土壤銻脅迫下赤子愛勝蚓在個體和細胞水平的毒性效應

程佳琪，馬宏瑞，常 健，潘明慧，李琴蓮，王 謙，侯 紅

1. 中國環(huán)境科學研究院，環(huán)境基準與風險評估國家重點實驗室，北京 100012

2. 陜西科技大學，陜西 西安 710021

3. 華北理工大學，河北 唐山 063000

4. 生態(tài)環(huán)境部土壤與農業(yè)農村生態(tài)環(huán)境監(jiān)測技術中心，北京 100012

銻(Sb)是一種有毒的類金屬元素，被廣泛用于陶瓷、玻璃、電池、油漆、煙火材料及阻燃劑生產[1-3]，在土壤中多以五價存在. 據調查，貴州晴隆銻礦區(qū)周圍農田土壤Sb含量(13.65～410.91 mg/kg)遠高于貴州背景值(2.24 mg/kg)，湖南某錫礦區(qū)表層土壤Sb濃度最高可達54 221.71 mg/kg[4-5]. 這些銻礦的開采嚴重污染環(huán)境且對周圍生物有毒害作用[6]. 例如，某銻礦區(qū)男性工人肺癌死亡率在新增Sb加工作業(yè)后顯著上升[7]；五價的葡萄糖銻酰鈉會引起小鼠蛋白尿、降低紅細胞數及血糖水平、增加白細胞數及血尿素等癥狀[8]. Feng等[9]研究發(fā)現，一定濃度Sb脅迫下，水稻體內丙二醛(malondialdehyde, MDA)及地上部株體超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)和抗壞血酸過氧化物酶(aseorbateperoxidase, APX)增加，根中過氧化物酶(peroxidase, POD)和過氧化氫酶(catalase,CAT)活性受到抑制.

蚯蚓是土壤中分布最廣泛的無脊椎動物之一，占到土壤生物量的80%[10-11]. 蚯蚓吸收微量金屬不僅會對自身產生毒性，而且可以通過食物鏈進行傳遞[12-13].因此蚯蚓被認為是生態(tài)風險評估的重要組成部分，常通過測定其個體水平死亡率、繁殖率，細胞水平酶活性及DNA損傷等指標進行土壤污染的生態(tài)毒理學診斷[14-17]. 目前國內外有關Sb對蚯蚓的研究還比較缺乏，只有少數文獻報道，如Xu等[18]研究表明，在黏性農業(yè)土壤中蚯蚓不能有效積累Sb；Kuperman等[19]提供了Sb對蚯蚓繁殖的毒理學數據；梁淑軒等[20]研究了Sb對蚯蚓體內金屬硫蛋白的影響；Zhong等[21]研究了農業(yè)土壤中銻對蚯蚓的毒性效應. 這些研究大多從對蚯蚓進行短期急性毒性試驗展開，且與對蚯蚓進行抗氧化酶試驗的結果不一致，缺乏Sb長期暴露對蚯蚓體內累積及毒性評價的研究. 因此，土壤Sb對蚯蚓毒性的研究還存在許多不足，豐富Sb脅迫下生態(tài)受體的毒理數據很有必要.

本文以土壤無脊椎模式生物赤子愛勝蚓(Eisenia fetida)為受試生物，在人工模擬Sb污染土壤中進行兩個月的長期培養(yǎng)后，從個體水平和細胞水平等多個毒性終點探究Sb對赤子愛勝蚓的影響. 同時，檢測了Sb暴露過程中蚯蚓體內5種生物標志物(總蛋白、CAT、SOD、POD和MDA)的變化，并使用生物標志物響應指數(biomarker response index, BRI)來綜合評估土壤Sb脅迫下赤子愛勝蚓在細胞水平的毒性效應，以期為我國銻污染提供關鍵毒理學數據，為以后銻礦區(qū)周圍污染土壤生態(tài)治理提供依據.

