蔥蘭夜蛾雌蛾求偶行為節(jié)律觀察與性信息素鑒定

胡可炎, 苑鵬宇, 錢沉魚, 賈彩娟, 楊文娟,劉春燕, 溫秀軍,*, 馬 濤,*

(1. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)與風(fēng)景園林學(xué)院, 廣州 510642; 2. 深圳市梧桐山風(fēng)景區(qū)管理處, 深圳 518004;3. 深圳市廣信建設(shè)工程有限公司, 深圳 518000; 4. 廣東省森林資源保育中心, 廣州 510130)

蔥蘭夜蛾Brithyscrini屬于鱗翅目(Lepidoptera)夜蛾科(Noctuidae),國外主要分布于印度、緬甸、斯里蘭卡和日本等,國內(nèi)主要分布在上海、江西、汕頭、深圳等地(李新巾等, 2005)。該蟲以幼蟲進(jìn)行危害,發(fā)生范圍廣,可取食寄主植物花、莖、葉等,造成其葉片糜爛,植株倒伏,影響植物生長,主要危害蔥蘭Zephyranthescandida、水鬼蕉Hymenocallislittoralis、文殊蘭Crinumasiaticum等石蒜科植物(于煒等, 2009)。蔥蘭夜蛾老熟幼蟲主要在寄主植物葉片之間或地表淺土層做蛹室化蛹;成蟲主要在白天羽化,羽化后無需補(bǔ)充營養(yǎng)也能交尾、產(chǎn)卵,白天隱藏在寄主植物葉背或草地的雜草間,夜間活動(dòng)(李新巾等, 2005; 涂小云和陳元生, 2013)。近年來,隨著我國城市規(guī)模的快速發(fā)展,石蒜科植物在公園造景、城市綠地綠化中應(yīng)用日廣,蔥蘭夜蛾的發(fā)生范圍和危害程度亦隨之增加,故而該蟲的危害極大影響了石蒜科植物的觀賞價(jià)值。

目前防治蔥蘭夜蛾主要依靠化學(xué)防治和人工清理,但是噴灑化學(xué)農(nóng)藥容易造成環(huán)境污染,同時(shí)多次噴霧防治易造成害蟲抗藥性增強(qiáng)(朱佳虹等, 2014),且蔥蘭夜蛾的發(fā)生地主要集中在街道或者公園,更應(yīng)選擇高效低毒的綠色防控技術(shù)進(jìn)行生態(tài)調(diào)控。鱗翅目昆蟲性信息素因其高效專一、生態(tài)環(huán)保等優(yōu)勢(shì),作為一種新型綠色防控技術(shù),愈來愈受到廣泛關(guān)注,不論是監(jiān)測(cè)害蟲的發(fā)生動(dòng)態(tài),還是通過大量誘捕或干擾交配直接防控害蟲的危害,均可實(shí)現(xiàn)害蟲的無公害防治,具有廣闊的應(yīng)用前景和生態(tài)效益(馬濤等, 2018)。目前已有2 000多種害蟲的信息素得到鑒定,其中全球商品化的昆蟲信息素產(chǎn)品超過了600多個(gè),其中以鱗翅目昆蟲性信息素應(yīng)用最為廣泛(馬濤等, 2019; 吳帆等, 2023)。鱗翅目昆蟲性信息素主要成分為醇、醛、酯、酮、烷烴等化合物或衍生物, 按其化學(xué)結(jié)構(gòu)可分為4種類型: TypeⅠ, TypeⅡ, TypeⅢ和Type 0,其中約75%的已知性信息素屬于TypeⅠ類,結(jié)構(gòu)為C10-C18直鏈不飽和脂肪醇、醛、酯類化合物,夜蛾科昆蟲性信息素組分結(jié)構(gòu)多屬于Type Ⅰ類(董改娟等, 2008; Allisonetal., 2016; Yuvarajetal., 2017)。

