不同脫苦處理對骨膠原蛋白肽品質(zhì)及抗氧化特性的影響

趙 欣，成曉瑜，張順亮，王 樂，岳宜靜，劉博文，王 輝

（中國肉類食品綜合研究中心，北京食品科學(xué)研究院，肉類加工技術(shù)北京市重點(diǎn)實驗室，北京 100068）

骨膠原蛋白肽是指膠原蛋白經(jīng)酶解、分離純化等手段制備的產(chǎn)物，相對于膠原蛋白更易于被人體吸收，具有抗氧化、延緩皮膚老化、預(yù)防動脈粥樣硬化、促進(jìn)骨細(xì)胞生長等一系列生理活性[1-2]，在食品、醫(yī)療等方面具有廣闊的應(yīng)用前景。可用作增稠劑、乳化劑、穩(wěn)定劑、澄清劑等食品添加劑；降血壓、補(bǔ)鈣和促進(jìn)腸道吸收等保健品；控制肥胖、促進(jìn)傷口愈合、治療骨質(zhì)疏松等醫(yī)療用品[3]。此外，膠原蛋白是動物骨中的主要蛋白，骨膠原蛋白肽的生產(chǎn)可提高畜禽屠宰副產(chǎn)物的利用價值，減少環(huán)境污染，產(chǎn)生更高的社會效益和經(jīng)濟(jì)效益。

骨膠原蛋白肽的提取方法通常包括酸法提取、堿法提取、中性鹽提取及酶法提取，其中酶法提取應(yīng)用較為廣泛[4]。膠原蛋白肽的功能特性與酶的類型和水解條件有關(guān)。邵燕秋等[5]優(yōu)化鰻魚骨膠原蛋白血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽的制備方法，其中堿性蛋白酶為最適水解酶，且在溫度50 ℃、質(zhì)量濃度15 g/L、酶解時間5.25 h、加酶量3.1%、pH 9.2條件下得到的水解產(chǎn)物有較好的抑制率；毛嘉敏等[6]研究表明，驢骨蛋白經(jīng)木瓜蛋白酶酶解，可制備有螯合亞鐵離子能力的驢骨膠原肽，具有促進(jìn)鐵吸收的潛力；鄭平安等[7]通過對胰酶、中性蛋白酶、復(fù)合蛋白酶等6 種常見工業(yè)酶進(jìn)行對比，發(fā)現(xiàn)胰酶對鱘魚軟骨的酶解效果最好，適用于鱘魚軟骨Ⅱ型膠原蛋白的提取。然而，研究表明，骨膠原蛋白肽在酶解提取過程中會導(dǎo)致疏水氨基酸的暴露和一些苦味肽的產(chǎn)生，造成產(chǎn)品具有消費(fèi)者所不能接受的苦味，從而對骨膠原蛋白肽的口感產(chǎn)生不利影響[8]?？辔冻蔀橄拗乒悄z原蛋白肽在食品及醫(yī)療行業(yè)中使用的一個主要因素，脫苦技術(shù)的研發(fā)對骨膠原蛋白肽的生產(chǎn)及應(yīng)用具有重要的意義。目前多使用掩蓋法和酶法對肽進(jìn)行脫苦。β-環(huán)糊精由于具有特殊的內(nèi)部疏水結(jié)構(gòu)，是一種良好的苦味掩蓋劑，可通過捕獲疏水肽而降低苦味，在藥物和食品中得到廣泛應(yīng)用[9]。乳鐵蛋白因具有疏水性區(qū)域，可被用作苦味分子的納米載體，可作為肽的苦味掩蓋劑[10]。外肽酶在肽的酶法脫苦中具有良好的應(yīng)用，依據(jù)其作用位點(diǎn)的不同分為氨基肽酶和羧基肽酶兩大類，二者分別從肽基質(zhì)的N末端和C末端進(jìn)行催化水解。而肽鏈C末端疏水性對苦味的影響更大，研究表明，酶解處理，特別是具有外肽酶活性的風(fēng)味蛋白酶可以降低苦味，并被用作脫苦劑，因為它能夠去除C末端疏水氨基酸[11]，并產(chǎn)生獨(dú)特的風(fēng)味[12]。

