸附能力(51.20±0.12)mg/g顯著高于 AMP 的(40.10±0.23)mg/g(P<0.05),表明復(fù)合復(fù)合酶法提取的膳食纖維對(duì)NO2-表現(xiàn)出更好的吸附作用,但仍低于采用微波方法提取的葡萄柚子的IDF亞硝酸根離子吸附量[(219.43±0.02)mg/g][17],因此,研究不同提取方法之間吸附能力的差異具有重要意義。而Dong等[22]研究表明,膳食纖維對(duì)亞硝酸鹽吸附效果是通過分子上的-OH和NO2-形成“膳食纖維-NO2-”絡(luò)合物來實(shí)現(xiàn)NO2-的去除,堿性條件下該絡(luò)合物解離,并隨糞便排出。
2.4.3 葡萄糖吸附能力測(cè)定結(jié)果
圖5為IDF和AMP的葡萄糖吸附能力。
圖5 IDF和AMP的葡萄糖吸附能力Fig.5 Glucose adsorption capacity of IDF and AMP
研究發(fā)現(xiàn),IDF含量較高的食物,如綠藻、竹筍等,可以延緩或減少消化道對(duì)葡萄糖的吸收,具有較好的降血糖能力[23]。因此,吸附葡萄糖也是IDF的一個(gè)重要功能性質(zhì)。由圖5可知,IDF和AMP對(duì)葡萄糖均有吸附效果,并且吸附量隨葡萄糖濃度的增加而增加,IDF的吸附效果分別為(1.54±0.12)、(1.97±0.13)mmol/g和(2.88±0.15)mmol/g,對(duì)比發(fā)現(xiàn)酶解作用使吸附葡萄糖的能力顯著增強(qiáng)(P<0.05),這可能是因?yàn)閺?fù)合酶對(duì)部分細(xì)胞壁的降解作用,使纖維結(jié)構(gòu)變得疏松、溶脹,暴露出更多的功能基團(tuán),溶質(zhì)分子更容易進(jìn)入纖維內(nèi)部,膳食纖維與葡萄糖分子間和分子內(nèi)作用力(如范德華力和氫鍵等)的相互作用增強(qiáng),能夠吸附更多的葡萄糖分子。結(jié)果表明,IDF能夠吸附葡萄糖從而減少或降低葡萄糖在體內(nèi)的吸收速率,因此,其可以有效緩解糖尿病人對(duì)葡萄糖的吸收速率,控制血糖的上升。
本研究采用復(fù)合酶法提取黑果腺肋花楸膳食纖維,并對(duì)其組成和功能特性進(jìn)行表征。結(jié)果表明,提取方法不僅影響IDF的結(jié)構(gòu)特征,還影響其功能特性。采用復(fù)合酶法提取的黑果腺肋花楸IDF的質(zhì)量有了很大的提高,在功能食品工業(yè)中具有較大的應(yīng)用潛力,值得進(jìn)一步研究。綜上,對(duì)黑果腺肋花楸IDF的單糖組成進(jìn)行研究,不僅反映了復(fù)合酶法對(duì)細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的影響,也從多糖結(jié)構(gòu)的角度揭示黑果腺肋花楸膳食纖維具有保健功能特征,為活性物質(zhì)資源的開發(fā)、利用提供新的重要信息。