關(guān)于蔥蘭夜蛾的研究主要集中于形態(tài)學(xué)特性和化學(xué)防治方法等方面(于煒等, 2009; 涂小云和陳元生, 2013),雖然此前已有日本學(xué)者對(duì)我國臺(tái)灣北部地區(qū)的蔥蘭夜蛾性信息素組分進(jìn)行了分析,但是缺乏相應(yīng)的觸角電位(electroantennogram, EAG)活性測(cè)試,所得到的性信息素組分是否與深圳地區(qū)的蔥蘭夜蛾存在地理種群差異,仍需進(jìn)一步研究(Kouetal., 1991)。因此,本研究首先對(duì)深圳地區(qū)蔥蘭夜蛾求偶行為節(jié)律進(jìn)行觀察研究,旨在準(zhǔn)確獲得處女雌蛾,然后對(duì)蔥蘭夜蛾雌蛾的性信息素進(jìn)行提取、定量及化學(xué)鑒定,進(jìn)而為利用性信息素監(jiān)測(cè)蔥蘭夜蛾的野外動(dòng)態(tài)及綠色調(diào)控提供可靠的技術(shù)參考和科學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試蟲源

實(shí)驗(yàn)蟲源采自深圳灣公園(22.48°N, 114.95°E)。養(yǎng)蟲室飼養(yǎng)條件具體如下:溫度26～28 ℃,相對(duì)濕度70%～80%,光周期12L∶12D,其中光期6:00-18:00,暗期18:00-6:00。每天清理老葉和蟲糞,更換新鮮的水鬼蕉葉片,將即將進(jìn)入預(yù)蛹狀態(tài)的幼蟲挑出,放到鋪有厚約5 cm濕潤沙土的塑料盒中(長×寬×高=29 cm×24 cm×11 cm)。觀察到有幼蟲化蛹后,每天將沙土中當(dāng)天產(chǎn)生的蛹移出,集中放置,并做好日期標(biāo)記。成蟲羽化后按性別和日齡分開飼養(yǎng)(從羽化到首個(gè)暗期結(jié)束為1日齡),每天飼喂?jié)舛葹?0%蜂蜜水用于補(bǔ)充營養(yǎng)。

1.2 性信息素標(biāo)準(zhǔn)化合物

實(shí)驗(yàn)所需的性信息素標(biāo)準(zhǔn)化合物Z11-16∶Ald和E11-16∶Ald,均由中捷四方生物科技股份有限公司提供,純度≥98%。

1.3 求偶行為觀察

求偶觀察實(shí)驗(yàn)的溫度、相對(duì)濕度和光暗周期等條件與1.1節(jié)的條件一致。通過預(yù)實(shí)驗(yàn)獲知蔥蘭夜蛾雄蛾無求偶行為,雌蛾求偶都在暗期內(nèi)進(jìn)行。因此, 將新羽化的處女雌蛾每頭單獨(dú)飼養(yǎng)。每天18:00進(jìn)入暗期后,使用紅光手電筒輔助觀察其求偶行為(手電筒用白色紗布包裹,以減弱光照亮度)。實(shí)驗(yàn)設(shè)置3組重復(fù),每組10頭雌蛾,共觀察30頭雌蛾。每頭蟲單獨(dú)飼養(yǎng)在500 mL透明塑料盒中(長×寬×高=12 cm×8 cm×7.8 cm),每隔0.5 h記錄1次求偶情況,直到當(dāng)天的全部雌蛾求偶結(jié)束為止。

1.4 性信息素的提取

選取正在求偶的處女雌蛾,放入-20 ℃冰箱中冷凍約3 min左右,取出輕壓雌蛾腹部,然后用眼科手術(shù)剪剪下伸出的性信息素腺體,之后用濾紙吸附掉腺體表面的體液,最后將其放入2 mL的色譜進(jìn)樣瓶,按照每腺體10 μL正己烷的規(guī)格向2 mL色譜進(jìn)樣瓶中加入適量的重蒸正己烷(圖1, 由于蔥蘭夜蛾雌蛾性信息素腺體體積較大, 加入足量的重蒸正己烷以保證將腺體完全浸沒)。在室溫下浸泡50 min后,用移液槍將浸泡液,轉(zhuǎn)移到另一個(gè)潔凈的色譜進(jìn)樣瓶中,使用N2濃縮至5 μL/FE [雌當(dāng)量(female equivalent, FE)],密封后保存在-20 ℃冰箱中備用。

圖1 蔥蘭夜蛾雌蛾求偶行為Fig. 1 Calling behavior of the female moth of Brithys crini箭頭示性信息素腺體的放大。The arrow indicates the magnification of sex pheromone gland.