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1供試生物

Eisenia fetida購自北京坤龍養(yǎng)殖場. 試驗開始前將其放在20 ℃室內養(yǎng)殖兩周以上，定期加入燕麥作為食物. 試驗過程中選用活潑、體態(tài)相似的成熟蚯蚓，質量在300～500 mg范圍內[22-23].

1.1.2供試土壤

供試土壤為人工土壤，由10%的泥炭土、20%的高嶺黏土、69%的工業(yè)石英砂(含50%以上0.05～0.20 mm的細小顆粒)組成，并用1%的CaCO3調節(jié)pH為7左右，用去離子水調節(jié)含水量為50%.

1.2 試驗方法

1.2.1污染土壤樣品制備

試驗選用的五價銻鹽為焦銻酸鉀(KSbO6H6，分析純)，將稱好的藥品加熱溶解，使用噴壺進行人工土壤染毒. 試驗在2 000 mL燒杯中進行，在燒杯中添加500 g人工土壤，5 g牛糞，使用攪拌器充分拌勻. 所有土壤在20 ℃恒溫箱(光照周期為16∶8的光暗循環(huán)，濕度為50%)中老化兩周后進行毒性試驗. 試驗Sb含量設置為空白(0 mg/kg)、低劑量(400、800 mg/kg)、高劑量(1 600、3 200、6 400、12 800 mg/kg)3種濃度梯度，分別以CK、S1、S2、S3、S4、S5、S6表示，每組設置3個平行. 期間通過稱量法向燒杯中添加去離子水使土壤含水量保持在50%左右.

1.2.2蚯蚓毒性試驗

試驗參照OECD指南和ISO[24-25]，整個試驗期間控制溫度為(20±2) ℃，光照周期為16∶8的光暗循環(huán)、光照強度為400～800 lx、土壤含水量為50%. 試驗開始前將稱量好的蚯蚓置于裝有濕濾紙的燒杯中，在20 ℃恒溫箱中進行24 h清腸處理. 在裝有不同Sb含量土壤的燒杯中分別加入10條清腸后的赤子愛勝蚓，置于人工氣候箱中培養(yǎng)，期間不添加牛糞，其他培養(yǎng)條件同赤子愛勝蚓飼養(yǎng)條件. 試驗分兩組進行，其中一組用于毒性測試，每隔一天用去離子水補充水分并使用玻璃棒和鑷子協(xié)助計數，計算LC50；另一組用于酶活性和蚯蚓體內Sb積累測定. 所有處理均分別在培養(yǎng)第7、14、21、28、56天取樣，每組取3個平行. 用于酶活性測定的蚯蚓取兩條制成勻漿置于4 ℃冰箱備用，用于含量測定的蚯蚓取3條進行冷凍干燥后備用.

1.2.3蚯蚓體內Sb含量測定

蚯蚓體內Sb含量測定參照《食品安全國家標準食品中多元素的測定》(GB 5009.268-2016). 稱取冷凍干燥后的蚯蚓干樣0.5 g于消解內罐中，加入5 mL濃硝酸，放置1 h后在微波消解儀中170 ℃消解4 h，冷卻后將消解內罐取出，在超聲水浴箱中超聲脫氣5 min，用超純水定容至25 mL后過0.45 μm濾膜備用. 用ICP-MS(7800型，美國安捷倫公司)測定溶液中的Sb含量.

1.2.4總蛋白、抗氧化系統(tǒng)酶、丙二醛的提取及測定

取兩條蚯蚓在0.86%生理鹽水中漂洗，除去血液，濾紙拭干，稱重，放入50 mL小燒杯內. 加入9倍體積生理鹽水，用眼科小剪剪碎組織塊后置于事先冰浴好的玻璃勻漿管中，充分研碎，使之勻漿化. 制備好的勻漿在高速冷凍離心機(TGL-16.5M，上海盧湘離心機儀器有限公司)中以2 000 r/min離心15 min，取上清液進行總蛋白、CAT、POD、SOD、MDA測定. 所有測定均采用南京建成生物工程研究所提供的試劑盒，按說明書進行.

