鄭文煒,沈洋,許舒瑜,林錦德,褚克丹,許文,徐偉
1.福建中醫(yī)藥大學(xué)生物醫(yī)藥研發(fā)中心,福建 福州 350122;2.福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,福建 福州 350122;3.中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第900醫(yī)院,福建 福州 350002;4.安溪縣中醫(yī)院,福建 安溪362400
自2018年國家中醫(yī)藥管理局發(fā)布《古代經(jīng)典名方目錄(第一批)》以來,經(jīng)典古方、現(xiàn)代臨床經(jīng)驗方與民間驗方向中藥新藥轉(zhuǎn)化成為研究熱點(diǎn)[1]。百解方是安溪縣中醫(yī)院在柴胡桂枝湯、龍骨牡蠣湯加減基礎(chǔ)上,配伍厚樸、酸棗仁、合歡皮、紫蘇梗研制而成的經(jīng)驗方,由柴胡、黃芩、白芍等9味藥組成,臨床主要用于肝之疏泄功能異常引起的焦慮、抑郁、失眠障礙等,具有疏解、理氣、安神功效。百解方為傳統(tǒng)水煎劑,存在煎煮費(fèi)時、服用量不穩(wěn)定、易變質(zhì)等缺點(diǎn)[2],為方便使用、減少服藥劑量,擬將其改為合劑。
提取工藝研究是保證中藥復(fù)方制劑臨床療效的重要環(huán)節(jié),而評價指標(biāo)的選擇是工藝優(yōu)化的關(guān)鍵,中藥復(fù)方以中醫(yī)藥理論為指導(dǎo),遵循“君臣佐使”配伍原則,因此,評價指標(biāo)的選擇應(yīng)盡可能考慮“多成分”并與復(fù)方“君臣佐使”屬性相聯(lián)系。因中藥復(fù)方成分復(fù)雜,采用傳統(tǒng)色譜法進(jìn)行多成分分析難度大、效率低。超高效液相色譜串聯(lián)三重四級桿質(zhì)譜法(UPLCMS/MS)因具有高靈敏度、高分辨率、高效等優(yōu)點(diǎn),已成為中藥復(fù)雜體系的重要分析技術(shù)。為確保百解方經(jīng)提取后能維持穩(wěn)定的藥效,本試驗采用正交試驗設(shè)計,以加水量、提取時間、提取次數(shù)為考察因素,以全方得膏率及方中各味藥在2020年版《中華人民共和國藥典》(以下簡稱《中國藥典》)的13種指標(biāo)性成分為評價指標(biāo),并建立UPLC-MS/MS同時測定13種成分含量的方法,結(jié)合主觀與客觀組合賦權(quán)法即G1-熵權(quán)法進(jìn)行加權(quán)綜合評分,優(yōu)化百解方提取工藝,為該制劑的進(jìn)一步開發(fā)利用與質(zhì)量控制奠定基礎(chǔ)。
ACQUITYUPLCI-Class超高效液相色譜儀(美國Waters 公司),Xevo TQS 三重四極桿質(zhì)譜儀(美國Waters公司),CPA225D十萬分之一分析天平(德國Sartorius公司),KQ-500DE臺式超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司),Milli-Q 超純水儀(美國Millipore公司),RV-10旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(廣州IKA有限公司),5810R離心機(jī)(德國Eppendorf公司)。