1.5 性信息素腺體提取物的氣相色譜-觸角電位聯(lián)用儀(gas chromatography-electroantennagram detection, GC-EAD)分析

所用儀器為安捷倫公司7820A氣相色譜與德國Syntech觸角電位聯(lián)用儀(GC-EAD),FID信號(hào)為火焰離子化檢測(cè)器(flame ionization detector),不分流進(jìn)樣,進(jìn)樣量為1 μL。升溫程序如下:初始溫度50 ℃,保持1 min,然后以5 ℃/min的速率運(yùn)行40 min,上升到250 ℃后保持2 min。

選取1日齡蔥蘭夜蛾雄蛾,用眼科手術(shù)剪將其觸角剪下,剪取更接近端部的部分并用刀片切除觸角端部約0.5 mm,然后用導(dǎo)電膠分別將觸角兩端包裹住并連接在金屬電極上,而后將金屬電極插入EAG儀探頭中。手動(dòng)進(jìn)樣1 μL濃縮后的性信息素腺體浸提液。分析樣品的色譜柱為DB-5(30 m×250 μm×0.25 μm),出口端接Y型分流器(5181-3397, Agilent Technologies, 美國),使得氣相色譜柱分離的氣體成分被均勻地分成兩部分,一部分進(jìn)入火焰離子化檢測(cè)器產(chǎn)生氣相色譜的FID信號(hào),另一部分與清潔氣體混合后刺激觸角產(chǎn)生觸角電生理EAD信號(hào),記錄的信號(hào)經(jīng)氣流控制器(CS-55)連接到直流交流放大器(IDAC-2),再連接到計(jì)算機(jī)經(jīng)GC-EAD軟件同步記錄數(shù)據(jù)。

1.6 性信息素腺體提取物的氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(gas chromatography-mass spectrometry, GC-MS)分析

蔥蘭夜蛾性信息素腺體提取物鑒定在氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀7890A-5975C(Agilent Technologies, 美國)進(jìn)行,色譜柱與GC-EAD所用型號(hào)相同,無分流進(jìn)樣,進(jìn)樣量1 μL。升溫程序與GC-EAD分析時(shí)的設(shè)置一致。離子源溫度230 ℃,電離方式為EI,電離能量70 eV,載氣為He,流速1 mL/min,全掃描采集。

首先使用正己烷反復(fù)潤洗進(jìn)樣針,吸取1 μL重蒸正己烷進(jìn)樣作為空白,待空白樣品分析完后,吸取1 μL性信息素腺體提取物進(jìn)樣分析。通過上述GC-EAD圖譜獲知引起雄蛾觸角反應(yīng)的峰形和保留時(shí)間(retention time, RT),在GC-MS總離子流圖中相應(yīng)的保留時(shí)間處得到疑似組分的質(zhì)譜圖,通過儀器配套的Nist14數(shù)據(jù)庫匹配與之相對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)化合物質(zhì)譜圖,從而確定性信息素疑似組分的具體化學(xué)結(jié)構(gòu)。為了進(jìn)一步確定性信息素疑似組分的化學(xué)結(jié)構(gòu),還要對(duì)上述匹配到的化合物及其同分異構(gòu)體進(jìn)行GC-MS分析。配制10 ng/μL的標(biāo)準(zhǔn)化合物溶液,進(jìn)樣和分析方法同上述性信息素腺體提取物一致。通過計(jì)算引起雄蛾EAG反應(yīng)的性信息素疑似組分和相匹配的化合物的Kováts保留指數(shù)(Kováts retention index,KI)確定其化學(xué)結(jié)構(gòu)。

1.7 性信息素活性組分滴度(含量)測(cè)定

在鑒定出蔥蘭夜蛾雌蛾性信息素腺體提取物活性組分的化學(xué)結(jié)構(gòu)后,分別配制0.1, 0.25, 0.5, 0.75和1 ng/μL的該組分標(biāo)準(zhǔn)化合物溶液,按照1.4節(jié)中的GC-MS檢測(cè)參數(shù)進(jìn)行樣品分析。獲得各濃度標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積數(shù)據(jù)后,制作劑量-峰面積標(biāo)準(zhǔn)曲線并建立兩者之間的直線回歸方程,用于計(jì)算雌蛾性信息素腺體提取物活性組分滴度。提取1日齡處女雌蛾性信息素腺體提取物的活性組分,每個(gè)重復(fù)5頭,共3個(gè)重復(fù),提取方法同1.3節(jié)。待浸提液濃縮后使用GC-MS分析后可得到活性組分的峰面積,根據(jù)劑量-峰面積標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出該活性組分滴度。