因此，本研究比較分析不同的脫苦技術(shù)（不同比例β-環(huán)糊精、乳鐵蛋白和風(fēng)味蛋白酶）對骨膠原蛋白肽苦味強(qiáng)度及脫苦效率的影響，結(jié)合疏水性、游離氨基酸含量、傅里葉變換紅外光譜對其脫苦原理進(jìn)行分析。此外，還闡明了所得脫苦產(chǎn)物的產(chǎn)品特性和抗氧化活性，為開發(fā)低苦度骨膠原蛋白肽產(chǎn)品提供技術(shù)支持和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

骨膠原蛋白肽（通過酶法制備，分子質(zhì)量在2 000 Da以下） 包頭東寶生物技術(shù)股份有限公司；β-環(huán)糊精（食品級） 河南萬邦化工科技有限公司；乳鐵蛋白（食品級） 河南深藍(lán)食品配料有限公司；風(fēng)味蛋白酶諾維信（中國）生物制藥有限公司。

鹽酸、5-磺基水楊酸、溴酚藍(lán)、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH） 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；總抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）檢測試劑盒（鐵離子還原抗氧化能力（ferric ion reducing antioxidant power，F(xiàn)RAP）法）北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

AM-3高速勻漿機(jī) 日本Nihonseiki Kaisha公司；CR-400色差計 柯尼卡美能達(dá)投資有限公司；Synergv H4酶標(biāo)儀 美國伯騰儀器有限公司；TS5000Z味覺分析系統(tǒng) 日本Insent公司；L-8900高速全自動氨基酸分析儀 日本日立公司；Nicolet iSl0 FTIR傅里葉變換紅外光譜儀 美國Thermo Scientific公司。

1.3 方法

1.3.1 骨膠原蛋白肽的酶解脫苦

將骨膠原蛋白肽配制為100 g/L的溶液，在溶液中分別加入不同比例的風(fēng)味蛋白酶（500 LAPU/g、pH 7.0、50 ℃），使風(fēng)味蛋白酶在骨膠原蛋白肽溶液中的最終質(zhì)量濃度分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 g/100 mL，水解1 h，沸水浴10 min滅酶，8 000 r/min離心15 min，取上清液，于-80 ℃預(yù)凍4 h，在真空度15 Pa條件下，樣品溫度由-40 ℃升溫至30 ℃，冷阱溫度保持在-45 ℃的條件下真空冷凍干燥36 h。

1.3.2 骨膠原蛋白肽的β-環(huán)糊精、乳鐵蛋白方法脫苦

將骨膠原蛋白肽樣品與蒸餾水以1∶4（m/V）的比例混合，然后在38 ℃下孵育30 min，并在搖床上持續(xù)振蕩。然后，將β-環(huán)糊精及乳鐵蛋白分別以不同比例添加到溶液中，使β-環(huán)糊精、乳鐵蛋白在骨膠原蛋白肽溶液中的最終質(zhì)量濃度分別為1、2、3、4、5 g/100 mL。在38 ℃下連續(xù)振蕩孵育30 min，8 000 r/min離心15 min，取上清液，于-80 ℃預(yù)凍4 h，在真空度15 Pa條件下，樣品溫度由-40 ℃升溫至30 ℃，冷阱溫度保持在-45 ℃的條件下真空冷凍干燥36 h。

1.3.3 感官分析

苦味值的測定采用感官分析法進(jìn)行，參照Gao Yi等[13]的方法，并適當(dāng)調(diào)整。篩選12 名22～35 歲的感官評價成員組成小組，進(jìn)行苦味值評價。制備不同質(zhì)量濃度的苦味溶液作為苦味標(biāo)準(zhǔn)品，分別將純水及20、40、60、80、100 mg/L奎寧標(biāo)準(zhǔn)品溶液的苦味強(qiáng)度定為0、2、4、6、8、10。訓(xùn)練評價成員對標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行打分以使得評價成員經(jīng)培訓(xùn)后均能分辨出不同苦味強(qiáng)度的樣品，且評價標(biāo)準(zhǔn)相對一致。每個樣品重復(fù)評價3 次，樣品評價的時間選取3 d內(nèi)的相同時間段。

1.3.4 電子舌分析

通過電子舌系統(tǒng)進(jìn)行測量。將骨膠原蛋白肽樣品與蒸餾水以1∶6（m/V）的比例混合，然后在38 ℃下孵育30 min，并在搖床上持續(xù)振蕩，使骨膠原蛋白肽充分溶解。待樣品恢復(fù)至室溫，進(jìn)行電子舌測試，每個樣品數(shù)據(jù)重復(fù)采集4 次，采集時間為120 s，取3 次誤差最小值為每個樣本的測量數(shù)據(jù)。

