NTRK基因融合陽(yáng)性甲狀腺乳頭狀癌9例臨床病理特征

付 莎,李陽(yáng)陽(yáng),鄭娜芬,萬(wàn) 歡,王 厥,宋 楊,王海云,歐陽(yáng)能太

甲狀腺癌是常見(jiàn)的內(nèi)分泌系統(tǒng)惡性腫瘤,其中甲狀腺乳頭狀癌(papillary thyroid carcinoma, PTC)約占80%[1]。近年來(lái)甲狀腺癌的檢出率呈逐年上升趨勢(shì)。甲狀腺癌又稱(chēng)為“惰性癌”,但有小部分甲狀腺癌易發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移。酪氨酸激酶受體(receptor tyrosine kinase, RTK)編碼基因融合導(dǎo)致配體非依賴(lài)性二聚化,激活下游MAPK及PI3K/AKT信號(hào)通路,是其發(fā)生機(jī)制之一,常見(jiàn)融合基因包括RET和NTRK[2]。TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)顯示,甲狀腺癌中RET占比最大,其次是NTRK[3]。RET基因融合多見(jiàn)于經(jīng)典型PTC[4],NTRK基因融合在PTC、嗜酸細(xì)胞癌、低分化癌及未分化癌中均有報(bào)道[5-6]。在臨床工作中并非每例PTC患者都有條件進(jìn)行分子檢測(cè),病理醫(yī)師如何在日常診斷工作中根據(jù)組織學(xué)特征篩選出生物學(xué)行為較差的PTC患者,對(duì)該部分患者行二代測(cè)序(next-generation sequencing, NGS)檢測(cè)具有非常重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。文獻(xiàn)報(bào)道RET基因融合的組織學(xué)特征與經(jīng)典型PTC相似,包括乳頭狀結(jié)構(gòu)、毛玻璃樣核、核溝及核內(nèi)假包涵體等。因受限于檢測(cè)方法及發(fā)生率低,目前我國(guó)PTC患者中關(guān)于NTRK基因融合的研究報(bào)道不多,靶向藥物的上市使NTRK基因融合檢測(cè)更具有臨床價(jià)值。本文主要采用NGS檢測(cè)PTC中NTRK基因融合狀態(tài),分析其組織學(xué)及臨床病理特征,為病理醫(yī)師篩選待測(cè)標(biāo)本及臨床治療、預(yù)后提供一定的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集2017年5月～2022年4月在中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院行NGS檢測(cè)的PTC標(biāo)本790例,患者均行超聲引導(dǎo)下細(xì)針穿刺和手術(shù)切除。待測(cè)標(biāo)本均為石蠟組織標(biāo)本。NGS檢測(cè)前均由具有5年以上經(jīng)驗(yàn)的病理醫(yī)師進(jìn)行質(zhì)控評(píng)估,為保證NGS檢測(cè)結(jié)果的可靠性,石蠟標(biāo)本要求腫瘤細(xì)胞數(shù)量≥200個(gè),占比≥20%。臨床信息通過(guò)電子病歷系統(tǒng)獲取。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 病理學(xué)參數(shù)收集NTRK基因融合陽(yáng)性PTC標(biāo)本的臨床病理特征主要包括腫瘤大小、邊界、生長(zhǎng)模式及甲狀腺被膜、脈管、神經(jīng)侵犯與否和頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況。生長(zhǎng)模式包括乳頭狀、濾泡狀、實(shí)性/小梁狀/島狀、高柱狀等。細(xì)胞特征主要以BRAF V600E突變的經(jīng)典型PTC為參考,具體包括細(xì)胞排列、形狀、體積、細(xì)胞質(zhì)及核染色質(zhì)改變、核溝及核內(nèi)假包涵體等。

1.3 NGS檢測(cè)待測(cè)基因組DNA使用核酸提取純化試劑盒(廣州美基生物公司),DNA濃度及純度檢測(cè)使用NanoDrop 2000(Thermo Fisher Scientific,美國(guó))。DNA片段化選擇聚焦超聲波破碎儀(Covaris S220,美國(guó)),基因文庫(kù)構(gòu)建采用雜交捕獲法。文庫(kù)片段的大小分布使用Agilent 2100生物分析儀(安捷倫公司,美國(guó))。質(zhì)控合格的文庫(kù)使用Illumina NextSeq 550測(cè)序平臺(tái)行雙端測(cè)序。測(cè)序試劑盒采用甲狀腺癌基因檢測(cè)試劑盒(上海睿璟生物公司)。

