術(shù)前活檢標(biāo)本中腫瘤出芽與結(jié)直腸癌臨床病理學(xué)特征及預(yù)后的相關(guān)性

楊路路,周文斌,王勁松,黃文斌,方 媛

結(jié)直腸癌(colorectal cancer, CRC)是消化系統(tǒng)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,其發(fā)病與遺傳、飲食和生活習(xí)慣等因素有關(guān),隨著人們生活水平的提高,我國(guó)CRC的發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì),轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)是患者死亡的主要原因[1]。內(nèi)鏡下活檢組織病理檢查是早期篩查和診斷CRC的“金標(biāo)準(zhǔn)”,活檢病理診斷的精準(zhǔn)評(píng)估對(duì)患者癌癥風(fēng)險(xiǎn)預(yù)判和個(gè)體化治療具有重要意義。活檢標(biāo)本是從腫瘤淺表區(qū)域獲取的小塊組織,用傳統(tǒng)的組織學(xué)參數(shù)(如浸潤(rùn)深度、脈管神經(jīng)累犯等)評(píng)估腫瘤生物學(xué)行為存在較大的局限性,多數(shù)活檢標(biāo)本只能評(píng)估腫瘤的分化程度。腫瘤出芽是指從腫瘤主體分離出來(lái)的單個(gè)癌細(xì)胞或﹤5個(gè)癌細(xì)胞簇的組織學(xué)形態(tài),腫瘤出芽可能是腫瘤組織侵襲、轉(zhuǎn)移的始發(fā)階段[2-3]。根據(jù)出芽部位可分為腫瘤浸潤(rùn)前沿出芽(peritumoural budding, PTB)和腫瘤內(nèi)出芽(intratumoural budding, ITB)[4-5]。手術(shù)切除標(biāo)本中PTB與CRC侵襲性生物學(xué)行為密切相關(guān)已被較多研究證實(shí),但目前ITB的臨床病理學(xué)意義尚不清楚[6-8]。CRC活檢標(biāo)本中的腫瘤出芽由于位于腫瘤內(nèi)應(yīng)為ITB,其能否作為術(shù)前評(píng)估CRC風(fēng)險(xiǎn)分層的臨床病理學(xué)參數(shù),以及與PTB之間的關(guān)系目前國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道甚少,國(guó)內(nèi)尚無(wú)相關(guān)報(bào)道。由于炎癥和促纖維間質(zhì)反應(yīng)等有時(shí)會(huì)干擾腫瘤出芽的判斷,本實(shí)驗(yàn)采用CKpan標(biāo)記腫瘤細(xì)胞,觀察144例CRC活檢標(biāo)本和對(duì)應(yīng)手術(shù)切除標(biāo)本中腫瘤出芽形成情況,探討活檢組織中腫瘤出芽與CRC臨床病理學(xué)參數(shù)及預(yù)后的關(guān)系,為CRC的術(shù)前診治和預(yù)后評(píng)估提供更可靠的指標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集2016年1月～2017年12月南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京醫(yī)院(南京市第一醫(yī)院)病理科經(jīng)術(shù)前活檢及對(duì)應(yīng)根治性手術(shù)切除標(biāo)本診斷為結(jié)直腸腺癌144例;其中男性94例,女性50例;年齡27～89歲,平均66歲;腫瘤最大徑1～12 cm,平均4.7 cm。所有患者術(shù)前均未行放、化療和免疫治療。

1.2 方法由兩名高年資病理醫(yī)師采用雙盲法瀏覽每例活檢和根治性手術(shù)切除標(biāo)本的所有HE及免疫組化染色切片,評(píng)估腫瘤出芽及相關(guān)臨床病理學(xué)參數(shù),活檢標(biāo)本參數(shù):ITB、分化程度;手術(shù)切除標(biāo)本參數(shù):PTB、分化程度、浸潤(rùn)深度、脈管浸潤(rùn)(血管或淋巴管)、神經(jīng)累犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、pTNM分期。當(dāng)評(píng)估意見(jiàn)不一致時(shí),在多頭顯微鏡下同時(shí)觀察分析并達(dá)到統(tǒng)一。所有標(biāo)本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定,常規(guī)脫水、石蠟包埋,分別行HE和免疫組化染色。免疫組化染色采用EnVision兩步法,所用一抗CKpan及二抗均購(gòu)自北京中杉金橋公司,所有操作步驟參照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.3 腫瘤出芽評(píng)估活檢標(biāo)本中腫瘤出芽的判讀參照Rogers等[9]的標(biāo)準(zhǔn),即腫瘤間質(zhì)中單個(gè)癌細(xì)胞或﹤5個(gè)癌細(xì)胞組成的細(xì)胞簇,光鏡下(200×,視野面積0.785 mm2)觀察有無(wú)腫瘤出芽,同時(shí)采用CKpan標(biāo)記腫瘤細(xì)胞,對(duì)出芽的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行確認(rèn);手術(shù)切除標(biāo)本中PTB判讀方法同上。