1.3.5 色澤測定

樣品的亮度值（L*）、紅度值（a*）、黃度值（b*）和總色差（ΔE）根據(jù)Singh等[14]的方法進(jìn)行測定。

1.3.6 表面疏水性測定

參考王宏偉等[15]的方法測定并稍做修改，將樣品質(zhì)量濃度調(diào)整至2.5 mg/mL，通過溴酚藍(lán)的結(jié)合量表示表面疏水性。向1 mL骨膠原蛋白肽中加入200 μL l mg/mL溴酚藍(lán)溶液并充分混合，對照組為向1 mL蒸餾水中加入200 μL l mg/mL溴酚藍(lán)溶液，樣品在室溫下攪拌10 min，4 000 r/min離心10 min，將上清液稀釋10 倍，在595 nm波長處測定吸光度，溴酚藍(lán)結(jié)合量按式（1）計算。

1.3.7 游離氨基酸含量測定

參照Liu Chunsheng等[16]的方法進(jìn)行。準(zhǔn)確稱量1 g樣品，加入15 mL 0.02 mol/L稀鹽酸，充分均質(zhì)后用超聲波清洗5 min，然后用冷凍離心機(jī)（5 000 r/min、4 ℃）離心10 min，取上清液，用0.02 mol/L稀鹽酸定容至50 mL。定容后轉(zhuǎn)移2 mL，加入2 mL體積分?jǐn)?shù)5%磺基水楊酸溶液，經(jīng)0.22 μm水相濾膜過濾，氨基酸分析儀上機(jī)測定，進(jìn)樣量為20 μL，樣品經(jīng)陽離子交換柱分離，于115～120 ℃進(jìn)行顯色反應(yīng)，生成的紫色物質(zhì)在570 nm波長處進(jìn)行比色測定，生成的黃色化合物在440 nm波長處進(jìn)行比色測定。進(jìn)行3 組平行實驗，測定結(jié)果取平均值。

1.3.8 傅里葉變換紅外光譜分析

參照趙冰等[17]的方法，并稍作修改。用傅里葉變換紅外光譜儀對4 000～400 cm-1區(qū)域的所有光譜進(jìn)行掃描分析。

1.3.9 抗氧化活性測定

使用T-AOC檢測試劑盒對骨膠原蛋白肽的抗氧化活性進(jìn)行測定。

DPPH自由基清除率測定：參照鄭輝等[18]的方法并適當(dāng)調(diào)整。取1 mL 2.5 mg/mL樣品溶液與1 mL 0.01 mg/mL DPPH無水乙醇溶液，混勻，避光靜置30 min后，5 000 r/min離心10 min，取上清液測定其在517 nm波長處的吸光度。DPPH自由基清除率按式（2）計算。

式中：Ai為1 mL 2.5 mg/mL樣品溶液+1 mL空白試劑（無水乙醇）的吸光度；Aj為1 mL 2.5 mg/mL樣品溶液與1 mL 0.01 mg/mL DPPH無水乙醇溶液的吸光度；A0為1 mL 0.01 mg/mL DPPH溶液+空白試劑（無水乙醇）的吸光度。

2,2’-聯(lián)氮-雙-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)（2,2’-azinobis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS）陽離子自由基清除率測定：7 mmol/L ABTS溶液和2.45 mmol/L過硫酸鉀溶液（體積比1∶1）充分混勻后室溫下反應(yīng)12 h，形成ABTS陽離子儲備液，于4 ℃條件下貯存?zhèn)溆?。使用前用無水乙醇對ABTS陽離子儲備液進(jìn)行適當(dāng)稀釋，調(diào)整其在734 nm波長處的吸光度為0.70f0.02，得到ABTS陽離子工作液。取0.2 mL 2.5 mg/mL樣品與1.9 mL ABTS陽離子工作液混勻，室溫反應(yīng)60 min后，在734 nm波長處測定吸光度[19]，其中，以蒸餾水代替ABTS陽離子工作液體系作為樣品對照，蒸餾水代替樣品溶液作為空白。ABTS陽離子自由基清除率按式（3）計算。