柴胡、黃芩、白芍、合歡皮、酸棗仁、紫蘇梗、干姜、厚樸飲片,安徽聚草中藥飲片有限公司,批號分別為200601、200301、200701、200522、200611、200512、190301、200321;甘草片,亳州市永剛飲片廠有限公司,批號200613。以上9味藥經(jīng)福建中醫(yī)藥大學(xué)藥用植物實驗室范世明高級實驗師鑒定,符合2020年版《中國藥典》(一部)規(guī)定,樣本存放于福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院標(biāo)本室。對照品柴胡皂苷A(批號110777-201912)、柴胡皂苷D(批號110778-201912)、芍藥苷(批號110736-201842)、黃芩苷(批號110715-201720)、(-)-丁香樹脂酚-4-O-β-D-呋喃芹糖基-(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖苷(批號111911-201804)、迷迭香酸(批號111871-201505)、酸棗仁皂苷A(批號110734-201914)、斯皮諾素(批號111869-202005)、和厚樸酚(批號110730-201915)、厚樸酚(批號110729-202015)、甘草苷(批號11610-201908)、甘草酸(批號110731-201619)、6-姜辣素(批號111833-202007),中國食品藥品檢定研究院。甲醇、乙腈、水(質(zhì)譜純,德國默克公司),甲酸(色譜純,阿拉丁試劑上海有限公司),其余試劑均為分析純。
2.1.1 色譜與質(zhì)譜條件
色譜條件:采用CORTECS C18色譜柱(2.1 mm×100 mm,1.6 μm),流動相為乙腈(A)-0.1%甲酸水溶液(B),梯度洗脫(0~2 min,20%A;2~4 min,20%A→60%A;4~5.5 min,60%A→84%A;5.5~5.6 min,84%A→90%A;5.6~7.0 min,20%A),流速0.25 mL/min,柱溫45 ℃,進(jìn)樣量2 μL。
質(zhì)譜條件:采用正負(fù)離子多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式;毛細(xì)管電壓3.50 kV;脫溶劑氣氮?dú)猓w積流量800 L/h,溫度500 ℃;錐孔氣流N2為50 L/h,體積流量150 L/h;離子源溫度150 ℃,二級錐孔萃取電壓3.00 V,碰撞氣為氬氣。各成分質(zhì)譜參數(shù)及來源見表1,色譜圖見圖1。
圖1 百解合劑中13種成分UPLC-MS/MS色譜圖
表1 百解合劑中13種成分質(zhì)譜參數(shù)及來源
2.1.2 供試品溶液制備
稱取百解合劑1/5處方量飲片共27 g,在設(shè)計的提取工藝條件下進(jìn)行煎煮,將水煎液濃縮定容至250 mL,精密移取濃縮液1 mL于100 mL量瓶中,加入20%甲醇溶解并定容至刻度,搖勻,10 000 r/min離心10 min,取上清液,用0.22 μm濾膜過濾,即得。
2.1.3 對照品溶液制備
精密稱取芍藥苷、斯皮諾素、甘草苷、(-)-丁香樹脂酚-4-O-β-D-呋喃芹糖基-(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖苷、迷迭香酸、黃芩苷、甘草酸、酸棗仁皂苷A、柴胡皂苷A、6-姜辣素、柴胡皂苷D、和厚樸酚、厚樸酚對照品,用甲醇溶解制備成濃度分別為1.397、0.741、1.468、0.847、0.457、2.538、1.606、0.187、1.049、0.566、0.359、0.254、0.360 mg/mL的單一對照品貯備液,精密量取適量,用20%甲醇稀釋,得芍藥苷、斯皮諾素、甘草苷、(-)-丁香樹脂酚-4-O-β-D-呋喃芹糖基-(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖苷、迷迭香酸、黃芩苷、甘草酸、酸棗仁皂苷A、柴胡皂苷A、6-姜辣素、柴胡皂苷D、和厚樸酚、厚樸酚混合對照品溶液,其濃度依次為27.94、1.482、5.872、2.118、2.285、126.9、32.12、0.374 0、5.245、11.32、0.898、2.540、3.600 μg/mL,稀釋,制得不同濃度的混合對照品溶液。