1.8 雄蛾觸角對(duì)標(biāo)準(zhǔn)化合物的劑量反應(yīng)

EAG儀主要構(gòu)成部分包括直流交流放大器(IDAC-2)、氣流控制器(CS-55)、微動(dòng)操作儀(MP-15)及觸角電位探頭(PRG-2)(Syntech,德國)。實(shí)驗(yàn)前用正己烷配制濃度為0.1, 1, 10和100 ng/μL標(biāo)準(zhǔn)化合物Z11-16∶Ald溶液,低溫保存?zhèn)溆?。選取1日齡蔥蘭夜蛾雄蛾,用眼科手術(shù)剪將其觸角剪下,剪取更接近端部的部分并用刀片切除觸角端部約0.5 mm,然后用導(dǎo)電膠分別將觸角兩端包裹住并連接在金屬電極上,而后將金屬電極插入EAG探頭中。制作規(guī)格為0.5 cm×5 cm的濾紙條,用移液槍移取10 μL上述配制好的溶液到不同濾紙條,約15 s后待濾紙條風(fēng)干放進(jìn)巴氏玻璃管中。開始測(cè)試時(shí),按照空氣、正己烷、低濃度Z11-16∶Ald溶液、高濃度Z11-16∶Ald溶液的順序刺激觸角。每種成分測(cè)定每根觸角3次,重復(fù)測(cè)定5根觸角,取測(cè)定平均值。數(shù)據(jù)由Syntech EAG Pro軟件記錄并存儲(chǔ)。

1.9 數(shù)據(jù)分析

求偶持續(xù)時(shí)間為求偶開始至結(jié)束的時(shí)間間隔,每日齡雌蛾的求偶時(shí)長等于當(dāng)天發(fā)生求偶行為的雌蛾求偶持續(xù)時(shí)間的平均值,求偶率(%)=(求偶雌蛾數(shù)量/測(cè)試雌蛾總數(shù))×100,根據(jù)得到的每組重復(fù)的求偶率計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤。KI計(jì)算公式如下(Marquesetal., 2000):

其中,n和N分別表示鑒定樣品色譜峰前后正烷烴色譜峰具有的碳原子數(shù),tR(n)和tR(N)分別表示鑒定樣品前后相應(yīng)碳原子數(shù)的正烷烴色譜峰的色譜保留時(shí)間,tR(unknown)表示待鑒定樣品色譜峰的色譜保留時(shí)間。

所有數(shù)據(jù)使用Excel 2019進(jìn)行統(tǒng)計(jì)整理和作圖,通過SPSS 22.0進(jìn)行方差分析,差異顯著性采用單因素方差分析(one-way ANOVA)并通過最小顯著性差異法(least significance difference, LSD)進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果

2.1 蔥蘭夜蛾雌蛾求偶行為和節(jié)律

最早在進(jìn)入暗期2 h后,能觀察到蔥蘭夜蛾雌蛾的求偶活動(dòng)。首先,雌蛾微微扇動(dòng)翅,腹部第8和第9腹節(jié)的節(jié)間膜上的性信息素腺體表皮開始外翻并膨大,形成兩個(gè)半球狀黃色突起,持續(xù)膨脹與收縮,腹部末端的產(chǎn)卵器外伸(圖1)。

觀察到蔥蘭夜蛾雌蛾整個(gè)求偶過程都在暗期,從1日齡起即開始釋放雌激素,最大求偶日齡為3日齡。1日齡雌蛾求偶開始時(shí)間在暗期3.0 h之后,此后求偶頻次逐漸增加,在暗期5.5 h時(shí)達(dá)到最大,求偶高峰在暗期5.0-9.0 h;2日齡雌蛾最早求偶時(shí)間提前至暗期2.0 h,求偶頻次在暗期4.0 h時(shí)達(dá)到最大,求偶高峰期為暗期3.5-7.0 h求偶頻次和求偶率較1日齡有所降低;3日齡雌蛾在暗期2.5 h后開始求偶活動(dòng),求偶最高峰在暗期4.5 h時(shí),求偶高峰期為暗期4.0-6.5 h時(shí),求偶活躍程度最低(圖2)。1-3日齡雌蛾求偶時(shí)長分別為(3.57±0.46), (3.85±0.36) 和(3.63±0.69) h,三者無顯著性差異(P>0.05);1-3日齡雌蛾求偶率分別為63.33%±3.33%, 60.00%±11.55%和20.00%±10.00%, 1-2日齡雌蛾求偶率顯著高于3日齡雌蛾的(P<0.05)(圖3)。