1.4 免疫組化標(biāo)本經(jīng)10%中性福爾馬林固定,石蠟包埋,以4 μm厚切片,免疫組化抗體TRK(MXR032,福州邁新公司)和增強(qiáng)DAB染色液(OptiView DAB IHC Detection Kit,羅氏)。免疫組化檢測(cè)在全自動(dòng)免疫組化儀(Roche Benchmark XT,瑞士)進(jìn)行,采用EnVision兩步法染色。每張玻片均設(shè)陰性和陽(yáng)性對(duì)照,免疫組化染色結(jié)果由2位具有5年工作經(jīng)驗(yàn)的病理醫(yī)師進(jìn)行判斷。按照細(xì)胞著色強(qiáng)度分為:強(qiáng)陽(yáng)性(3+)、中等陽(yáng)性(2+)、弱陽(yáng)性(1+)及無(wú)著色(0)。

1.5 FISH驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)利用ETV6-NTRK3融合基因t(12:15)探針試劑盒(廣州安必平醫(yī)藥公司),FISH主要經(jīng)過(guò)標(biāo)本預(yù)處理、探針預(yù)熱變性、探針雜交、洗滌、復(fù)染等過(guò)程。陽(yáng)性判讀標(biāo)準(zhǔn):腫瘤細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)1個(gè)或2個(gè)黃色信號(hào),且出現(xiàn)黃色信號(hào)的腫瘤細(xì)胞數(shù)量≥15%。

2 結(jié)果

2.1 臨床病理特征790例PTC患者中位年齡40歲(范圍8～77歲)。790例PTC患者中NGS檢出的基因變異類(lèi)型見(jiàn)表1。本組檢出9例NTRK基因融合,包括2例NTRK1和7例NTRK3基因融合,其陽(yáng)性率約為1.1%。9例NTRK融合陽(yáng)性PTC中,7例女性,2例男性;中位年齡29歲(范圍27～68歲)。7例NTRK1/3基因融合發(fā)生在單側(cè)葉,2例發(fā)生在雙側(cè)葉;腫瘤呈多結(jié)節(jié)狀分布,最大徑均>1 cm。NTRK1/3基因融合病例具有明顯的局部侵襲、轉(zhuǎn)移能力,本組7例患者發(fā)生頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,9例均侵犯并突破甲狀腺被膜,并浸潤(rùn)周?chē)M織,未見(jiàn)脈管及神經(jīng)侵犯。5例患者接受甲狀腺腺葉切除聯(lián)合131I治療,4例僅行甲狀腺腺葉切除,所有NTRK1/3基因融合PTC患者均未接受NTRK靶向藥物治療。中位隨訪時(shí)間12.2個(gè)月(4.6～27.4個(gè)月),隨訪期間未發(fā)現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)征象(表2)。

表1 790例甲狀腺乳頭狀癌中NGS檢出的基因變異

表2 9例NTRK1/3基因融合陽(yáng)性甲狀腺乳頭狀癌的臨床病理特征及驗(yàn)證

2.2 NGS檢測(cè)及驗(yàn)證本組9例NTRK1/3基因融合PTC患者融合類(lèi)型主要包括:7例ETV6-NTRK3(E4:N14)融合、1例TPM3-NTRK1(T8:N12)融合和1例IRF2BP2-NTRK1(I1:N9)融合。9例NTRK1/3融合陽(yáng)性病例均為伴侶基因提供上游的啟動(dòng)子序列,NTRK1或NTRK3基因提供下游的激酶結(jié)構(gòu)域(圖1)。根據(jù)腫瘤細(xì)胞染色強(qiáng)度TRK分為:2例3+、3例2+、3例1+、1例0(圖2 A～C)。2例免疫組化3+標(biāo)本均為NTRK1基因融合;其余7例0/1+/2+均為ETV6-NTRK3基因融合,但免疫組化顯色欠佳,進(jìn)一步選擇特異性ETV6-NTRK3融合探針重新檢測(cè),FISH結(jié)果顯示7例標(biāo)本均為ETV6-NTRK3融合陽(yáng)性(圖2D)。