2.1.4 線性關(guān)系考察
分別精密吸取“2.1.3”項下混合對照品溶液0.2、0.5、1、2、5、8、10 mL,置100 mL量瓶中,加20%甲醇定容至刻度,稀釋配制為梯度濃度的混合溶液,按“2.1.1”項下條件進(jìn)樣測定。以峰面積對待測成分濃度進(jìn)行線性回歸,分別繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到回歸方程和相關(guān)系數(shù)(r),并且逐一稀釋分析物濃度,以信噪比S/N≈3為檢測限、S/N≈10為定量限,結(jié)果見表2。
表2 13種成分線性關(guān)系考察結(jié)果
2.1.5 精密度試驗
取“2.1.3”項下混合對照品溶液,按“2.1.1”項下條件1 d內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣6次及連續(xù)3 d重復(fù)進(jìn)樣(每日重復(fù)進(jìn)樣3次)測定,記錄峰面積,分別計算峰面積比的RSD。結(jié)果13種成分日內(nèi)精密度RSD為2.2%~3.9%,日間精密度RSD 為1.5%~3.9%,表明儀器精密度良好。
2.1.6 穩(wěn)定性試驗
取“2.1.2”項下供試品溶液適量,于0、2、4、8、12、24 h按“2.1.1”項下條件進(jìn)樣測定,記錄峰面積,計算RSD。結(jié)果13種成分RSD為2.5%~4.5%,表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。
2.1.7 重復(fù)性試驗
精密量取同一份提取濃縮液樣品1 mL,按“2.1.2”項下方法平行制備6份,按“2.1.1”項下條件進(jìn)樣測定,記錄峰面積,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算各成分濃度,計算RSD。結(jié)果13種成分RSD為2.5%~4.1%,表明該方法重復(fù)性良好。
2.1.8 加樣回收率試驗
精密吸取6份“2.1.7”項下已知含量的百解合劑水煎濃縮液樣品0.5 mL,按重復(fù)性試驗含量結(jié)果近似1∶1比例分別加入13種成分對照品,按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液,按“2.1.1”項下條件進(jìn)樣測定,記錄峰面積,代入標(biāo)準(zhǔn)曲線,計算待測成分含量,計算回收率及RSD,結(jié)果見表3。
表3 13種成分加樣回收率試驗(n=6)
2.1.9 樣品測定
取“2.1.2”項下供試品溶液,按“2.1.1”項下條件進(jìn)樣分析,記錄13 種成分色譜峰面積,分別代入“2.1.4”項下回歸方程計算各成分濃度,并計算其在百解合劑處方量中的含量。
分別取柴胡、黃芩、白芍、合歡皮、酸棗仁、紫蘇梗、厚樸、干姜、甘草飲片,按2020年版《中國藥典》各藥含量測定項下的供試品溶液制備方法,用50%甲醇將提取液稀釋適當(dāng)倍數(shù),按“2.1.1”項下條件測定13種成分含量,平行3份,結(jié)果柴胡皂苷A、柴胡皂苷D、黃芩苷、芍藥苷、(-)-丁香樹脂酚-4-O-β-D-呋喃芹糖基-(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖苷、斯諾皮素、酸棗仁皂苷A、迷迭香酸、厚樸酚、和厚樸酚、甘草苷、甘草酸、6-姜辣素含量分別為3.326、0.227 4、111.3、16.27、0.882 0、1.045、0.387 0、2.905、12.28、4.946、8.438、32.85、10.73 mg/g,均符合藥典規(guī)定,數(shù)據(jù)用于轉(zhuǎn)移率的計算。