1.4 隨訪(fǎng)隨訪(fǎng)資料通過(guò)電子病歷及電話(huà)隨訪(fǎng)獲取,隨訪(fǎng)時(shí)間為2016年1月～2021年8月?？偵嫫?overall survival, OS)為患者接受手術(shù)之日至隨訪(fǎng)截止時(shí)間或死亡的時(shí)間,無(wú)進(jìn)展生存期(progression-free survival, PFS)為患者從手術(shù)之日到癌癥發(fā)生進(jìn)展(腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移)或死亡的時(shí)間。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,腫瘤出芽與CRC臨床病理學(xué)特征的關(guān)系采用χ2檢驗(yàn)或Fisher精確概率法;活檢標(biāo)本中ITB與手術(shù)切除標(biāo)本中PTB的相關(guān)性采用Spearman分析;生存分析采用Kaplan-Meier函數(shù),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CRC中腫瘤出芽組織學(xué)特征活檢組織腫瘤內(nèi)及手術(shù)切除標(biāo)本腫瘤浸潤(rùn)前沿纖維性間質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)單個(gè)或小灶性腫瘤細(xì)胞從腫瘤性腺體分離;出芽的腫瘤細(xì)胞異型性大,呈多角形或梭形,胞質(zhì)較豐富、嗜酸性,常發(fā)生融合,核深染;免疫組化標(biāo)記CKpan,可以清楚地觀察到出芽的腫瘤細(xì)胞(圖1～6)。

2.2 活檢組織中ITB與CRC臨床病理學(xué)特征的關(guān)系144例CRC活檢標(biāo)本中,ITB 57例,ITB檢出率為39.6%,活檢組織中ITB與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、pTNM分期、分化程度、脈管浸潤(rùn)及神經(jīng)累犯密切相關(guān)(P<0.05),ITB與患者年齡、性別、腫瘤大小和浸潤(rùn)深度無(wú)關(guān)(P>0.05,表1)。

2.3 手術(shù)切除標(biāo)本中PTB與CRC臨床病理學(xué)特征的關(guān)系144例CRC手術(shù)切除標(biāo)本中,PTB 93例,PTB檢出率為64.6%,手術(shù)切除標(biāo)本中PTB與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、pTNM分期、分化程度、脈管浸潤(rùn)及神經(jīng)累犯密切相關(guān)(P<0.05),PTB與患者年齡、性別、腫瘤大小和浸潤(rùn)深度無(wú)關(guān)(P>0.05,表1)。

2.4 CRC活檢標(biāo)本與手術(shù)切除標(biāo)本腫瘤出芽的相關(guān)性相關(guān)性分析顯示:活檢組織中ITB與手術(shù)切除標(biāo)本中PTB的檢出呈正相關(guān)(r=0.510,P<0.05,表2)。

2.5 生存分析134例患者獲得隨訪(fǎng)資料,隨訪(fǎng)時(shí)間1～68個(gè)月(中位隨訪(fǎng)時(shí)間50個(gè)月),死亡39例,生存95例,總生存率為70.90%,無(wú)進(jìn)展生存率為67.16%,其中4例患者發(fā)生肺轉(zhuǎn)移、9例肝轉(zhuǎn)移、1例卵巢轉(zhuǎn)移、4例復(fù)發(fā)。生存分析顯示,活檢標(biāo)本中腫瘤出芽組患者平均OS為(40.86±18.45)個(gè)月,低于無(wú)腫瘤出芽組[(49.93±14.26)個(gè)月],且腫瘤出芽組平均PFS為(36.45±12.16)個(gè)月,低于無(wú)腫瘤出芽組[(48.53±16.06)個(gè)月],兩者差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(POS=0.001、PPFS<0.001),活檢組織中ITB與CRC患者的OS和PFS顯著相關(guān),患者預(yù)后更差(圖7、8)。