圖1 NTRK1/3融合陽(yáng)性的三種變異類(lèi)型:A. IRF2BP2N-NTRK1(I1:N9)融合;B. TPM3-NTRK1(T8:N12)融合;C. ETV6-NTRK3(E4:N14)融合

圖2 免疫組化和FISH驗(yàn)證:A. TRK 3+,EnVision兩步法;B. TRK 2+,EnVision兩步法;C.TRK 1+,EnVision兩步法;D. FISH檢測(cè)顯示ETV6-NTRK3融合信號(hào)陽(yáng)性(黃色)

2.3 組織學(xué)特征與經(jīng)典型BRAF V600E突變PTC相比,9例NTRK1/3融合標(biāo)本中2例為濾泡亞型,7例以濾泡結(jié)構(gòu)為主,伴有少量乳頭狀或?qū)嶓w/小梁/島狀生長(zhǎng)方式(表2)。腫瘤與正常組織邊界不清,6例(66.7%)呈浸潤(rùn)性生長(zhǎng),間質(zhì)伴有纖維化,3例(33.3%)呈多灶性滲透或“跳躍式”浸潤(rùn)。濾泡狀排列的腫瘤腔內(nèi)膠體減少,胞質(zhì)伴透明化改變,腫瘤細(xì)胞輕度異型(圖3A、B)。乳頭狀結(jié)構(gòu)常位于癌巢內(nèi),乳頭分支少,腫瘤細(xì)胞胞質(zhì)較豐富,部分乳頭中央缺乏纖維血管軸心(圖3C)。4例局部呈實(shí)體/小梁/島狀生長(zhǎng)趨勢(shì),多位于腫瘤浸潤(rùn)的邊緣(圖3D)。間質(zhì)纖維化常位于腫瘤內(nèi)或被膜處,淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)少見(jiàn)(圖3E)。NTRK1/3融合陽(yáng)性病例具有較強(qiáng)的局部侵襲和轉(zhuǎn)移能力,在甲狀腺周?chē)M織及淋巴結(jié)內(nèi)腫瘤細(xì)胞以濾泡亞型為主。另外,在4例NTRK1/3融合病例中發(fā)現(xiàn)其乳頭狀排列的區(qū)域可見(jiàn)細(xì)胞拉長(zhǎng),呈柱狀改變,存在核極性反轉(zhuǎn)現(xiàn)象(圖3F)。

2.4 液基細(xì)胞學(xué)特征液基細(xì)胞學(xué)結(jié)果顯示,8例診斷為PTC(TBS-Ⅵ類(lèi)),與術(shù)后結(jié)果一致;1例診斷為意義不明(TBS-Ⅲ類(lèi)),術(shù)后首次診斷為濾泡性腫瘤,不除外癌變可能。分子檢測(cè)結(jié)果提示ETV6-NTRK3融合陽(yáng)性,經(jīng)會(huì)診最終診斷為PTC。本組病例液基細(xì)胞學(xué)常表現(xiàn)為小片狀,細(xì)胞體積不大,毛玻璃樣核不明顯。核膜表面稍不規(guī)則,局部輕微凹凸不平,缺乏“桑葚樣”或“葡萄干樣”核膜顯著改變,核溝及核內(nèi)假包涵體少見(jiàn)(圖4)。