圖2 蔥蘭夜蛾雌蛾求偶時(shí)辰節(jié)律Fig. 2 Time rhythm of the calling behavior of female moths of Brithys crini

圖3 不同日齡蔥蘭夜蛾雌蛾的求偶時(shí)長和求偶率Fig. 3 Courtship duration and calling rates of different day-old female moths of Brithys crini圖中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤; 同一系列柱上/折線上不同字母表示差異顯著(P<0.05, 最小顯著性差異檢驗(yàn));圖8同。Data in the figure are mean±SE. Different letters above bars /broken line in the same series indicate significant difference (P<0.05, least significant difference test). The same for Fig. 8.

2.2 蔥蘭夜蛾雌蛾性信息素腺體提取物的GC-EAD分析

根據(jù)上述蔥蘭夜蛾求偶行為節(jié)律,1-2日齡雌蛾求偶行為較活躍,求偶高峰期多在進(jìn)入暗期后的4.0-9.0 h。選取正在求偶的1-2日齡處女雌蛾,從蔥蘭夜蛾雄蛾觸角對(duì)處女雌蛾性信息素腺體提取物進(jìn)行的GC-EAD分析可知,在保留時(shí)間為28.056 min處存在能引起蔥蘭夜蛾雄蛾觸角電生理活性反應(yīng)的組分(圖4)。

圖4 蔥蘭夜蛾雄蛾觸角對(duì)雌蛾性信息素腺體提取物的氣相色譜-觸角電位聯(lián)用儀(GC-EAD)分析圖譜Fig. 4 Gas chromatography-electroantennagram detection (GC-EAD) trace of the antennae of male moths of Brithys crini to the sex pheromone gland extracts from female mothsEAD: 觸角電位反應(yīng)信號(hào)Electroantennagram trace; FID: 氣相色譜信號(hào)Gas chromatography trace.

2.3 蔥蘭夜蛾雌蛾性信息素腺體提取物的GC-MS分析

按照與GC-EAD測(cè)試相同的色譜條件,對(duì)蔥蘭夜蛾處女雌蛾性信息素腺體提取物進(jìn)行GC-MS分析,得到相應(yīng)的GC-MS圖。結(jié)果顯示,同樣在保留時(shí)間28.056 min處存在疑似信息化學(xué)物質(zhì)的色譜峰(圖5)。使用Nist 14對(duì)該處的質(zhì)譜圖進(jìn)行數(shù)據(jù)庫檢索,結(jié)果顯示與該疑似組分匹配度最高的化合物為11-十六碳烯醛(11-16∶Ald)。

圖5 蔥蘭夜蛾雌蛾性信息素腺體提取物和標(biāo)準(zhǔn)化合物的總離子流圖Fig. 5 Total ion chromatogram of the sex pheromone gland extracts from the female moths of Brithys crini and synthetic standard compounds左邊箭頭示性信息素活性組分峰; 右邊箭頭示黑色虛線內(nèi)總離子流圖的局部放大。The arrow on the left indicates the peak of sex pheromone active component. The arrow on the right indicates the partial magnification of total ion chromatogram inside the black dotted line.