圖7 活檢組織中腫瘤內(nèi)出芽與患者總生存率的關(guān)系

圖8 活檢組織中腫瘤內(nèi)出芽與患者無(wú)進(jìn)展生存率的關(guān)系

3 討論

腫瘤出芽是一種腫瘤生物學(xué)行為,是腫瘤侵襲活動(dòng)的重要標(biāo)志,近年來(lái)受到越來(lái)越多學(xué)者的重視[10-13]。腫瘤出芽定義為腫瘤內(nèi)或浸潤(rùn)前沿間質(zhì)中呈未分化的單個(gè)癌細(xì)胞或<5個(gè)癌細(xì)胞的細(xì)胞簇,可分為PTB和ITB。PTB是指腫瘤與正常組織交界處的出芽,在內(nèi)窺鏡、手術(shù)切除標(biāo)本中評(píng)估,ITB是指腫瘤主體內(nèi)的出芽,在手術(shù)、活檢標(biāo)本中均可評(píng)估[4]。目前研究認(rèn)為腫瘤出芽模擬腫瘤上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchiymal, EMT)過(guò)程獲得侵襲轉(zhuǎn)移能力[3]。Brabletz等[14]研究發(fā)現(xiàn),CRC中出芽腫瘤細(xì)胞E-cadherin表達(dá)下調(diào),同時(shí)伴有β-catenin核移位、細(xì)胞極性喪失和成纖維母細(xì)胞形態(tài)的形成;腫瘤出芽還可表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)志物,如EpCAM和CD44s等[15];因此,腫瘤出芽可能是腫瘤生長(zhǎng)或轉(zhuǎn)移的始發(fā)階段,與腫瘤進(jìn)展密切相關(guān)。

國(guó)際抗癌聯(lián)盟(UICC)已正式明確PTB是CRC侵襲性行為與不良預(yù)后的一個(gè)重要指征[4]。Rogers等[16]Meta分析結(jié)果顯示,腫瘤出芽是CRC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、癌癥復(fù)發(fā)和5年生存率的不良預(yù)后因子。李正勇等[17]研究34例T1N0M0期患者,發(fā)現(xiàn)腫瘤出芽是提示CRC經(jīng)內(nèi)鏡切除治療后早期復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移的危險(xiǎn)因素。Ueno等[7]進(jìn)行了一項(xiàng)多中心研究,結(jié)果發(fā)現(xiàn)腫瘤出芽分級(jí)與腫瘤T分期、脈管浸潤(rùn)、神經(jīng)累犯及CEA指標(biāo)等密切相關(guān),出芽級(jí)別與肝、肺、淋巴結(jié)和腹膜轉(zhuǎn)移顯著相關(guān),多因素分析顯示,腫瘤出芽是CRC患者RFS獨(dú)立的預(yù)后因子,還可以預(yù)測(cè)Ⅱ期CRC患者新輔助化療的治療效果。本組前期研究結(jié)果也進(jìn)一步證明PTB與CRC不良病理參數(shù)顯著相關(guān)[18]。

