CREB激活促進神經(jīng)痛大鼠脊髓背角HCN4轉(zhuǎn)錄的實驗研究

王 蓉，萬 琪，謝 曄，徐 陶，曾俊偉，劉曉紅

(遵義醫(yī)科大學 生理學教研室，貴州 遵義 563099)

脊髓背角可以接受來自外周的傷害性信息并將其傳至大腦高級中樞，而腦內(nèi)的下行抑制/易化系統(tǒng)也可對傷害性信息進行調(diào)制[1]。近年研究表明，超極化激活的環(huán)核苷酸門控(Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gating，HCN)通道有4個成員，分別為HCN1-4，在神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生與維持中發(fā)揮重要作用[1-2]。在脊髓背角，HCN4表達于GABA能抑制性中間神經(jīng)元和蛋白激酶Cγ(Protein kinase Cγ，PKCγ)陽性興奮性中間神經(jīng)元[3-7]。鞘內(nèi)給予HCN通道阻滯劑ZD7288明顯減輕慢性坐骨神經(jīng)縮窄性損傷(Chronic constriction injury， CCI)或糖尿病大鼠的熱痛及機械痛癥狀，并顯著抑制其脊髓背角HCN4表達上升[3-6]。而且，鞘內(nèi)注射HCN4慢病毒顆粒導致背角HCN4表達下調(diào)，明顯緩解化療大鼠的機械痛敏，其機制與抑制背角γ-氨基丁酸B型受體(Gamma-amino butyric acid receptor，GABABR)表達有關(guān)[8]。因此，探討HCN4通道的表達調(diào)控機制有助于以HCN4通道作為靶點進行鎮(zhèn)痛藥物研發(fā)。

環(huán)磷酸腺苷-蛋白激酶A (Cyclic adenosine monophosphate-protein kinase A，cAMP-PKA)信號通路在HCN4通道的活性調(diào)節(jié)中具有重要作用。環(huán)磷酸腺苷(Cyclic adenosine monophosphate，cAMP)與HCN4通道蛋白的cAMP結(jié)合域結(jié)合，隨后HCN4通道開放,形成的凈內(nèi)向電流使細胞興奮性增強[9]。PKA 抑制劑可抑制大鼠背根節(jié)以及前額葉皮層神經(jīng)元 HCN 通道電流，導致神經(jīng)元興奮性降低[10-11]。在坐骨神經(jīng)損傷大鼠中，脊髓背角cAMP-PKA信號通路的激活促進鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ (Calmodulin-dependent protein kinase Ⅱ，CaMKⅡ)活化和轉(zhuǎn)錄因子cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(Cyclic-AMP response binding protein，CREB)磷酸化，引起下游疼痛相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄[12-14]。然而，目前并不清楚信號分子PKA、CaMKII和CREB的激活是否促進神經(jīng)痛大鼠脊髓背角HCN4轉(zhuǎn)錄和表達。CREB作為轉(zhuǎn)錄因子，是否能夠結(jié)合到HCN4啟動子序列并促進其轉(zhuǎn)錄和表達，尚需實驗證實。因此，本實驗制備CCI神經(jīng)痛模型，鞘內(nèi)分別給予H-89(PKA抑制劑)，KN-93(CaMKⅡ抑制劑)或Naphthol AS-E(CREB抑制劑)，觀察這些工具藥對神經(jīng)痛大鼠的機械痛行為的影響，分析PKA、CaMKII和CREB的激活對脊髓背角HCN4轉(zhuǎn)錄及蛋白表達的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑 H-89(PKA抑制劑，B1427)、KN-93(CaMKⅡ抑制劑，K1385)來自美國Sigma；Naphthol AS-E(CREB抑制劑，HY-104068)來自MCE；兔抗 HCN4 多克隆抗體(55224-1-AP)、兔抗 CREB多克隆抗體(12208-1-AP)、兔抗β-actin 多克隆抗體(20536-1-AP)、小鼠抗β-actin單克隆抗體(66009-1-Ig)均來自美國 Proteintech；兔抗p-CaMKⅡ(Ser286)單克隆抗體(12716S)、兔抗 p-CREB(Ser133)單克隆抗體(9198S)來自美國 Cell Signaling Technology；兔抗GAPDH單克隆抗體(ET1601-4)來自華安生物；小鼠抗PKA單克隆抗體(sc-365615)、小鼠抗 CaMKⅡ 單克隆抗體(sc-5306)來自Santa Cruz；兔抗 p-PKA單克隆抗體(ab75991)來自 Abcam；CREB探針及引物來自上海生工有限公司；核蛋白提取試劑盒(NT-032)來自Invent公司；Triozl試劑(9108)、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(RR037A)和SYBR Green熒光染料試劑盒(RR820A)來自TaKaRa；EMSA試劑盒(GS009)來自上海碧云天生物科技公司。