由于11-16∶Ald存在兩種同分異構(gòu)體Z11-16∶Ald和反-11-十六碳烯醛(E11-16∶Ald),因此同時(shí)對(duì)這兩種化合物進(jìn)行GC分析。結(jié)果顯示雌蛾性信息素腺體提取物中的信息素疑似組分Comp. Ⅰ與Z11-16∶Ald和E11-16∶Ald具有相似的質(zhì)譜圖,其分子離子峰m/z238和特征碎片離子峰(m/z55, 69, 81)的相對(duì)強(qiáng)度與這兩種標(biāo)準(zhǔn)化合物的特征碎片離子峰(m/z)基本保持一致,這進(jìn)一步證實(shí)了Comp. Ⅰ為化合物11-16∶Ald(圖6)。但是對(duì)比三者的保留時(shí)間和Kováts保留指數(shù)發(fā)現(xiàn),信息素疑似組分Comp. Ⅰ與Z11-16∶Ald的保留時(shí)間和Kováts保留指數(shù)完全一致(表1),由此確定上述引起EAD響應(yīng)的組分為Z11-16∶Ald。

表1 蔥蘭夜蛾雌蛾性信息素組分Comp. Ⅰ和11-16∶Ald同分異構(gòu)體在DB-5色譜柱上的保留時(shí)間和Kováts保留指數(shù)Table 1 Retention time and Kováts retention indices of the sex pheromone component Comp. Ⅰ of the female moths of Brithys crini and 11-16∶Ald isomers on DB-5 column

圖6 蔥蘭夜蛾雌蛾性信息素腺體提取物和標(biāo)準(zhǔn)化合物的質(zhì)譜圖Fig. 6 Mass spectra of the sex pheromone gland extracts from the female moths of Brithys crini and synthetic standard compoundsA: 性信息素腺體提取物Sex pheromone gland extracts; B: Z11-16∶Ald; C: E11-16∶Ald.

2.4 蔥蘭夜蛾雌蛾性信息素活性組分含量

根據(jù)不同濃度標(biāo)準(zhǔn)化合物Z11-16∶Ald的劑量x與對(duì)應(yīng)的峰面積相對(duì)豐度y建立劑量-峰面積標(biāo)準(zhǔn)曲線,分析結(jié)果表明劑量與峰面積之間的關(guān)系呈顯著直線回歸關(guān)系(df=3,P<0.05),標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=1 000 006x-83 606,R2= 0.9886(圖7)。根據(jù)上述標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算出1和2日齡雌蛾性信息素腺體提取物中的Z11-16∶Ald平均濃度為(0.6211±0.0022) ng/μL,故而可以推算出單頭處女雌蛾Z11-16∶Ald的平均含量為(3.11±0.01) ng。

圖7 Z11-16∶Ald的劑量-峰面積標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig. 7 Standard curve of dose-peak area of Z11-16∶Ald

2.5 蔥蘭夜蛾雄蛾對(duì)標(biāo)準(zhǔn)化合物Z11-16∶Ald的EAG反應(yīng)

分別取10 μL濃度為0.1, 1, 10和100 ng/μL的標(biāo)準(zhǔn)化合物Z11-16∶Ald溶液進(jìn)行EAG測(cè)試。結(jié)果顯示,雄蛾對(duì)Z11-16∶Ald的EAG反應(yīng)存在明顯的劑量效應(yīng):1 ng劑量引起的 EAG 反應(yīng)與正己烷對(duì)照(CK)相近;加大劑量到10 ng后,引起的EAG反應(yīng)要顯著強(qiáng)于CK(P<0.05);隨著刺激劑量增加至100 ng,引起的EAG反應(yīng)最強(qiáng);繼續(xù)加大劑量到1 000 ng后,EAG反應(yīng)較前者有所降低(圖8)。

圖8 蔥蘭夜蛾雄蛾對(duì)不同劑量Z11-16∶Ald的觸角電位(EAG)反應(yīng)Fig. 8 Electroatennogram (EAG) responses of the male moths of Brithys crini to different doses of Z11-16∶AldCK: 正己烷Hexane.

3 討論

自然環(huán)境中光照強(qiáng)度隨白天黑夜穩(wěn)定而有規(guī)律的變化使得昆蟲各種行為都具有晝夜節(jié)律(Groot, 2014; 鐘春蘭等, 2022)。蛾類昆蟲的求偶節(jié)律受到光暗周期的顯著影響:一般情況下,暗期越長,求偶持續(xù)時(shí)間越長 (Delisle and McNeil, 1986; Gerber and Howlader, 1987)。本研究設(shè)置的光周期為12L∶12D,旨在獲得更長的求偶行為觀察時(shí)間,也為了更好地開展雌蛾性信息素提取工作。此外,不同昆蟲的性發(fā)育時(shí)間也有所不同,像棉紅鈴蟲Pectinophoragossypiella需要1 d時(shí)間(許冬等, 2020),褸裳夜蛾Catocalaremissa雌蛾最早在羽化3 d以后才開始求偶,一周左右表現(xiàn)最為強(qiáng)烈(鄭海霞等, 2014)。蔥蘭夜蛾羽化當(dāng)天的成蟲就已經(jīng)性成熟,進(jìn)入暗期后便開始求偶活動(dòng),這與木毒蛾Lymantriaxylina(左城等, 2020)、 巨癤蝙蛾Endoclitadavidi(李幸等, 2021)等蛾類相似。推測(cè)是因?yàn)槭[蘭夜蛾成蟲壽命較短,所以性成熟的時(shí)間縮短,且在1日齡時(shí)就達(dá)到了求偶的最高峰。

