方佳鈺,黃紅葉,王曉華,陳水金,江煜,陳樂春,張幻真,陳進(jìn)城,林志剛
1.福建中醫(yī)藥大學(xué),福建 福州 350100;2.福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬康復(fù)醫(yī)院,福建 福州 350003;3.福建省康復(fù)技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,福建 福州350003
潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis,UC)是一種病因不明的慢性非特異性腸道炎癥性疾病,是引起腹痛、腹瀉的臨床常見病之一,屬現(xiàn)代難治性疾病[1-2]。腹部推拿治療UC效果顯著,能改善腹瀉、便血、腹痛等癥狀,具有安全、無不良反應(yīng)等優(yōu)勢(shì)[3-5],但其作用機(jī)制尚不明確。研究表明,脊髓背角蛋白激酶B(AKT)能通過磷酸化調(diào)控UC發(fā)生發(fā)展[6]。本實(shí)驗(yàn)通過觀察腹部推拿對(duì)UC 模型大鼠腸道炎癥及脊髓背角AKT、p-AKT表達(dá)的影響,探討腹部推拿治療UC的潛在作用機(jī)制。
SPF級(jí)雄性SD大鼠50只,體質(zhì)量150~160 g,上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供,動(dòng)物許可證號(hào)SCXK(滬)2017-0005。飼養(yǎng)于福建中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心,溫度20~26 ℃,相對(duì)濕度45%,12 h明暗交替,自由攝食飲水。實(shí)驗(yàn)過程嚴(yán)格遵守動(dòng)物倫理原則,并經(jīng)福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(FJTCM IACUC 2021046)。
AKT抗體、p-AKT抗體、HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG(南京Bioworld公司,貨號(hào)分別為BS1810、BS4007、BS13278),美沙拉嗪片(佳木斯鹿靈制藥有限公司,批號(hào)210907),HE染色試劑盒(北京索萊寶科技有限公司,貨號(hào)G1120)。自制大鼠腹部推拿固定器(專利號(hào)ZL201821139321.X),AVANTI J-15R型高速冷凍離心機(jī)(美國Beckman公司),Tetra型垂直電泳槽(美國Bio-Rad公司),Gene Pulser Xcell型電轉(zhuǎn)儀(美國Bio-Rad公司),Gel Doc XR+型凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司),Gel Doc EZ型成像及分析軟件(美國Bio-Rad公司)。
大鼠單籠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d,按隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組、模型組、推拿組和美沙拉嗪組,正常組11只,其余每組13只。參照Poulsen[7]方法,采用5%葡聚糖硫酸鈉溶液(避光配制)自由飲用7 d誘導(dǎo)UC大鼠模型,正常組飲用蒸餾水。
推拿組造模第2日開始進(jìn)行腹部推拿干預(yù),干預(yù)前將大鼠置于自制腹部推拿固定器10 min適應(yīng)環(huán)境。操作者左手置于腹部推拿固定器尾端,防止大鼠向后退離,右手食指進(jìn)行摩腹手法操作(見圖1),將食指指腹置于“關(guān)元”,按“關(guān)元-帶脈(右)-鳩尾-帶脈(左)”順序[8-9]做逆時(shí)針節(jié)律性推拿,頻率120次/min,每次10 min,每日1次,共15次。推拿結(jié)束后大鼠單獨(dú)靜置1 min。美沙拉嗪組造模第2日起予0.035 g/mL美沙拉嗪藥液灌胃,給藥體積2 mL/100 g,連續(xù)15 d。正常組和模型組大鼠俯臥位束縛于固定器中10 min,不予腹部推拿治療。
圖1 大鼠腹部推拿演示
每日觀察大鼠精神狀態(tài)、毛發(fā)色澤、糞便改變情況等。