1.2 主要儀器 電子Von Frey測痛儀購自美國IITC Life Science；電泳儀和電泳槽和半干電轉(zhuǎn)移系統(tǒng)購自美國 Bio-Rad Laboratories；全能型凝膠成像系統(tǒng)購自英國 Syngene；Quant Studio TM 6 Flex PCR儀購自美國Thermo Fisher scientific。

1.3 實驗動物分組 體重200～230 g雄性SD大鼠購自長沙天勤公司[許可證號SCXK(湘)2019-0014]；實驗期間大鼠分籠，于溫度(22±2)℃、濕度50%左右、晝夜交替12 h環(huán)境中飼養(yǎng)。分為6 組：(1) Sham組；(2) Sham+Vehicle組；(3) CCI+Vehicle組；(4)CCI+H-89(8nM)；(5)CCI+KN-93(50nM)；(6)CCI+Naphthol AS-E(5 μg/10uL)。Sham組大鼠僅暴露坐骨神經(jīng)不結(jié)扎。其余各組大鼠在鞘內(nèi)置管7 d后建立CCI模型,術(shù)后分別鞘內(nèi)注射0.005 % DMSO生理鹽水、H-89、KN-93 或Naphthol AS-E。10 μL/次，連續(xù)7 d，每天1次。

1.4 建模

1.4.1 鞘內(nèi)置管 戊巴比妥鈉(40 mg/kg，i.p.)麻醉大鼠，取俯臥位固定，在L3～L4間隙縱向切開背部皮膚，分離L4棘突兩側(cè)肌肉，剪掉L4棘突及相鄰的白色椎板，使L3與L4棘突間隙得以暴露出來，用彎針挑破黃韌帶及硬腦膜，當看到腦脊液溢出時，在此處插入PE-10導管，然后輕輕向上推2 cm，到達腰膨大處，隨后將導管尖端固定在大鼠頸部區(qū)域。術(shù)后注射青霉素預防感染。術(shù)后第2天通過導管注射2%利多卡因(15 μL)，若注射后30 s內(nèi)出現(xiàn)雙側(cè)下肢癱軟，則為置管成功。只有無明顯神經(jīng)癥狀的正常大鼠被納入實驗。

1.4.2 CCI模型 大鼠置管成功7 d后，戊巴比妥鈉(40 mg/kg，i.p.)麻醉并固定，在股骨外側(cè)上方縱向切開長約1.5 cm的切口，鈍性分離肌肉，使坐骨神經(jīng)完全暴露，用4.0非吸收性醫(yī)用縫合線結(jié)扎坐骨神經(jīng)4道，每道間距大約為1 mm。結(jié)扎強度一般以引起小腿肌肉輕微顫動為宜。術(shù)后分籠飼養(yǎng)并注意清潔以防感染。Sham組大鼠僅暴露坐骨神經(jīng)不結(jié)扎。

1.5 行為學測定 利用電子足底觸覺測定儀來檢測大鼠的MWT。在相對安靜的環(huán)境中，將上述各組大鼠分別單獨放置于金屬絲網(wǎng)眼的透明玻璃籠中，待大鼠適應(yīng)環(huán)境15～20 min后，將剛性尖端垂直地刺向大鼠后爪足底皮膚，在此過程中，若大鼠出現(xiàn)輕微的肌肉收縮或后爪抬起的反應(yīng)，則判斷為陽性反應(yīng)，此時可記錄下儀器上顯示的縮爪閾值，切斷值設(shè)置為60 g。每5分鐘檢測1次，重復進行3次，取平均值。所有大鼠均在CCI手術(shù)前1 d，術(shù)后1、3、5、7 d測定。