此外,蔥蘭夜蛾隨著日齡的增長,求偶開始時(shí)間會(huì)有所提前,這跟許多的蛾類是一致的,這可能是為了增加交配的機(jī)會(huì),主要由于日齡較大的雌蛾釋放信息素量的含量也會(huì)相應(yīng)減少(Kamimura and Tatsuki, 1993)。通常,蛾類在羽化后的第1個(gè)晚上體內(nèi)信息素含量較低,在第2和3個(gè)晚上急劇增加,然后隨著雌蛾日齡的增大,性信息素的釋放量會(huì)減少(Webster and Cardé, 1982),因此,蛾類昆蟲性信息素的釋放節(jié)律與其求偶節(jié)律是緊密相關(guān)的,故而可根據(jù)求偶行為推算出雌蛾釋放信息素的時(shí)間段(Mazor and Dunkelblum, 2005; 郭前爽等, 2022)。本研究中,只觀察到1-3日齡蔥蘭夜蛾存在求偶行為,1-2日齡雌蛾求偶行為較為活躍,求偶高峰期在進(jìn)入暗期后的3.5-9.0 h。據(jù)此,選取正在求偶的1-2日齡處女雌蛾開展性信息素浸泡提取工作。

GC-MS技術(shù)能將性腺提取液的各種組分進(jìn)行分離,同時(shí)獲得各組分的質(zhì)譜數(shù)據(jù),借助化學(xué)物質(zhì)信息庫匹配出對(duì)應(yīng)的化合物(Ando and Yamakawa, 2011)。但是絕大多數(shù)通過GC-MS技術(shù)鑒定的信息素化學(xué)結(jié)構(gòu)都存在同分異構(gòu)體,僅憑質(zhì)譜信息很難確定信息素組分的順反構(gòu)象。將各異構(gòu)體標(biāo)準(zhǔn)品配制成標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行EAG反應(yīng)測(cè)試,是確定信息素化學(xué)結(jié)構(gòu)的最直觀和有效的方法。Kováts保留指數(shù)也是一項(xiàng)輔助判斷化合物結(jié)構(gòu)的重要指標(biāo),其數(shù)值只跟化合物本身的性質(zhì)以及GC-MS所用色譜柱固定相有關(guān)(Marquesetal., 2000; 張雪梅等, 2008)。Yang等(2013)通過對(duì)天然信息素成分與合成標(biāo)準(zhǔn)品的保留指數(shù)比較,確定了桃展足蛾Stathmopodaauriferella的性信息素主要成分。朱俁偉等(2022)通過同樣的方法確定了棉大卷葉螟Syleptaderogata性信息素主要組分的化學(xué)結(jié)構(gòu)。本研究通過比較活性組分與11-16∶Ald的2種同分異構(gòu)體在色譜柱上的保留時(shí)間和Kováts保留指數(shù),從而確定了蔥蘭夜蛾性信息素活性組分為Z11-16∶Ald。