第1、3、6、9、11、14、16日,參照文獻(xiàn)[10]進(jìn)行疾病活動(dòng)指數(shù)(DAI)評(píng)分,包括體質(zhì)量減輕程度、糞便性狀、糞便隱血情況。DAI評(píng)分=(體質(zhì)量下降評(píng)分+糞便性狀評(píng)分+糞便隱血評(píng)分)÷3。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見表1。
表1 DAI評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)
實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,大鼠腹腔注射1.25 g/kg烏拉坦麻醉后,頸椎脫臼處死,取距肛門5~8 cm處結(jié)腸組織,生理鹽水沖洗,置于10%中性福爾馬林溶液中固定,經(jīng)脫水、石蠟包埋、切片(厚度4 μm)后,常規(guī)HE染色,中性樹膠封片,顯微鏡下觀察結(jié)腸組織病理變化。
取脊髓背角,加入裂解液(組織∶裂解液=1∶12.5),冰上裂解30 min,超聲勻漿,4 ℃、14 000 r/min離心15 min,取上清液,BCA 試劑盒測(cè)定蛋白濃度。經(jīng)10%SDS-PAGE后,將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜,使用5%脫脂牛奶常溫封閉1 h,分別加入AKT一抗(1∶500)、p-AKT 一抗(1∶500),4 ℃孵育過夜。TBST 洗膜,加入HRP標(biāo)記二抗,常溫孵育1 h,采用ECL發(fā)光試劑顯影,凝膠成像系統(tǒng)成像,用Image Lab軟件對(duì)蛋白條帶進(jìn)行灰度分析。
實(shí)驗(yàn)過程中,模型組大鼠因服用葡聚糖硫酸鈉溶液造模致長(zhǎng)期嚴(yán)重腹瀉死亡2只,美沙拉嗪組大鼠死亡2只,可能是美沙拉嗪的不良反應(yīng)導(dǎo)致,空白組和推拿組均無死亡。
正常組大鼠活潑喜動(dòng),皮毛順滑光亮,形體勻稱豐盈,大便為深褐色顆粒狀,無便隱血,肛周清潔,體質(zhì)量穩(wěn)步增加,狀態(tài)良好;模型組大鼠倦怠少動(dòng),皮毛黯淡干枯,形體瘦削,縮背扎堆,糞便稀溏,可見膿血,肛周污穢黏膩,體質(zhì)量緩慢增長(zhǎng)甚至下降,狀態(tài)萎靡;推拿組大鼠整體狀態(tài)逐漸向好,皮毛光澤恢復(fù),無膿血便,肛周較清潔,活躍多動(dòng);美沙拉嗪組大鼠狀態(tài)逐漸恢復(fù),皮毛光澤度有所改善,但毛發(fā)顏色整體發(fā)黃。見圖2。
圖2 各組大鼠一般情況示例
與正常組比較,模型組大鼠第3日起DAI評(píng)分明顯升高(P<0.05);與模型組比較,推拿組和美沙拉嗪組大鼠第9日起DAI評(píng)分明顯降低(P<0.05)。見表2。
表2 各組大鼠DAI評(píng)分比較(,分)
表2 各組大鼠DAI評(píng)分比較(,分)
注:與正常組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05
正常組大鼠結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞完整、排列整齊,杯狀細(xì)胞豐富,無充血、水腫,腺體結(jié)構(gòu)完整,無潰瘍形成,無炎性細(xì)胞浸潤;模型組大鼠結(jié)腸上皮細(xì)胞破損、排列紊亂,黏膜充血、水腫,腺體破壞,杯狀細(xì)胞明顯減少,伴大量炎性細(xì)胞浸潤,部分區(qū)域有潰瘍形成,部分出現(xiàn)增厚黏連,腸管變形;推拿組和美沙拉嗪組大鼠結(jié)腸組織病變有不同程度改善,黏膜上皮損傷有所修復(fù),充血、水腫明顯減輕,腺體、杯狀細(xì)胞增多,排列較整齊,炎性細(xì)胞浸潤明顯減少。見圖3。
圖3 各組大鼠結(jié)腸組織形態(tài)(HE染色,×100)
與正常組比較,模型組大鼠脊髓背角p-AKT蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.05);與模型組比較,推拿組和美沙拉嗪組大鼠脊髓背角p-AKT蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05)。各組大鼠AKT蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果見圖4、圖5。
圖4 各組大鼠脊髓背角AKT、p-AKT蛋白免疫印跡