1.6 WB檢測脊髓背角HCN4、PKA、p-PKA、CaMKⅡ、p-CaMKⅡ、CREB和p-CREB表達 CCI術(shù)后7 d，戊巴比妥鈉對大鼠進行麻醉，取術(shù)側(cè)的背側(cè)脊髓約7 mm(L4～ L6)，置于EP管中，加入200 μL RIPA裂解混合液(RIPA：蛋白酶抑制劑：磷酸酶抑制劑=100∶1∶1)后，用高通量組織研磨儀研磨混合后置于冰上，裂解30 min，每隔10 min震蕩一次；4 ℃，12 000 rpm離心20 min，取上清液，用BCA法檢測總蛋白濃度，其余上清液加入上緩變性。每孔加80 μg蛋白，SDS-PAGE電泳，膜轉(zhuǎn)移，5%脫脂奶粉封閉2 h。加入兔源HCN4抗體(1∶500)，小鼠源 PKA抗體(1∶100)，兔源p-PKA抗體(1∶1 000)，小鼠源CaMKⅡ抗體(1∶100)，兔源p-CaMKⅡ抗體(1∶1 000)，兔源CREB抗體(1∶500)，兔源p-CREB抗體(1∶1 000)，兔源GAPDH抗體(1∶50 000)，兔源β-actin抗體(1∶3 000)，小鼠源β-actin抗體(1∶5 000)，4℃過夜后。將膜放在TBST中清洗3次，每次間隔10 min，隨后加入HRP標記的羊抗兔二抗(1∶3 000)或羊抗小鼠二抗(1∶5 000)，室溫孵育1 h，再次洗膜30 min，清洗完畢的PVDF膜采用化學發(fā)光法進行檢測，將顯影液混勻后滴在膜上，并放入儀器內(nèi)曝光顯色。數(shù)據(jù)采取ImageJ 1.48軟件處理，GAPDH或β-actin為內(nèi)參，以相對蛋白表達水平進行統(tǒng)計分析[(實驗組目的蛋白灰度值/實驗組內(nèi)參灰度值) / (Sham組目的蛋白灰度值/Sham組內(nèi)參灰度值)]。

1.7 RT-qPCR檢測HCN4 mRNA表達 CCI術(shù)后7 d，用戊巴比妥鈉對大鼠進行麻醉，取術(shù)側(cè)的背側(cè)脊髓約7 mm(L4～ L6)，置于無酶的EP管中，Trizol 法抽提組織總 mRNA。純化后，使用無酶水洗脫RNA，并測定其濃度和純度。260∶280的吸光度比應(yīng)在1.9～2.1的范圍內(nèi)。使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光染料試劑盒進行逆轉(zhuǎn)錄和擴增反應(yīng)。根據(jù)GenBank上搜索的序列設(shè)計引物。本研究中使用的引物的核苷酸序列如下：(1) HCN4 (genebank:NM_021658.2):F:5′-CACTAAGGGCAACAAGGAGACCAAG-3′；R:5′-TGAGTAGAGGCGGCAGTAAGTATCC-3′，(2)β-actin(genebank:NM_007393.5):F:5′-GGCTGTATTCCCCTCCATCG-3′； R:5′-CCAGTTG GTAACAATGCCATGT-3′。qPCR的體系為20 μL，其中7 μL DEPC水、10 μL TB Green? Premix Ex TaqTMⅡ、0.5μL PCR Forward Primer (10μM)、0.5μL PCR Reverse Primer(10 μM)和2 μL cDNA。每個孔均要做復孔。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件為：37 ℃，15 min，85℃，5 s；擴增反應(yīng)條件為：95 ℃，30 s；95 ℃，5 s；60 ℃，30 s；40 個循環(huán)。以β-actin為內(nèi)參對照，統(tǒng)計各組CT值，采用2-△△CT(Livak法)法進行數(shù)據(jù)分析。