3 討論

腫瘤發(fā)生機(jī)制常由基因變異或染色體不穩(wěn)定性導(dǎo)致,PTC的發(fā)生主要與MAPK信號(hào)通路和PI3K-AKT信號(hào)通路激活有關(guān),涉及的基因包括BRAF、PTEN、RAS、TERT和TP53基因突變及RET、ALK、NTRK等基因融合[7-8]。BRAF V600E突變常見(jiàn)于PTC[9],RAS突變多見(jiàn)于PTC及濾泡癌,但良性結(jié)節(jié)也有報(bào)道[10],TP53突變、TERT啟動(dòng)子突變多發(fā)生在低分化或未分化甲狀腺癌[11]。雖然NTRK融合在甲狀腺癌中并不多見(jiàn),但甲狀腺癌新發(fā)病例每年都在增加,深入研究NTRK融合病例的病理特征及生物學(xué)行為非常必要。有文獻(xiàn)報(bào)道在輻射誘導(dǎo)的PTC中發(fā)現(xiàn)ETV6-NTRK3融合發(fā)生率約為14%,在散發(fā)性PTC中其發(fā)生率為1.2%～4%[3,12-14]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)甲狀腺癌中發(fā)生NTRK融合的概率僅次于RET融合,與文獻(xiàn)報(bào)道一致,其他罕見(jiàn)融合基因包括ALK、BRAF等[3,15]。同時(shí)本實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)NTRK3基因融合比NTRK1基因融合更常見(jiàn)(7 ∶2)[7-8]。在NGS檢測(cè)中觀察到NTRK融合陽(yáng)性患者的中位年齡為29歲,發(fā)病更傾向于年輕人。Zhao等[16]團(tuán)隊(duì)的研究顯示,NTRK基因融合在兒科腫瘤中比在成人腫瘤中更常見(jiàn),且融合類(lèi)型更豐富。與經(jīng)典型PTC相比,NTRK融合陽(yáng)性患者具有更強(qiáng)的侵襲轉(zhuǎn)移能力,大多數(shù)融合陽(yáng)性患者出現(xiàn)頸部側(cè)區(qū)淋巴結(jié)多發(fā)轉(zhuǎn)移和甲狀腺被膜外浸潤(rùn),部分研究還報(bào)道遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移[14,16-17]。

本組9例NTRK1/3融合陽(yáng)性的PTC主要以濾泡狀為主,可伴有乳頭狀、柱狀或?qū)嵭?小梁/島狀生長(zhǎng)方式,與文獻(xiàn)報(bào)道一致[12,14,17-21]。近年來(lái)超聲引導(dǎo)下細(xì)針穿刺應(yīng)用越來(lái)越廣泛,甲狀腺細(xì)針穿刺細(xì)胞學(xué)診斷成為甲狀腺結(jié)節(jié)手術(shù)治療的重要分流技術(shù)。為鑒別濾泡癌、濾泡性腺瘤及結(jié)節(jié)性甲狀腺腫伴腺瘤樣增生,本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步分析NTRK1/3融合陽(yáng)性標(biāo)本的液基細(xì)胞學(xué)特征:小片狀或小濾泡排列的細(xì)胞團(tuán),細(xì)胞擁擠重疊,缺乏微濾泡結(jié)構(gòu);細(xì)胞核可呈圓形、橢圓形或短梭形,核膜稍不規(guī)則,表面可見(jiàn)凹痕。與經(jīng)典型PTC相比,無(wú)明顯的皺縮或“桑葚樣改變”。因部分腫瘤細(xì)胞形態(tài)較溫和,極大增加了細(xì)胞學(xué)診斷難度。NTRK1/3融合陽(yáng)性標(biāo)本中的腫瘤細(xì)胞常伴有胞質(zhì)透明化改變,其中1例伴有明顯的透明細(xì)胞型改變,Lee等[20]的報(bào)道中也提及胞質(zhì)改變。本組例9細(xì)胞學(xué)診斷為意義未明(TBS-Ⅲ級(jí)),組織學(xué)病理首次診斷為濾泡性腫瘤,未除外癌變可能,隨后結(jié)合基因檢測(cè)結(jié)果,最后診斷為PTC。因甲狀腺診斷性分子標(biāo)志物BRAF V600E通常陰性,對(duì)于形態(tài)特征類(lèi)似NTRK融合的病例,建議行NTRK1/3基因融合檢測(cè)。

本實(shí)驗(yàn)為回顧性研究,存在一些局限性。一方面NTRK融合陽(yáng)性病例數(shù)較少,無(wú)法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。另一方面早期患者均未使用NTRK抑制劑,因此無(wú)法統(tǒng)計(jì)各融合亞型對(duì)靶向藥物治療的療效差異。后續(xù)我們將繼續(xù)收集NTRK融合陽(yáng)性病例,并進(jìn)一步深入分析。

綜上,在散發(fā)性PTC中,NTRK基因融合陽(yáng)性率較低,常見(jiàn)亞型為NTRK1/3。對(duì)于BRAF V600E陰性甲狀腺癌患者,當(dāng)其細(xì)胞學(xué)與生物學(xué)行為反差較大時(shí),強(qiáng)烈推薦行NGS檢測(cè),以明確發(fā)病機(jī)制,篩選出轉(zhuǎn)移和預(yù)后較差的患者,以便早期干預(yù),延長(zhǎng)患者生存期。