1.3 數據處理

1.3.1LC50計算及劑量效應關系擬合

該研究用Logisitic方程擬合實測總Sb含量對赤子愛勝蚓存活的LC50[26]：

式中：y為赤子愛勝蚓存活率；x為實測總Sb含量，mg/kg；a為對照組中赤子愛勝蚓的存活數；x0為LC50；b為方程擬合過程中所產生的斜率參數.

分別采用WPS office 2021、SPSS 19.0軟件進行數據統(tǒng)計，采用SPSS 19.0和Origin 8.0軟件進行數據分析和繪圖.

1.3.2生物標志物響應指數

根據文獻使用生物標志物變異水平(Alteration level，AL)和生物標志物響應指數(BRI)來評價Sb對赤子愛勝蚓的健康影響. AL的計算公式如下：

式中：BRt和BRc分別為污染處理組和對照組的生物標志物響應水平；AL為生物標志物變異水平，根據變異水平大小進行評分(Score, S). 當AL＜20%時，評4分；當20%＜AL＜50%時，評3分；當50%＜AL＜100%時，評2分；當AL＞100%時，評1分[27]. 然后根據生物標志物的生物學水平對其進行加權，SOD、CAT、POD、總蛋白為正常效應，權重為1；MDA是一個不利的影響，權重為1.2[28]. 最后基于分數和權重，計算BRI：

式中，Sn和Wn分別為生物標志物n的得分和權重.此外，對BRI進行劃分：介于3.01～4.00之間時，表示輕微健康影響；介于2.76～3.00之間時，表示中等健康影響；介于2.51～2.75之間時，表示較大健康影響；介于1.00～2.50之間時，表示嚴重健康影響[29].

2 結果與分析

2.1 不同暴露時間土壤外源Sb對蚯蚓毒性的影響

圖1為蚯蚓存活與實測總Sb的Logisitic方程擬合. 由圖1可以看出，蚯蚓存活率隨Sb濃度和暴露時間增加而降低. 根據存活率結果，采用SPSS 19.0軟件進行雙變量相關性分析，發(fā)現蚯蚓存活率與暴露濃度呈現顯著性負相關(P＜0.05)，并且在高劑量(3 200、6 400、12 800 mg/kg)處理條件下，存活率與暴露時間呈顯著負相關(P＜0.05). 另外經計算蚯蚓56 d的LC50為4 380.37 mg/kg.

圖1 蚯蚓存活率與土壤實測總Sb的劑量-效應關系Fig.1 Dose response curves between the survival rate of Eisenia fetida and the total concentration of Sb in soil

2.2 蚯蚓對Sb的富集

從圖2可以看出，蚯蚓體內Sb含量隨暴露時間和暴露濃度增加而增加. 在低劑量暴露下其含Sb量較低，當Sb含量超過3 200 mg/kg時，蚯蚓體內Sb含量顯著升高. 處理組S6在第14、28、56天的Sb富集量分別達到94.8、177、213 mg/kg.

圖2 不同暴露時間赤子愛勝蚓對Sb的富集Fig.2 The Sb concentration of enriched within Eisenia fetida under different exposure times

表1為不同處理組蚯蚓Sb富集系數(bioaccumulation factors，BAF)，BAF為蚯蚓體內Sb含量與土壤中Sb含量的比值，BAF大于1說明蚯蚓對Sb有富集，BAF小于1說明蚯蚓對Sb只是一般吸收[30]. 如表1所示，所有處理組BAF均小于1，說明蚯蚓對Sb富集作用很小，只起到一般吸收作用. 由表1可知，蚯蚓Sb富集系數隨處理劑量升高整體顯著降低；另外，隨時間延長，蚯蚓Sb富集系數呈現上升趨勢.