精密吸取“2.1.2”項下提取液25 mL,經(jīng)過濾離心后置于經(jīng)恒重的蒸發(fā)皿中,70 ℃水浴濃縮至稠浸膏后于70 ℃真空干燥至恒重,在干燥器中冷卻后迅速稱定干膏質(zhì)量,計算得膏率,得膏率(%)=[(干膏質(zhì)量×提取液總體積)÷(25×飲片總質(zhì)量)]×100%。
2.4.1 G1法主觀賦權(quán)
確定各指標(biāo)序關(guān)系,設(shè)rk為wk-1與wk的重要程度之比[3],wk-1=rkwk,且(k=m,m-1,…,2),計算權(quán)重系數(shù)wk,wk=。
2.4.2 熵權(quán)法客觀賦權(quán)
首先對數(shù)據(jù)矩陣歸一化,設(shè)m個評價指標(biāo),n個評價對象,rij=,且(i=1,2,…,n;j=1,2,…,m);再求各指標(biāo)熵值,fij=rij/,當(dāng)(fij=0時,yijlnn=0);k=1/lnn;sj=;最后計算各指標(biāo)權(quán)重系數(shù),wj=(1-sj)/[4]。
2.4.3 組合權(quán)重計算
設(shè)w1為G1法得到的主觀權(quán)重值,w2為熵權(quán)法得到的客觀權(quán)重值,wj為組合權(quán)重,則wj=w1jw2j/[5]。
在單因素試驗基礎(chǔ)上,確定飲片浸泡時間為2 h,正交試驗以加水量(A)、提取時間(B)、提取次數(shù)(C)為考察因素,每因素3個水平,因素水平見表4,采用L9(34)正交表進(jìn)行百解合劑水提工藝研究。
表4 百解合劑提取工藝正交試驗因素與水平
根據(jù)復(fù)方“君臣佐使”配伍原則,結(jié)合方中各味藥的指標(biāo)成分含量與得膏率為評價指標(biāo),G1法權(quán)重評價標(biāo)度分別為r2=1.5、r3=1.2、r4=1、r5=1.2、r6=1、r7=1、r8=1、r9=1.2、r10=1;各指標(biāo)的順序依次為:得膏率(X1,源于全方)>柴胡皂苷A、柴胡皂苷D(X2,二者含量之和源于君藥柴胡)>黃芩苷(X3,源于臣藥黃芩)=芍藥苷(X4,源于臣藥白芍)>(-)-丁香樹脂酚-4-O-β-D-呋喃芹糖基-(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖苷(X5,源于佐藥合歡皮)=斯皮諾素、酸棗仁皂苷A(X6,二者含量之和源于佐藥酸棗仁)=迷迭香酸(X7,源于佐藥紫蘇梗)=厚樸酚、和厚樸酚(X8,二者含量之和源于佐藥厚樸)>甘草酸、甘草苷(X9,二者含量之和源于使藥甘草)=6-姜辣素(X10,源于使藥干姜)。按“2.4.1”項下G1法公式計算求得各評價指標(biāo)的主觀權(quán)重值(w1),利用正交試驗不同條件下得到的數(shù)據(jù)在“2.4.2”項下熵權(quán)法計算得到各評價指標(biāo)的客觀賦權(quán)值(w2),由“2.4.3”項下公式計算得到各評價指標(biāo)的組合權(quán)重(w3),結(jié)果見表5。按公式計算正交試驗綜合評分Pj,Pj=,結(jié)果見表6。采用SPSS26.0軟件對綜合評分進(jìn)行方差分析,見表7。由直觀分析可以看出,各因素對提取效果的影響依次為B>A>C,其中B3>B2>B1,A1>A2>A3,C2>C3>C1。根據(jù)方差分析可知,各因素在α=0.05水平對綜合評分均無顯著影響。故選取3個因素較高水平的組合B3A1C2作為最優(yōu)提取工藝,即飲片加10倍量水,浸泡2 h,提取2次,每次2.5 h。
表5 百解合劑提取工藝評價指標(biāo)權(quán)重