目前CRC活檢標(biāo)本中腫瘤出芽的研究不如手術(shù)切除標(biāo)本研究深入,尚無(wú)統(tǒng)一的評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)。國(guó)際腫瘤出芽發(fā)展共識(shí)(ITBCC)采用熱點(diǎn)區(qū)計(jì)數(shù)腫瘤出芽數(shù)量進(jìn)行分級(jí)(0～4個(gè)為低級(jí)別,5～9個(gè)為中級(jí)別,≥10個(gè)為高級(jí)別),該方法比較適合手術(shù)切除標(biāo)本中腫瘤出芽的評(píng)估;Yamadera等[19]提出2級(jí)分級(jí)系統(tǒng),分為“低級(jí)別(0～9個(gè))”和“高級(jí)別(≥10個(gè))”;Rogers等[9]將活檢標(biāo)本中腫瘤出芽簡(jiǎn)單地分為“陰性”和“陽(yáng)性”。由于活檢標(biāo)本組織小,通常不需要多個(gè)高倍視野評(píng)估,腫瘤出芽較手術(shù)切除標(biāo)本少,本實(shí)驗(yàn)采用有、無(wú)腫瘤出芽進(jìn)行分組,該方法在活檢標(biāo)本中評(píng)估腫瘤出芽具有較好的實(shí)用性。本實(shí)驗(yàn)主要探討活檢組織中腫瘤出芽的臨床意義,對(duì)于其評(píng)估的最佳方法有待進(jìn)一步研究。盡管腫瘤出芽在HE染色下即可觀察,但有時(shí)因炎癥及促纖維間質(zhì)反應(yīng)等干擾腫瘤出芽的識(shí)別,因此在形態(tài)學(xué)難以辨認(rèn)的病例中行CKpan免疫組化染色可以清楚地顯示出芽的腫瘤細(xì)胞,從而減少對(duì)腫瘤出芽的誤判或漏判。

本組活檢標(biāo)本中ITB與CRC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病理分期、分化程度、脈管浸潤(rùn)和神經(jīng)累犯等密切相關(guān),活檢組織中檢出腫瘤出芽者更易發(fā)生脈管內(nèi)癌栓、神經(jīng)累犯及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,腫瘤分級(jí)、分期也更高;且發(fā)現(xiàn)活檢標(biāo)本中ITB與對(duì)應(yīng)手術(shù)切除標(biāo)本中PTB之間存在較強(qiáng)的正相關(guān)性,與Zlobec等[20]研究結(jié)果一致。Zengin等[21]對(duì)82例接受術(shù)前活檢及手術(shù)切除的早期直腸癌(pN0)中腫瘤出芽進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)高級(jí)別腫瘤出芽與淋巴管內(nèi)癌栓、神經(jīng)累犯、高級(jí)別pT分期、侵襲性浸潤(rùn)方式及周緣陽(yáng)性等顯著相關(guān),是判斷早期CRC淋巴結(jié)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的危險(xiǎn)因素。Giger等[22]研究也顯示活檢標(biāo)本中高級(jí)別腫瘤出芽對(duì)CRC淋巴結(jié)受累及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移具有較高的靈敏度及陽(yáng)性預(yù)測(cè)值。本實(shí)驗(yàn)生存分析亦顯示,活檢標(biāo)本中腫瘤出芽患者的OS低于無(wú)腫瘤出芽者,且PFS較無(wú)腫瘤出芽患者明顯縮短,腫瘤出芽患者更易發(fā)生局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。上述研究結(jié)果高度提示活檢組織中腫瘤出芽現(xiàn)象在一定程度上反映了腫瘤主體的生物學(xué)行為,與腫瘤的侵襲性和不良轉(zhuǎn)歸密切相關(guān)。

國(guó)外有研究發(fā)現(xiàn)[9],活檢組織中腫瘤出芽是CRC新輔助放、化療不良腫瘤退縮及患者不良預(yù)后的標(biāo)志,有可能成為患者避免新輔助放、化療的一個(gè)指標(biāo)。Hatthakarnkul等[23]Meta分析顯示,高級(jí)別腫瘤出芽與KRAS突變和MSS/pMMR狀態(tài)顯著相關(guān),這表明KRAS突變和MSS狀態(tài)在腫瘤出芽及腫瘤發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。結(jié)合文獻(xiàn)和本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,在CRC活檢標(biāo)本中評(píng)估腫瘤出芽有助于預(yù)測(cè)CRC的生物學(xué)行為,從而指導(dǎo)臨床選擇合適的治療方案。

綜上所述,活檢標(biāo)本中ITB與對(duì)應(yīng)手術(shù)切除標(biāo)本中PTB之間存在強(qiáng)相關(guān)性,ITB的檢出與腫瘤主體不良病理學(xué)特征密切相關(guān),活檢組織中出現(xiàn)腫瘤出芽有望成為CRC術(shù)前管理的生物學(xué)標(biāo)志物,有助于CRC患者的個(gè)體化治療及預(yù)后評(píng)估。