表1 不同試驗組蚯蚓銻富集系數Table 1 Sb bioconcentration factors of Eisenia fetida in different experimental groups

2.3 土壤Sb脅迫下蚯蚓體內總蛋白含量、抗氧化酶活性和MDA含量的變化

由圖3(a)可知，隨暴露時間延長蚯蚓體內總蛋白含量明顯下降. CK在暴露時間內緩慢下降，降幅為28.6%，各處理組總蛋白含量較CK顯著降低(P＜0.05)，在暴露時間內降幅分別為1.5%～44.4%、25.3%～59.3%、15.1%～49.7%、28.3%～64.2%，且各處理組總蛋白含量在暴露時間內隨Sb水平增加呈劑量效應關系.

圖3 暴露期間赤子愛勝蚓總蛋白含量、CAT活性、POD活性、SOD活性和MDA含量的變化情況Fig.3 The changes of total protein content, CAT activity, POD activity, SOD activity and MDA content in Eisenia fetida during exposure

由圖3(b)可知，CK組CAT活性隨暴露時間延長基本不變. 各處理組CAT與CK相比，整體差異性顯著(P＜0.05)，在暴露第7天，各處理組CAT活性顯著升高，S6處理組最高升至219.5 U/mg Prot，較CK漲幅120%；在暴露第14天，除S6處理組繼續(xù)升高外，其余處理組出現下降趨勢；在暴露第21天，蚯蚓體內CAT活性繼續(xù)升高，高劑量處理組S4、S5、S6達到峰值. CAT活性在隨暴露時間內總體呈現“上升—下降—上升—下降”的波動趨勢.

由圖3(c)可知，CK組POD活性隨暴露時間延長呈先升后降趨勢，在暴露7～21 d各處理組POD活性與CK相比無顯著性差異(P＞0.05)；在暴露第28天各處理組與CK相比顯著上升(P＜0.05). 除S5處理組外，各處理組在第21天POD活性達到峰值，分別為0.046、0.044、0.039、0.049、0.059 U/mg Prot，漲幅分別為39.4%、34%、17%、47%、79%. POD活性在暴露時間內總體呈現先升高后降低的倒“U”型變化.

由圖3(d)可知，CK組SOD活性隨暴露時間延長總體呈先升后降趨勢. 在暴露7～21 d各處理組SOD活性隨時間不斷上升，處理組S3、S5、S6在第21天達到峰值，分別為4.14、3.88、4.5 U/mg Prot，較CK漲幅為78.4%、67.0%、94.0%；在暴露第28天，低劑量處理組SOD活性繼續(xù)上升，而高劑量處理組S5、S6出現下降趨勢. SOD活性在暴露時間內總體呈現先升高后降低的倒“U”型變化.

由圖3(e)可知，在暴露7～21 d，MDA含量隨時間延長整體不斷升高，處理組S2、S3、S4、S5在第21天達到峰值，分別為1.04、1.15、1.43、1.14 nmol/mg Prot，較CK漲幅分別為7.9%、19.0%、47.3%、18.0%，并且在暴露第21天，MDA含量呈現低濃度促進高濃度抑制現象；在暴露第28天各處理組MDA活性整體呈現下降趨勢. MDA在暴露時間內總體呈現先升高后降低的倒“U”型變化.

2.4 土壤Sb對蚯蚓毒性的綜合評價

表2為各處理組在4個時間的生物標志物變異水平及得分. 總體而言，隨處理水平增加，AL呈現上升趨勢，表明土壤Sb濃度越高，生物標志物變異水平越大. 總蛋白、CAT、SOD、MDA和POD的變異水平范圍分別為1.5%～68.7%、 9.3%～271.6%、 5.6%～94.0%、1.1%～58.7%和1.0%～123.7%. 在所有生物標志物中，CAT變異水平最大，其中處理組S4在21 d分別達到271.60%，表明在3 200 mg/kg處理水平下，蚯蚓CAT變異水平大幅升高.