表6 百解合劑正交試驗結(jié)果
表7 百解合劑正交試驗方差分析
取百解合劑2倍處方量飲片270 g,稱取3份,編號1~3,采用優(yōu)選的條件進(jìn)行回流提取,測定得膏率及13種成分含量,按“2.2”項下含量計算轉(zhuǎn)移率,結(jié)果見表8,表明工藝參數(shù)穩(wěn)定性良好,該工藝可行。
表8 百解合劑提取工藝驗證試驗結(jié)果
百解合劑臨床主要用于治療因肝氣郁結(jié)所致焦慮、抑郁、睡眠障礙。研究表明,柴胡皂苷A可抑制神經(jīng)元細(xì)胞凋亡改善大鼠的抑郁樣行為[6],柴胡皂苷D能通過抗炎發(fā)揮抗抑郁作用[7];芍藥苷對小鼠具有明顯的抗抑郁及神經(jīng)保護(hù)作用[8];黃芩苷具有抗焦慮作用[9];(-)-丁香樹脂酚-4-O-β-D-呋喃芹糖基-(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖苷是合歡皮起抗焦慮作用的重要成分[10];酸棗仁中皂苷類成分能抑制小鼠的中樞神經(jīng),減少小鼠抑郁行為次數(shù),起到鎮(zhèn)靜催眠作用[11];紫蘇梗中的迷迭香酸能抗抑郁和抗焦慮;和厚樸酚與厚樸酚具有抗抑郁作用[12];甘草苷能改善大鼠的精神狀態(tài)與自主探索的能力[13],甘草酸能有效地改善認(rèn)知損害和睡眠障礙[14];6-姜辣素也具有治療失眠作用[15];因此選擇上述13種成分作為工藝優(yōu)化的考察指標(biāo)。
本研究采用G1-熵權(quán)混合加權(quán)法對評價指標(biāo)進(jìn)行權(quán)重分配,其中G1法為主觀賦權(quán)法,評價人員可根據(jù)復(fù)方的配伍規(guī)律對各指標(biāo)予以量化進(jìn)行排序,計算得到各評價指標(biāo)的主觀權(quán)重系數(shù),但因G1法主觀性較強(qiáng),常忽略客觀數(shù)據(jù)的信息特點(diǎn),所以結(jié)合客觀賦權(quán)熵權(quán)法計算各評價指標(biāo)的客觀權(quán)重系數(shù),最后經(jīng)組合賦權(quán)得到組合權(quán)重系數(shù),該法可使多指標(biāo)評價權(quán)重賦值更加客觀科學(xué)。
本研究在單因素試驗考察藥材飲片的浸泡時間、加水量、提取時間和提取次數(shù)基礎(chǔ)上,以加水量、提取時間和提取次數(shù)三因素進(jìn)行正交試驗優(yōu)化提取工藝,其中三因素順序分別為10倍>12倍>15倍、2.5 h>2 h>1.5 h,2次>3次>1次??赡苡捎?次試驗條件各不相同,隨著溶劑用量與提取次數(shù)增加,所得提取液的體積增大,使制劑濃縮時間加長,導(dǎo)致某些成分被破壞,有文獻(xiàn)報道柴胡皂苷A與柴胡皂苷D[16]、厚樸酚與和厚樸酚[17]、黃芩苷[18]、芍藥苷[19]等在水煎液中熱不穩(wěn)定,易發(fā)生降解;另外,在中藥復(fù)方提取過程中,“君臣佐使”配伍屬性使藥物成分在煎煮時存在動態(tài)變化,多次煎煮可能導(dǎo)致化學(xué)成分在水煎液中的溶出發(fā)生相互促進(jìn)或抑制效應(yīng),如課題組研究發(fā)現(xiàn)天花粉對栝樓桂枝湯中芍藥苷、甘草酸等9種成分在湯劑的溶出有影響[20]。
綜上,本研究采用正交設(shè)計聯(lián)合UPLC-MS/MS測定多指標(biāo)綜合評分法優(yōu)選百解合劑的提取工藝,最終得到最佳提取工藝為飲片加10倍量水浸泡2 h,煎煮2次,每次2.5 h,該工藝穩(wěn)定、可行,可為其制劑或新藥開發(fā)提供依據(jù)。
致謝:本項目在福建省科技廳重點(diǎn)實驗室、福建省中藥資源研究與開發(fā)利用重點(diǎn)實驗室完成。