1.8 電泳遷移率實驗(EMSA)檢測CREB與HCN4啟動子區(qū)域的DNA結(jié)合活性 CCI術(shù)后7 d，用戊巴比妥鈉對大鼠進行麻醉，取術(shù)側(cè)的背側(cè)脊髓約7 mm(L4～ L6)，置于EP管中，根據(jù)胞核提取試劑盒說明書步驟提取核蛋白，BCA法測定核蛋白濃度，-80℃保存。在PROMO和JASPAR數(shù)據(jù)庫預測到轉(zhuǎn)錄因子CREB可能與HCN4啟動子區(qū)域的四段序列結(jié)合。因此，由上海生工有限公司合成生物素3′端DNA標記的CREB探針，分別為CREB-1 (234-255bp):5′-GCTCCAGGTGATGTCATCACCC-3′；CREB-2(838-859bp):5′-CAGAGTATCAGGTCACCAGAGG-3′；CREB-3(1409-1430bp):5′-GGAGTAAGGACGCCTCCTACCT-3′；CREB-4(1668-1689bp):5′-CGGCGGCTGATGTAAGCCCGGC-3′，將探針退火為雙鏈。使用EMSA化學發(fā)光試劑盒檢測CREB與HCN4啟動子之間的結(jié)合活性。核蛋白-DNA探針反應(yīng)總體積為10 μL：核蛋白5 μg，2μL 5×Binding buffer，室溫反應(yīng)10 min后，加入生物素標記探針1 μL，反應(yīng)20 min，剩余用無酶水補足10 μL；隨后加入1 μL 10×Loading buffer。對于競爭實驗：體系中添加100倍量的未標記的CREB探針，室溫孵育20 min后加入標記探針，其余步驟一致。然后將反應(yīng)物在5%凝膠上進行電泳，隨后轉(zhuǎn)移到帶正電荷的尼龍膜上，其余步驟參照EMSA試劑盒說明書。

2 結(jié)果

2.1 鞘內(nèi)注射H-89、KN-93或 Naphthol AS-E 抑制劑對CCI大鼠機械痛閾的影響 在坐骨神經(jīng)結(jié)扎前1 d，結(jié)扎后 1、3、5、7 d內(nèi)，檢測各組大鼠機械痛閾變化。結(jié)果顯示(見圖1)，Sham 組和Sham+Vehicle組的MWT 始終穩(wěn)定于基礎(chǔ)水平，差異無統(tǒng)計學意義。與Sham組相比，CCI+Vehicle組在第1、3、5、7天的MWT明顯降低，具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與CCI+Vehicle組相比，鞘內(nèi)注射H-89、KN-93或Naphthol AS-E的藥物治療組MWT顯著升高(P<0.05)。

2.2 鞘內(nèi)注射H-89、KN-93或 Naphthol AS-E對CCI大鼠脊髓背角HCN4表達的影響 如圖2A，Sham組和Sham+Vehicle組背角HCN4 mRNA的表達無統(tǒng)計學意義。與Sham組相比，CCI+Vehicle組脊髓背角HCN4 mRNA表達顯著升高，具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與CCI模型組相比，鞘內(nèi)注射H-89、KN-93或Naphthol AS-E的藥物治療組背角HCN4 mRNA表達顯著下降，具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。如圖2B所示，Sham 組和Sham+Vehicle組背角HCN4在蛋白表達水平無統(tǒng)計學意義。與Sham組相比，CCI+Vehicle組HCN4 蛋白表達顯著升高，具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與CCI+Vehicle組相比，鞘內(nèi)注射H-89、KN-93或Naphthol AS-E的藥物治療組背角HCN4 蛋白表達顯著下降，具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，說明HCN4表達受PKA、CaMKII和CREB調(diào)控。