表2 生物標志物變異水平及得分Table 2 Level of variation and corresponding scores of biomarkers

圖4為蚯蚓生物標志物響應指數隨時間的變化情況，BRI值越低，說明蚯蚓受傷害程度越高. 由圖4可知，在第7、21、28天各處理組BRI隨時間延長整體不斷下降，第14天，BRI呈現“降低—升高—降低”的變化趨勢. 各處理組在4個時間的BRI值分別為2.81～3.42、2.81～3.62、2.00～3.19、2.19～3.01. 處理組S5、S6在第7 天時BRI分別為2.85、2.81，表明高劑量處理組在較短時間內出現中等健康影響. 隨暴露時間延長，低劑量處理組在第14天出現中等健康影響，BRI值為2.85. 在4個時間段內，BRI最低值為2，說明處理組S6在第21天受到嚴重健康影響. 在所有處理組中，僅有4個處理組蚯蚓屬于嚴重健康影響，其余處理組均在中等及以下健康影響.

圖4 赤子愛勝蚓在銻脅迫下的生物標志物響應指數Fig.4 The biomarker response index of Eisenia fetida under Sb stress

3 討論

該研究中，蚯蚓對Sb的累積隨時間延長和處理水平增加不斷增多，但在所有處理組中，蚯蚓對Sb都是簡單吸收. 這可能是由于Sb在土壤中的水溶態(tài)占比非常小[1]，而蚯蚓主要通過皮膚從土壤孔隙水吸收Sb[31]，或者蚯蚓把含Sb土壤通過進食后又排出體外，對Sb的積累行為非常有限[32]. BAF隨處理劑量降低也說明蚯蚓對Sb的積累能力較弱，但是在較長時間暴露下蚯蚓對Sb仍有一定的積累量. 在蚯蚓接觸Sb后，其體內抗氧化酶不斷響應來抵抗外來侵害，直至達到抗氧化極限，蚯蚓細胞受損開始死亡[33]. 所以隨時間延長和濃度升高蚯蚓死亡率不斷上升. 蚯蚓死亡率與Sb水平呈劑量效應關系，這與已有的研究結果[34]一致. 經計算蚯蚓暴露56 d時的LC50為4 380.37 mg/kg. 在對其他生物的研究中，有研究顯示Sb(Ⅲ)對跳蟲的急性死亡LC50在海倫黑土、祁陽紅壤、北京潮土中分別為3 352、4 007、2 105 mg/kg[35]. Lin等[36]研究顯示，與Sb(Ⅲ)相比，Sb(Ⅴ)處理土壤中的跳蟲死亡率沒有明顯變化. 通過對比可以看出，本文所研究的Sb(Ⅴ)對赤子愛勝蚓的毒性效應在個體水平較低.

蚯蚓在接觸Sb后體內迅速產生活性氧(ROS)，抗氧化酶的作用是消除ROS維系膜系統(tǒng)穩(wěn)定，降低細胞受傷害程度，因此被作為生物標志物被廣泛用于重金屬風險評估[37-38]. SOD作為生物體抗氧化系統(tǒng)的第一道防線[39-40]，首先得到誘導與活性氧自由基作用，將超氧陰離子(O2-)歧化成O2和H2O2. CAT與POD的作用是將SOD的歧化產物和其他來源的H2O2清除，二者具有很好的協(xié)同作用[41]. MDA是機體抗氧化平衡中自由基作用于脂質形成的氧化最終產物，能夠較好反映蚯蚓的氧化系統(tǒng)受損程度[42]. 該研究中CAT的變化趨勢與前人對鑭的研究結果[43]一致. 在暴露初期CAT迅速上升，Zhou等[44]研究也發(fā)現，在短期作用下，蚯蚓對Cd2+氧化應激反應產生的酶主要是CAT. SOD、POD活性在暴露時間內均呈現先升后降的倒“U”型變化趨勢，這是因為暴露初期，抗氧化酶活性不斷升高，可以有效去除蚯蚓體內活性氧.暴露后期，當Sb含量超過蚯蚓耐受閾值時，蚯蚓細胞受到嚴重傷害，應激能力下降. 另外，D'agostino等[45-46]研究也表明，抗氧化酶SOD、POD在清除由正常代謝或環(huán)境應激引起的自由基方面存在一定的相互協(xié)同效應. MDA含量呈現倒“U”型變化趨勢，可能是因為暴露初期蚯蚓體內抗氧化酶的清掃能力低于自由基產生速度，過剩的氧自由基引起膜的過氧化，使MDA含量不斷升高[47-48]，但隨時間延長，過剩的活性氧在抗氧化酶活性最高時得到清除，使蚯蚓體內活性氧的生成和去除達到平衡，MDA含量逐漸降低趨于平穩(wěn). 蚯蚓體內總蛋白含量隨暴露時間和處理水平增加而不斷減少，說明在土壤Sb的脅迫下，蚯蚓不斷消耗能量來進行解毒和排泄過程[49]. 同時隨濃度增加和時間推移，蚯蚓機體功能受損，抑制了蛋白質的合成[50]. 由此可以看出，在暴露期間內，蚯蚓體內5種生物標志物均對Sb做出敏感響應.

