針灸對克羅恩病模型大鼠天樞穴局部皮膚中緩激肽、CGRP 和NPY 的影響

周競穎，來奕恬，丁攀婷，張國山*，劉 密*

1.湖南中醫(yī)藥大學研究生院，湖南 長沙 410208；2.湖南中醫(yī)藥大學針灸推拿與康復學院，湖南 長沙 410208

克羅恩?。–rohn's disease, CD）是一種慢性炎癥性疾病，可能發(fā)生于口腔到肛門中的任意一段消化道。 近年來，我國發(fā)病人群不斷增多，首發(fā)癥狀包括腹痛、慢性腹瀉、瘺管形成和肛周病變等，且通常伴有腸外癥狀，嚴重影響患者的生活質(zhì)量[1-2]。 由于先天性免疫和獲得性免疫失調(diào)，CD 易反復發(fā)作，需要長期的藥物維持治療，目前仍無特異性療法。針灸作為中醫(yī)傳統(tǒng)療法，具有溫通經(jīng)絡、行氣活血、補虛抗邪等功效，在腸道疾病臨床治療中使用廣泛，取得了良好的治療效果[3]。 根據(jù)CD 的臨床癥狀特點，中醫(yī)辨證其病位在腸，而天樞穴是大腸的募穴，作為腸腑病癥的常用穴位[4]。 皮膚作為感受針灸刺激的首個環(huán)節(jié)，可能是其發(fā)揮療效的首要部位，穴位存在于體表，而體表皮膚中密集分布著神經(jīng)纖維，它們可以釋放不同類型的神經(jīng)肽，與全身的免疫細胞群進行交流[5]。 故研究針刺與艾灸啟動初始階段的效應，可通過觀察局部穴區(qū)組織神經(jīng)肽的變化來加以分析。因此，本研究通過觀察天樞穴局部皮膚中緩激肽（bradykinin, BK）、降鈣素基因相關肽（calcitonin gene related peptid, CGRP）、神經(jīng)肽Y（neuropeptide Y,NPY）的蛋白表達水平變化，探討針灸治療CD 在初始啟動環(huán)節(jié)對腧穴局部皮膚的影響。

1 材料與方法

1.1 動物及分組

清潔級SD 雄性大鼠50 只，體質(zhì)量為150～180 g，由廈門大學實驗研究動物管理中心提供，實驗動物許可號：SYXK(閩)1216-0006。 飼養(yǎng)于廈門大學實驗動物中心，飼養(yǎng)室溫度控制在18～26 ℃，濕度控制在40%～70%，晝夜交替周期為12 h。 大鼠自由進食進水，適應性飼養(yǎng)7 d 后，完全隨機分成正常組、模型組、針刺組、艾灸組和西藥組，每組10 只。 實驗研究過程中進行的操作和處理方式符合《關于善待實驗動物的指導性意見》規(guī)定。

1.2 主要試劑及儀器

2，4，6-三硝基苯磺酸溶液（2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid, TNBS）（上海Sigma Alrdich 公司，批號：762229）；Western blot 試劑盒（武漢默沙克公司，批號：BA23387）；ELISA 試劑盒（武漢貝萊茵生物科技公司，批號：RA21360）；BA110S 萬分之一電子天平（德國Sartorius 公司，型號：BCE224-1CCN）；病理組織包埋機(武漢俊杰電子有限公司，型號：JBP5)；石蠟病理切片機(上海徠卡儀器有限公司，型號：RM2016)；SPECTRAMAX 多功能酶標儀（美國Molecular Devices 公司，型號：SpectraMax M3）；艾條（湖香艾生物科技有限公司，0.7 cm×2 cm）；針灸針（蘇州醫(yī)療用品有限公司，0.25 mm×25 mm）。

1.3 模型制備及評價標準

應用TNBS 制備CD 腸纖維化大鼠模型：將5%（W/V）TNBS 與50%乙醇按2∶1 比例混合成TNBS灌腸液[2]。用改良型灌胃針連接注射器，按3 mL/kg 大鼠體質(zhì)量抽取適量灌腸液，用10%水合氯醛腹腔麻醉大鼠后將其頭下尾上倒置，然后把灌胃針緩慢插入肛門6～8 cm，注入灌腸液，當注射器內(nèi)灌腸液消失后繼續(xù)推進0.2 mL 空氣，以保證灌腸液完全注入腸腔。 然后拔出灌胃針，再將大鼠倒立1 min 左右，以防液體溢出。 每隔7 d 重復灌腸1 次，共4 次。 模型制備成功的評價標準[2]：大鼠出現(xiàn)不同程度的少食、稀便、黏液便，體質(zhì)量減輕；部分大鼠出現(xiàn)血便，經(jīng)隱血試劑測試顯陽性；結腸出現(xiàn)典型的鵝卵石樣改變，黏膜充血、出血、糜爛，偶見線性潰瘍；病理切片見中性粒細胞、淋巴細胞浸潤。

1.4 干預方法

參照李忠仁主編的《實驗針灸學》及擬人比照法[6]，選取雙側天樞穴和上巨虛穴進行針刺與艾灸干預。大鼠天樞穴位于胸劍聯(lián)合下40 mm，腹直肌及其鞘處，相距前正中線5 mm；上巨虛穴位于大鼠膝關節(jié)外下方腓骨小頭下約10 mm 處，足三里向下約5 mm處。