式中：A0為蒸餾水代替ABTS陽離子工作體系的吸光度；A1為蒸餾水代替樣品溶液體系的吸光度；A2為樣品溶液與ABTS陽離子工作液混合體系的吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 19軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析（P＜0.05），Origin 2021軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同脫苦處理對骨膠原蛋白肽感官的影響

由表1可知，與所有處理過的樣品相比，對照組的苦味得分最高（P＜0.05）。這可能是由于骨膠原蛋白肽在制備過程中，蛋白的疏水結(jié)構(gòu)暴露，導(dǎo)致苦味增加[19]?？辔吨饕c位于肽的C末端和N末端的疏水性氨基酸有關(guān)，且疏水性氨基酸位于C末端時肽的苦味強(qiáng)于位于N末端[20]。當(dāng)用β-環(huán)糊精處理骨膠原蛋白肽時，隨著β-環(huán)糊精添加量的增加，苦味評分降低?？辔兜臏p少可能與β-環(huán)糊精的特殊結(jié)構(gòu)有關(guān)，疏水性內(nèi)部空腔結(jié)構(gòu)可以吸引疏水氨基酸，減少它們與味覺受體的接觸，從而降低苦味[9]。此外，β-環(huán)糊精自身帶有的甜味可能也會對苦味起到一定抑制作用。然而，本研究的結(jié)果顯示，含有4、5 g/100 mLβ-環(huán)糊精的樣品的苦味評分沒有顯著差異。這可能是因為4 g/100 mL的β-環(huán)糊精分子數(shù)量足以捕獲苦味分子，添加更多量的苦味抑制劑不會產(chǎn)生更強(qiáng)的脫苦作用。隨著乳鐵蛋白的增加，骨膠原蛋白肽苦味評分降低，這可能與乳鐵蛋白的疏水作用有關(guān)[10]。骨膠原蛋白肽經(jīng)風(fēng)味蛋白酶水解后苦味評分降低。然而，當(dāng)酶劑量增加到1.5 g/100 mL時，苦味評分不再降低。這可能是由于風(fēng)味蛋白酶的活性和切割位點(diǎn)有限，部分疏水性氨基酸仍然位于多肽的末端或以游離肽的形式出現(xiàn)?？偟膩碚f，添加不同量的β-環(huán)糊精、乳鐵蛋白及風(fēng)味蛋白酶均可有效降低骨膠原蛋白肽的苦味，添加4 g/100 mLβ-環(huán)糊精、5 g/100 mL乳鐵蛋白及1.5 g/100 mL風(fēng)味蛋白酶對骨膠原蛋白肽苦味降解有更好的效果，其中苦味評分排序為1.5 g/100 mL風(fēng)味蛋白酶＜4 g/100 mLβ-環(huán)糊精＜5 g/100 mL乳鐵蛋白，且添加4 g/100 mLβ-環(huán)糊精與5 g/100 mL乳鐵蛋白苦味評分之間無顯著差異。

表1 骨膠原蛋白肽的苦味評分Table 1 Bitterness score of bone collagen peptide

2.2 不同脫苦處理對骨膠原蛋白肽電子舌測定結(jié)果的影響

根據(jù)2.1節(jié)感官評分結(jié)果，選擇添加4 g/100 mLβ-環(huán)糊精、5 g/100 mL乳鐵蛋白及1.5 g/100 mL風(fēng)味蛋白酶處理的骨膠原蛋白肽進(jìn)行進(jìn)一步研究。電子舌可以進(jìn)行更客觀、準(zhǔn)確的分值評估，從而避免感官評分存在的一些不穩(wěn)定性。

由圖1可知，電子舌的苦味測定結(jié)果與苦味感官評分趨勢一致，經(jīng)過不同的脫苦處理后骨膠原蛋白肽的苦味值均顯著下降（P＜0.05）。添加1.5 g/100 mL的風(fēng)味蛋白酶苦味值最低，這可能是由于風(fēng)味蛋白酶的外切作用可釋放多肽鏈末端的疏水氨基酸，從而降低苦味，但與此同時會增加其澀味和苦味回味強(qiáng)度。風(fēng)味蛋白酶降解后其鮮味、咸味及鮮味回味顯著提升。研究表明，酶水解過程中會產(chǎn)生一些咸味及鮮味成分[21-23]。

圖1 不同脫苦處理條件下骨膠原蛋白肽的電子舌得分Fig. 1 Electronic tongue scores for taste intensity of bone collagen peptide under different debittering conditions