*:與Sham組比較,P<0.05；+:與CCI+Vehicle組比較,P<0.05,n=8。圖1 各組大鼠的機械痛敏變化情況

2.3 鞘內(nèi)注射H-89、KN-93或 Naphthol AS-E對CCI大鼠脊髓背角PKA、p-PKA、CaMKⅡ、p-CaMKⅡ、CREB和p-CREB表達的影響 如圖3，Sham組和Sham+Vehicle組脊髓背角PKA、p-PKA、CaMKII、p-CAMKⅡ、CREB和p-CREB的表達無統(tǒng)計學意義。與Sham組相比， CCI+Vehicle組PKA、p-PKA、CaMKII、p-CAMKⅡ、CREB和p-CREB表達顯著增加，具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與CCI+Vehicle組相比，鞘內(nèi)注射H-89、KN-93或Naphthol AS-E的藥物治療組背角PKA、p-PKA、CaMKII、p-CAMKⅡ、CREB和p-CREB表達顯著下降，具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.4 鞘內(nèi)注射H-89、KN-93或 Naphthol AS-E對CREB與HCN4啟動子區(qū)域結(jié)合活性的影響 如圖4，探針CREB-1(含有CREB激活位點元件的生物素3’端DNA標記探針)與來自CCI+Vehicle組的大鼠背角核蛋白提取物混合，進行凝膠電泳。與Sham組相比，來自CCI+Vehicle組的核提取物有效地結(jié)合大量CREB-1探針，顯示濃重的遷移條帶，然而，H-89、KN-93或Naphthol AS-E藥物治療組CREB遷移條帶減少。CCI+Vehicle組的核提取物添加過量的未標記探針后無法檢測到CREB結(jié)合條帶。同時，盡管反復變換試驗條件，但均未觀察到其他探針(CREB-2、CREB-3、CREB-4)與來自CCI組的核提取物形成的凝膠條帶，這初步證實CREB可以識別并結(jié)合到HCN4啟動子區(qū)域242-249bp的序列(5′-GCTCAGGTGAGTGCCCC-3′)，參與HCN4基因轉(zhuǎn)錄。

*:與Sham組比較,P<0.05；+:與CCI+Vehicle組比較,P<0.05,n= 4～6。圖2 各組大鼠脊髓背角HCN4的表達

*:與Sham組比較,P<0.05；+:與CCI+Vehicle組比較,P<0.05,n=4。圖3 各組大鼠脊髓背角PKA、p-PKA、CaMKⅡ、p-CaMKⅡ、CREB和p-CREB的表達

CREB：探針與DNA-轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合條帶；NS：non-specific band，非特異條帶；NP：no protein，未加入蛋白提取物； UP:unlabeled probe，無標記探針。圖4 CREB 與HCN4啟動子區(qū)域DNA結(jié)合活性

3 討論

在脊髓背角，HCN4通道表達于抑制性中間神經(jīng)元和PKCγ+興奮性中間神經(jīng)元，參與神經(jīng)痛的形成與維持。在本試驗中，鞘內(nèi)注射PKA 抑制劑H-89、CaMKⅡ抑制劑KN-93或CREB抑制劑Naphthol AS-E均可以減輕大鼠坐骨神經(jīng)結(jié)扎導致的機械痛敏，同時抑制脊髓背角HCN4在mRNA和蛋白水平的表達，提示HCN4的表達受PKA、CaMKⅡ及轉(zhuǎn)錄因子CREB的調(diào)控。

cAMP 是一種細胞內(nèi)的第二信使物質(zhì)，胞內(nèi) cAMP 濃度升高和隨后的PKA激活均有助于背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元 HCN 通道開放并形成凈內(nèi)向電流，感覺神經(jīng)元興奮性增加，引起痛覺敏化[15]。目前已發(fā)現(xiàn)的4種HCN 通道(HCN1-4)中，對 cAMP的反應(yīng)敏感性依次為：HCN4>HCN2>HCN3>HCN1[4,16]。本試驗中，鞘內(nèi)注射PKA 抑制劑H-89導致CCI大鼠脊髓背角PKA表達下降，磷酸化減弱，同時也下調(diào)HCN4在mRNA和蛋白水平的表達?？梢?，PKA激活不僅有助于HCN4通道開放，也有助于其轉(zhuǎn)錄表達。

在神經(jīng)痛的發(fā)生和維持過程中，背角cAMP/PKA通路的激活促進CaMKII活化和其下游轉(zhuǎn)錄因子CREB磷酸化，特別是CREB的Ser-133位點磷酸化直接受PKA和CaMKII的調(diào)控[12-13,17]。 本試驗分別鞘內(nèi)注射KN-93或Naphthol AS-E，隨后CCI大鼠脊髓背角CaMKII和CREB的表達及磷酸化程度均減弱，HCN4在mRNA和蛋白水平的表達明顯下降。更重要的是，鞘內(nèi)注射PKA抑制劑H-89導致CCI大鼠背角CaMKII和CREB的表達及磷酸化程度均減弱，這說明PKA的激活有助于CaMKII和CREB的表達及磷酸化，而CaMKII和CREB的激活對于HCN4的轉(zhuǎn)錄和蛋白表達也非常重要。