Kou等(1991)此前雖然通過GC-MS找出蔥蘭夜蛾的性信息素組分為Z11-16∶Ald,但是尚未開展性信息素組分的定量、順反構(gòu)象及電生理活性分析。因此,本研究通過比較活性組分與11-16∶Ald的2種同分異構(gòu)體在色譜柱上的保留時(shí)間和保留指數(shù),進(jìn)一步確定了蔥蘭夜蛾性信息素活性組分的化學(xué)結(jié)構(gòu),并對(duì)單一雌蛾的性信息素進(jìn)行定量。此外,本研究使用不同劑量的Z11-16∶Ald對(duì)蔥蘭夜蛾雄蛾觸角進(jìn)行EAG測(cè)試,發(fā)現(xiàn)10 ng以上劑量引起的EAG反應(yīng)顯著強(qiáng)于正己烷對(duì)照, 100 ng劑量引起的觸角反應(yīng)最強(qiáng)烈,劑量加大后會(huì)表現(xiàn)出抑制效果(圖8);而實(shí)驗(yàn)測(cè)得蔥蘭夜蛾雌蛾性信息素組分的日滴度為3.11 ng。EAG測(cè)試結(jié)果與雌蛾該組分的日滴度測(cè)定結(jié)果契合,這為下一步開展野外試驗(yàn)提供了研究基礎(chǔ)。

本研究中鑒定的Z11-16∶Ald是一種常見的醛類性信息素,是多種夜蛾科昆蟲性信息素的主要組分(董改娟等, 2008; 宋亞茹等, 2017)。結(jié)合多數(shù)有關(guān)昆蟲性信息素的報(bào)道發(fā)現(xiàn),許多近緣種昆蟲含有相同的性信息素主要組分,往往通過次要組分的差異表現(xiàn)出性信息素的特異性(Chenetal., 2018)。同一亞科不同屬或同屬不同種之間的昆蟲性信息素活性化合物種類有可能相同,但是比例存在差異:實(shí)夜蛾亞科同屬的Heliothispunctiger和Heliothisphloxiphaga的性信息素組分為Z11-16∶Ald和順-11-十六碳烯醇(Z11-16∶OH),但二者比例不同,前者兩種性信息素化合物配比為100∶75,后者為100∶7.2(Rothschildetal., 1982; Rainaetal., 1986);谷實(shí)夜蛾Heliothiszea和點(diǎn)實(shí)夜蛾Heliothispeligera性信息素的主要成分是Z11-16∶Ald,次要成分是順-9-十四碳烯醛(Z9-14∶Ald), 但比例各有不同, 分別為100∶3.9和100∶14.6(Klunetal., 1980; Dunkelblum and Kehat, 1989)。同理可以推測(cè),蔥蘭夜蛾性信息素除Z11-16∶Ald這一主要組分外,是否存在影響蔥蘭夜蛾化學(xué)通訊交流的次要組分,需要接下來進(jìn)一步可以在性信息素提取上優(yōu)化方法,選擇更高效和高富集的技術(shù),比如固相微萃取技術(shù)、頂空-固相微萃取和直接接觸吸附萃取等;同時(shí)可使用具有更寬容的峰容量和色譜分辨率、更高靈敏度的全二維氣相色譜飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用儀(comprehensive two-dimensional gas chromatography/time-of-flight mass spectrometry, GC×GC/TOFMS),以適應(yīng)蔥蘭夜蛾性信息素腺體提取物有效成分濃度較低的情形,或是探索次要組分在蔥蘭夜蛾化學(xué)通訊交流中的作用。

同時(shí),雖然大部分昆蟲性信息素通常是由兩種或兩種以上的化合物組成,但是,也有部分昆蟲的信息素組分被鑒定為多元組分,實(shí)際應(yīng)用過程中,單個(gè)組分即可具有較好的生物活性,像金紋細(xì)蛾P(guān)hyllonorycterringoniella的信息素組分為順-10-十四碳烯乙酸酯(Z10-14∶Ac)和反4,順10-十四碳烯乙酸酯(E4,Z10-14∶Ac),實(shí)際1 mgE4,Z10-14∶Ac就具有顯著的誘蛾效果(Duetal., 2013);也有昆蟲的信息素組分目前報(bào)道僅為1種活性組分,像蘋果蠹蛾Cydiapomonella和楊小舟蛾Micromelalophasiversi(Liuetal., 2021),這與本研究中蔥蘭夜蛾的1種性信息素活性組分一致。

總之,蔥蘭夜蛾性信息素組分的鑒定,可有利于開發(fā)基于性信息素的高效引誘劑,不僅可以監(jiān)測(cè)蔥蘭夜蛾的發(fā)生動(dòng)態(tài),還可以通過大量誘捕或者迷向干擾降低蔥蘭夜蛾的交配率,進(jìn)而為蔥蘭夜蛾的綠色防控技術(shù)提供可靠的技術(shù)參考和理論依據(jù)。