圖5 各組大鼠脊髓背角AKT、p-AKT蛋白表達(dá)比較(,每組6只)
UC 屬中醫(yī)學(xué)“腸澼”“泄瀉”“痢疾”等范疇。《素問·太陰陽明論篇》有“食飲不節(jié),起居不時(shí)者,陰受之……陰受之則入五藏……入五藏則?滿閉塞,下為飧泄,久為腸澼”,指出UC的主要病因是飲食沒有節(jié)制,作息不規(guī)律。中醫(yī)認(rèn)為,中焦為人體氣機(jī)樞紐,是后天之本。中焦氣機(jī)通暢,升清降濁,則上下臟腑得以溝通,人體得以康健,正氣存內(nèi),邪不可干[11]。本實(shí)驗(yàn)采用腹部推拿手法主要為水平方向的腹部摩法,《摩腹運(yùn)氣圖考》記載:“摩腹之法,能通和上下,分理陰陽,去舊生新,補(bǔ)不足,瀉有余?!笨梢娔Ω咕哂星迥c溫中補(bǔ)虛的作用,通過該手法的調(diào)理,能達(dá)到通腑瀉濁的目的。目前,推拿已應(yīng)用于UC的治療,能有效改善患者腹瀉、腹痛癥狀[3]。
本實(shí)驗(yàn)以大鼠為研究對(duì)象,以腹部推拿為干預(yù)手法。臨床腹部推拿多以掌面為干預(yù)接觸面,但因大鼠身體和肢爪較小,故本實(shí)驗(yàn)在干預(yù)時(shí)以食指指腹模擬臨床,便于進(jìn)行推拿手法的操作。
DAI評(píng)分結(jié)果顯示,腹部推拿能有效改善UC模型大鼠腹瀉、便血等癥狀,表明腹部推拿手法對(duì)模型大鼠已受損的腸道功能有一定恢復(fù)作用。且推拿組DAI評(píng)分與美沙拉嗪組無顯著差異。在大鼠飼養(yǎng)和糞便采集過程中發(fā)現(xiàn),美沙拉嗪組大鼠毛發(fā)發(fā)黃,進(jìn)行便隱血試紙檢測(cè)時(shí)試紙出現(xiàn)棕褐色黃染情況,可能是美沙拉嗪藥物的不良反應(yīng)所致。且在實(shí)驗(yàn)過程中推拿組大鼠無死亡情況,美沙拉嗪組大鼠有2只死亡,可見腹部推拿具有安全、無不良反應(yīng)的優(yōu)勢(shì)。HE染色結(jié)果也顯示,模型大鼠結(jié)腸上皮細(xì)胞破損,黏膜充血、水腫,有大量炎癥細(xì)胞浸潤及潰瘍形成。推拿組大鼠結(jié)腸黏膜損傷明顯減輕,炎性細(xì)胞浸潤有所減少,說明腹部推拿治療能改善大鼠結(jié)腸組織病理損傷。
當(dāng)結(jié)腸受到炎癥刺激時(shí),脊髓內(nèi)的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)如腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子、P物質(zhì)等從初級(jí)傳入神經(jīng)元集中釋放到脊髓背角,并與各自受體結(jié)合,促進(jìn)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),最終導(dǎo)致內(nèi)臟高敏感[12]。AKT是一種絲/蘇氨酸蛋白激酶,可通過催化自身絲氨酸473(Ser473)和蘇氨酸(Thr308)位點(diǎn)的磷酸化而被激活,只有在這2個(gè)位點(diǎn)磷酸化后,AKT才能被充分激活[13]。研究發(fā)現(xiàn),AKT活化與UC發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),電針能通過抑制AKT磷酸化緩解UC大鼠腸道癥狀[14]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),結(jié)腸炎癥發(fā)生后,脊髓背角AKT被激活,從而介導(dǎo)后續(xù)一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng),調(diào)控結(jié)腸炎的發(fā)生發(fā)展[6]。本研究結(jié)果顯示,模型組大鼠脊髓背角p-AKT蛋白表達(dá)明顯升高,與上述研究結(jié)果[6]一致。經(jīng)腹部推拿干預(yù)后,脊髓背角p-AKT蛋白表達(dá)明顯降低,表明腹部推拿能抑制模型大鼠脊髓背角AKT磷酸化,從而減輕炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)。
綜上,腹部推拿能改善UC模型大鼠腹瀉、便血等腸道炎癥癥狀,并可能通過抑制脊髓背角AKT磷酸化發(fā)揮抑制腸道炎癥作用,其通過哪些途徑調(diào)控AKT及具體作用靶點(diǎn)有待后續(xù)進(jìn)一步研究。