2.3 不同脫苦處理對骨膠原蛋白肽色澤的影響

由表2可知，添加4 g/100 mLβ-環(huán)糊精后骨膠原蛋白肽在L*、a*和b*方面無顯著變化，說明β-環(huán)糊精對骨膠原蛋白肽色澤影響較小。經(jīng)乳鐵蛋白處理的骨膠原蛋白肽L*、a*顯著高于其他組（P＜0.05），且ΔE最高，表明乳鐵蛋白脫苦處理后的樣品和對照組（骨膠原蛋白肽）之間的顏色差異較大，這可能與乳鐵蛋白自身的色澤有關(guān)，乳鐵蛋白呈粉紅色，可顯著改善骨膠原蛋白肽的色澤。而添加1.5 g/100 mL風(fēng)味蛋白酶后L*顯著下降，b*顯著上升。

表2 不同脫苦處理對骨膠原蛋白肽色度的影響Table 2 Effects of different debittering treatments on color parameters of bone collagen peptide

2.4 不同脫苦處理對骨膠原蛋白肽表面疏水性的影響

骨膠原蛋白肽在生產(chǎn)過程中會經(jīng)歷蛋白的水解或降解，通常會導(dǎo)致隱藏的疏水氨基酸暴露，并伴有苦味[24-25]。表面疏水性是肽呈苦味的主要原因之一[26]。由圖2可知，未經(jīng)脫苦處理的骨膠原蛋白肽具有最高的表面疏水性，這可能是由于骨膠原蛋白肽結(jié)構(gòu)中存在大量的疏水結(jié)構(gòu)，暴露在表面的疏水基團(tuán)較多，因此具有苦味[27]。骨膠原蛋白肽在經(jīng)4 g/100 mLβ-環(huán)糊精、5 g/100 mL乳鐵蛋白處理后顯示出較低的表面疏水性（P＜0.05），這可能與β-環(huán)糊精及乳鐵蛋白的特殊結(jié)構(gòu)有關(guān)，通過疏水相互作用，導(dǎo)致表面疏水性顯著降低[28]。這與2.2節(jié)4 g/100 mLβ-環(huán)糊精及5 g/100 mL乳鐵蛋白處理的樣品苦味強(qiáng)度降低程度相一致。同樣，經(jīng)1.5 g/100 mL風(fēng)味蛋白酶處理的骨膠原蛋白肽的表面疏水性也顯著降低（P＜0.05），這可能是由于一些疏水殘基被風(fēng)味蛋白酶切割。因此，本研究表明，3 種方式均能顯著降低骨膠原蛋白肽的表面疏水性，從而降低苦味強(qiáng)度。

圖2 不同脫苦處理對骨膠原蛋白肽表面疏水性的影響Fig. 2 Effect of different debittering treatments on hydrophobicity of bone collagen peptide

2.5 不同脫苦處理對骨膠原蛋白肽游離氨基酸含量的影響

由表3可知，骨膠原蛋白肽中含量較高的氨基酸包括丙苯氨酸（339.04 mg/100 g）、天冬氨酸（42.65 mg/100 g）、半胱氨酸（37.43 mg/100 g）和精氨酸（34.73 mg/100 g），且疏水性氨基酸含量較高，占總游離氨基酸的75.81%。骨膠原蛋白肽經(jīng)4 g/100 mLβ-環(huán)糊精及5 g/100 mL乳鐵蛋白處理后疏水性氨基酸含量顯著降低（P＜0.05），疏水性氨基酸占比分別為66.85%和68.11%，說明4 g/100 mLβ-環(huán)糊精及5 g/100 mL乳鐵蛋白脫苦處理會導(dǎo)致疏水性氨基酸減少。β-環(huán)糊精對疏水性氨基酸具有親和性，可通過形成包合物降低苦味[29]。而骨膠原蛋白肽經(jīng)1.5 g/100 mL風(fēng)味蛋白酶水解后總游離氨基酸和疏水性游離氨基酸含量均有所增加，但是疏水性游離氨基酸所占比例下降，總游離氨基酸含量顯著升高至4 224.32 mg/100 g（P＜0.05），其中疏水性氨基酸含量達(dá)到3 084.98 mg/100 g，這說明酶解過程中降解產(chǎn)生了更多的游離氨基酸。在風(fēng)味蛋白酶水解過程中，可能位于C端的大量疏水性氨基酸被釋放出來，呈游離狀態(tài)，C端苦味氨基酸的脫除有利于減少苦味肽的平均疏水性，降低苦味肽的苦味[30]。此外，經(jīng)4 g/100 mLβ-環(huán)糊精、5 g/100 mL乳鐵蛋白、1.5 g/100 mL風(fēng)味蛋白酶處理后鮮味氨基酸（天冬氨酸+甘氨酸）含量分別提高23.45%、30.48%和56.49%。研究表明，水解可導(dǎo)致扇貝肽中鮮味氨基酸（天冬氨酸和甘氨酸）增加[31]。β-環(huán)糊精能夠改善小麥面筋蛋白酶解后的鮮味[32]。