CREB是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，其C端的亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)既可以與靶基因的經(jīng)典cAMP反應(yīng)元件(cAMP response element，CRE，含5'-TGACGTCA-3′回文序列) 結(jié)合，或與CRE變體序列5′-TGATGTCA-3′結(jié)合，也可以與非經(jīng)典CRE序列(如5′-AGGCGTGG-3′或5′-AGGATGCG-3′等)結(jié)合并啟動靶基因轉(zhuǎn)錄[18]。Smith等[19]針對哺乳動物(如人、大鼠、小鼠以及狗)的基因組序列進行研究，觀察到5′-TGATGTCA-3′是最常見的CRE變體序列。本試驗檢測到CREB可以識別并結(jié)合到HCN4啟動子區(qū)域242-249bp序列(5′-TGATGTCA-3′，為哺乳動物體內(nèi)最常見的CRE變體序列)，促進HCN4基因轉(zhuǎn)錄。在HCN4啟動子序列中并沒有檢測到經(jīng)典cAMP反應(yīng)元件的存在。因此，初步推測，在CCI大鼠脊髓背角HCN4的轉(zhuǎn)錄增加，是由于轉(zhuǎn)錄因子CREB磷酸化之后，進入細胞核，結(jié)合到HCN4啟動子的CRE變體序列(5′-TGATGTCA-3′)，促進HCN4的轉(zhuǎn)錄和隨后的蛋白表達。鞘內(nèi)注射H-89或KN-93明顯下調(diào)神經(jīng)痛大鼠脊髓背角CREB與HCN4啟動子之間的結(jié)合活性，說明CREB與HCN4啟動子之間的結(jié)合受到PKA和CaMKII的調(diào)控。

在脊髓背角神經(jīng)元，主要表達兩種腺苷酸環(huán)化酶(Adenylate cyclase，AC)，即ACⅠ 和ACⅧ。當胞質(zhì)中Ca2+濃度上升時，與鈣調(diào)蛋白結(jié)合為Ca2+/鈣調(diào)蛋白復合物，迅速激活ACⅠ和ACⅧ[20]；其中，磷酸化的CREB既可以與ACⅧ啟動子區(qū)域的CRE位點結(jié)合，促進ACⅧ 的轉(zhuǎn)錄生成[21]，也可以與NMDA受體的NR1和NR2亞單位啟動子結(jié)合促進其轉(zhuǎn)錄生成[22]。本試驗中，鞘內(nèi)注射CREB抑制劑NaphtholAS-E明顯抑制CCI大鼠脊髓背角PKA和CaMKII的表達及磷酸化。這可能有兩個原因：CREB表達及磷酸化程度下降，一方面導致ACⅧ生成減少，不能促進cAMP生成和PKA磷酸化，另一方面導致NMDA受體表達和激活減弱，神經(jīng)元Ca2+內(nèi)流減弱，Ca2+/鈣調(diào)蛋白復合物生成減少，無法充分激活ACⅠ和ACⅧ，導致cAMP生成和PKA磷酸化減弱，CaMKII的表達及磷酸化也相應(yīng)減弱。此外，本試驗中，鞘內(nèi)注射CaMKII抑制劑KN-93可以通過抑制CREB的表達及活性，間接導致CCI大鼠脊髓背角PKA表達及磷酸化減弱。

綜上所述，在坐骨神經(jīng)損傷的神經(jīng)痛大鼠，脊髓背角PKA、CaMKII和CREB的表達及磷酸化程度增強，其中，PKA和CaMKII的激活明顯促進轉(zhuǎn)錄因子CREB活化，導致CREB與HCN4啟動子序列上的CRE變體序列(5′-TGATGTCA-3′)結(jié)合，這促進了HCN4在mRNA和蛋白水平的表達。有關(guān)HCN4的表達調(diào)控機制的探討有助于研發(fā)以HCN4作為靶點的新型鎮(zhèn)痛藥物，將來應(yīng)用于臨床，通過抑制HCN4表達，間接下調(diào)感覺神經(jīng)元興奮性，從而發(fā)揮鎮(zhèn)痛效應(yīng)。