生物標志物響應指數BRI是在為魚類制定的生物效應評估指數(BAI)和健康評估指數(HAI)之后制定的[51]，其優(yōu)點是將復雜的生物改變轉化為一種實用的手段進行風險評估和風險管理，來減少風險評估中的不確定性. 在對BRI的探究中，Aarab等[52]基于BRI創(chuàng)建了一個全球指數(多生物標志物污染指數)，該指數已在歐洲計劃應用. Narbonne等[53]利用全球生物標志物指數，對歐洲沿海地區(qū)水質進行了分類.近幾年一些國內學者開始利用BRI來評價土壤中重金屬、農藥等污染物對赤子愛勝蚓的毒性效應. 例如，Li等[27]利用BRI評價了環(huán)草隆和鎘對蚯蚓的聯合毒性，發(fā)現BRI與污染物暴露濃度之間存在顯著的劑量效應關系. 本文通過BRI來評價土壤中Sb對赤子愛勝蚓的毒性發(fā)現，高劑量處理組在短期內出現中等健康影響，低劑量處理組隨時間延長也出現中等健康影響，但只有個別處理組屬于嚴重健康影響，表明土壤Sb對赤子愛勝蚓的影響在細胞水平較低.

總而言之，本文通過探究土壤Sb脅迫下赤子愛勝蚓死亡率、Sb富集、酶活性等指標，發(fā)現總蛋白、CAT、SOD、POD和MDA對Sb敏感，基于這5種生物標志物的BRI能夠有效評價土壤Sb的污染程度，為土壤Sb污染生態(tài)風險評價提供了關鍵生態(tài)毒理學數據. 但蚯蚓在土壤Sb脅迫下的生物標志物響應僅能表征細胞水平的毒性效應，且具體機理尚不明確，應進一步在分子水平上解析Sb對蚯蚓的毒性機制.

4 結論

a) 赤子愛勝蚓存活率隨處理水平和暴露時間的增加而降低，劑量效應關系明顯；蚯蚓對Sb只是一般吸收，富集作用較小.

b) 在暴露28 d內，SOD活性、POD活性、MDA含量總體呈現先升高后降低的倒“U”型變化，CAT活性總體呈現“上升—下降—上升—下降”的變化趨勢，總蛋白含量隨暴露時間和處理水平的增加不斷降低. 在赤子愛勝蚓體內，5種生物標志物均對Sb響應敏感，可以作為Sb生態(tài)風險評估的指標.

c) 至少1 600 mg/kg的Sb劑量才能引起中等健康影響，且出現在暴露14 d后；在所有處理組中僅有4個處理組BRI小于2.5，屬于嚴重健康影響. 總體而言，Sb對赤子愛勝蚓的毒性效應不強.