表3 不同脫苦處理對骨膠原蛋白肽游離氨基酸含量的影響Table 3 Effects of different debittering treatments on free amino acid contents of bone collagen peptide mg/100 g

2.6 不同脫苦處理對骨膠原蛋白肽傅里葉變換紅外光譜的影響

由圖3可知，酰胺A和酰胺B分別在3 417～3 428、2 961～2 963 cm-1范圍內(nèi)。酰胺A代表與氫鍵結(jié)合的NH拉伸，酰胺B代表—CH—拉伸（不對稱和對稱拉伸）和—NH+3[33]。在3 426.9 cm-1處觀察到的經(jīng)β-環(huán)糊精和風(fēng)味蛋白酶處理的骨膠原蛋白肽的酰胺A在進(jìn)行脫苦后轉(zhuǎn)移到更低的波數(shù)（3 425.0、3 417.2 cm-1），而經(jīng)乳鐵蛋白處理的骨膠原蛋白肽在進(jìn)行脫苦時轉(zhuǎn)移到更高的波數(shù)（3 428.3 cm-1）。這可能由于不同脫苦處理導(dǎo)致肽鏈上NH基團(tuán)的氫鍵增加或減少[34]。經(jīng)脫苦處理后骨膠原蛋白肽的酰胺B帶（2 961.2 cm-1）向較高的波數(shù)（2 963.1 cm-1）移動，表明不同苦味抑制劑和NH3基團(tuán)之間的相互作用[35]。多肽骨架CüO伸縮振動范圍為1 600～1 700 cm-1，1 648.6～1 651.3 cm-1的吸收峰證實了NüH伸縮和CüO之間形成氫鍵。骨膠原蛋白肽在1 548.1、1 541.5 cm-1處的酰胺Ⅱ帶，以及在1 243.9～1 248.2 cm-1的酰胺Ⅲ帶，分別代表NüH彎曲振動、CüN拉伸振動和CüH拉伸。對照組及添加β-環(huán)糊精、乳鐵蛋白的骨膠原蛋白肽顯示出較低強(qiáng)度的酰胺Ⅰ和Ⅱ帶，并且酰胺Ⅲ帶幾乎不存在。這些變化表明骨膠原蛋白肽存在較大的結(jié)構(gòu)紊亂[36]，可能與三螺旋狀態(tài)的喪失有關(guān)。然而，經(jīng)風(fēng)味蛋白酶水解后的骨膠原蛋白肽顯示出明顯的酰胺Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ帶。因此，酶解后骨膠原蛋白肽的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。表明不同脫苦處理可以通過改變骨膠原蛋白肽的構(gòu)象來降低其苦味程度。

圖3 不同脫苦處理條件下骨膠原蛋白肽的傅里葉變換紅外光譜Fig. 3 Fourier infrared spectra of bone collagen peptide of bone under different debittering treatments

2.7 不同脫苦處理對骨膠原蛋白肽抗氧化活性的影響

DPPH自由基清除率是用來表示化合物自由基清除能力或作為H供體的一項抗氧化指標(biāo)[12,14]。由圖4可知，經(jīng)4 g/100 mLβ-環(huán)糊精及5 g/100 mL乳鐵蛋白處理后骨膠原蛋白肽的DPPH自由基清除活性顯著降低（P＜0.05），這可能與β-環(huán)糊精脫苦過程中疏水肽或疏水結(jié)構(gòu)域的損失有關(guān)（P＜0.05）。而經(jīng)1.5 g/100 mL風(fēng)味蛋白酶水解后骨膠原蛋白肽的DPPH自由基清除能力顯著上升（P＜0.05），這可能是由于骨膠原蛋白肽經(jīng)風(fēng)味蛋白酶進(jìn)一步水解后產(chǎn)生更多的小分子肽，作為電子供體與自由基反應(yīng)，將其轉(zhuǎn)化為不容易氧化的產(chǎn)物，進(jìn)而停止自由基的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)[15]。

圖4 不同脫苦處理條件下骨膠原蛋白肽的DPPH自由基清除能力Fig. 4 DPPH radical scavenging capacity of bone collagen peptide under different debittering treatments

此外，通過風(fēng)味蛋白酶水解釋放的一系列疏水性氨基酸也會提高多肽的抗氧化能力。T-AOC采用FRAP法測定，用來表示化合物通過向自由基提供電子將Fe3+-三吡啶三吖嗪合物還原為Fe2+-三吡啶三吖嗪復(fù)合物的能力[37]。由圖5可知，未經(jīng)脫苦處理的骨膠原蛋白肽樣品比經(jīng)β-環(huán)糊精及乳鐵蛋白處理的樣品具有更高的T-AOC（P＜0.05），這可能與不同脫苦處理后骨膠原蛋白肽的結(jié)構(gòu)有關(guān)。研究表明，含有更高疏水性肽或芳香族氨基酸的水解物通常具有較高的還原活性[38]。此外，經(jīng)1.5 g/100 mL風(fēng)味蛋白酶水解的骨膠原蛋白肽具有最高的還原活性，說明經(jīng)風(fēng)味蛋白酶水解的骨膠原蛋白肽更容易形成良好的抗氧化物質(zhì)[39]。

圖5 不同脫苦處理條件下骨膠原蛋白肽的T-AOCFig. 5 T-AOC of bone collagen peptide under different debittering treatments

ABTS實驗用于確定抗氧化劑對抗脂質(zhì)過氧自由基和親水性自由基的能力[37]。由圖6可知，未經(jīng)脫苦處理的骨膠原蛋白肽比經(jīng)4 g/100 mLβ-環(huán)糊精及5 g/100 mL乳鐵蛋白處理后的膠原蛋白肽具有更高的ABTS陽離子自由基清除活性（P＜0.05），這可能與其較高的疏水肽含量有關(guān)。而經(jīng)1.5 g/100 mL風(fēng)味蛋白酶水解的骨膠原蛋白肽ABTS陽離子自由基清除活性最高，為78.34%。綜上所述，使用β-環(huán)糊精和乳鐵蛋白處理可降低苦味強(qiáng)度，但會導(dǎo)致骨膠原蛋白肽抗氧化性的降低，而經(jīng)風(fēng)味蛋白酶水解可以改善其抗氧化性能。

圖6 不同脫苦處理條件下骨膠原蛋白肽的ABTS陽離子自由基清除能力Fig. 6 ABTS radical cation scavenging capacity of bone collagen peptide under different debittering treatments

3 結(jié) 論

本實驗研究不同脫苦處理對骨膠原蛋白肽的品質(zhì)及抗氧化特性的影響，結(jié)果表明：不同脫苦處理均能有效地降低骨膠原蛋白肽的苦味強(qiáng)度和表面疏水性，其中經(jīng)1.5 g/100 mL風(fēng)味蛋白酶水解的骨膠原蛋白肽苦味評分最低，為3.34；苦味掩蓋劑（4 g/100 mLβ-環(huán)糊精、5 g/100 mL乳鐵蛋白）處理可顯著降低骨膠原蛋白肽的疏水性游離氨基酸含量（P＜0.05），而酶解法（1.5 g/100 mL風(fēng)味蛋白酶）可降低疏水性氨基酸占比；不同脫苦處理可通過影響氨基酸官能團(tuán)引起肽的結(jié)構(gòu)變化，從而達(dá)到脫苦效果；相對苦味掩蓋劑（4 g/100 mLβ-環(huán)糊精、5 g/100 mL乳鐵蛋白）而言，經(jīng)1.5 g/100 mL風(fēng)味蛋白酶水解的骨膠原蛋白肽具有更高的抗氧化活性。綜合比較，1.5 g/100 mL風(fēng)味蛋白酶的脫苦效果及抗氧化活性最佳，在膠原蛋白肽的脫苦及抗氧化性能提升方面有較大的應(yīng)用價值。