模型制備成功后，將針刺組大鼠固定，使其腹部與四肢暴露，用75%的乙醇消毒大鼠雙側天樞穴和上巨虛穴后，將針灸針刺入3～5 mm，行捻轉手法20 s后留針15 min，治療中間及拔針時各行捻轉手法20 s；采用相同的方法將艾灸組大鼠固定并腧穴局部消毒后，將溫灸純艾條（0.7 cm×12 cm）置于雙側天樞穴和上巨虛穴上方3～5 cm 處，每次15 min（首次施灸時采用自制體表溫度傳感器，將其固定于施灸部位，以確保艾灸時皮膚感受溫度波動在45 ℃左右）；用雙蒸水與研磨后的美沙拉嗪腸溶片混合配制成灌胃液，按照成人體質(zhì)量（70 kg）用藥量為4 g/d，以大鼠體質(zhì)量（200 g）換算大鼠投藥量為0.36 g/kg，每天給予西藥組大鼠灌胃處理[7]。 3 組干預方法均每天1次，連續(xù)干預7 d。

1.5 觀察指標及檢測方法

1.5.1 一般行為學觀察 每天觀察大鼠的日常情況，包括精神狀況、皮毛顏色光澤、反應靈敏程度、活動度、攝食量、攝水量、肛周情況、大小便性狀及存活數(shù)量等。

1.5.2 結腸病理形態(tài)學觀察 干預結束后，用10%水合氯醛腹腔麻醉大鼠，然后將其固定于鼠板上，打開腹腔，截取距肛門6～7 cm 處結腸約1 cm，縱向剖開后用冰生理鹽水沖洗干凈，肉眼觀察其病理形態(tài)學變化；然后剪取肉眼可見損傷最明顯的腸組織2 cm 左右，將其置于4 %多聚甲醛固定液中固定24 h，行HE 染色后，光學顯微鏡下觀察其病理形態(tài)學變化。

1.5.3 天樞穴局部皮膚中BK、CGRP、NPY 的表達

各組大鼠天樞穴局部皮膚除毛后，剪取少許天樞穴局部皮膚組織（約5 mm×5 mm×5 mm），將其置于勻漿器中剪碎，加入裂解液充分裂解勻漿30 min，然后將其轉移至1.5 mL 的離心管中，在4 ℃下12 000 r/min、半徑為10 cm 離心10 min，取0.5 mL 上層清液并將其置于凍存管中，儲存于-20 ℃冰箱待檢測。分別采用ELISA 法檢測BK 的蛋白含量，采用Western blot法檢測CGRP、NPY 的蛋白相對表達。

1.6 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 20.0 軟件系統(tǒng)進行分析。 各項檢驗指標的統(tǒng)計數(shù)據(jù)，首先進行正態(tài)性檢驗。若符合正態(tài)分布則用“±s”表示，再進行方差齊性檢驗，若符合則使用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD 檢驗；若不符合方差齊性則用Dunnet T3 分析。 若實驗研究數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布和方差齊性，采用秩和檢驗。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠一般情況比較

造模前，各組大鼠精神狀態(tài)好，毛色光澤而活動靈敏，食量、二便均正常。造模后，正常組較造模前無明顯變化，模型組大鼠精神萎靡、嗜臥，毛發(fā)稀疏暗黃，對外界刺激靈敏度下降，厭食消瘦，體質(zhì)量明顯下降，肛周可見淺黃色糊狀糞便，部分大鼠甚至可見黏液膿血便或血便。干預后，正常組和模型組較干預前無明顯變化，針刺組、艾灸組和西藥組大鼠的精神狀態(tài)、毛發(fā)光澤度、活動度、二便情況等均有顯著改善。 造模及針灸、藥物干預過程中，均未出現(xiàn)大鼠死亡。

2.2 各組大鼠結腸病理形態(tài)學比較

肉眼觀察可見：正常組大鼠結腸組織呈淡紅色，質(zhì)地光滑柔軟，沒有出現(xiàn)明顯充血、水腫以及增生現(xiàn)象，腸壁較??；模型組大鼠結腸內(nèi)壁可見典型的鵝卵石樣改變，局部可見明顯潰瘍及息肉，顏色暗紅，腸壁增厚變硬；經(jīng)過治療后，針刺組、艾灸組和西藥組大鼠結腸損傷情況較模型組均有明顯改善，結腸組織較模型組柔軟光滑，局部充血和水腫情況較輕，并未見明顯潰瘍糜爛面，腸壁變薄。 HE 染色后，在光鏡下可見：正常組大鼠結腸組織的腺體結構較完整,結腸腸壁肌層、漿膜層的層次清晰，未見增生、充血水腫等現(xiàn)象；模型組大鼠可見腺體結構破壞，黏膜層損傷嚴重，結腸黏膜上皮層有明顯缺損、存在裂隙狀潰瘍，黏膜下層組織水腫嚴重，大量炎癥細胞浸潤，偶有結節(jié)病樣肉芽腫；經(jīng)過治療后，針刺組、艾灸組和西藥組大鼠可見結腸腺體結構恢復，黏膜損傷修復，層次清晰明顯，炎癥細胞浸潤明顯改善，結腸組織水腫減輕。 詳見圖1。

圖1 各組大鼠結腸組織鏡下觀察比較（HE，×100）

2.3 各組大鼠天樞穴局部皮膚中BK 含量比較

與正常組相比，模型組大鼠天樞穴局部皮膚中BK 的含量顯著升高（P＜0.01）；與模型組相比，針刺組、 艾灸組和西藥組大鼠天樞穴局部皮膚中BK 的含量均顯著降低（P＜0.01）；針刺組、艾灸組和西藥組大鼠天樞穴局部皮膚中BK 的含量相比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。 詳見表1。

表1 各組大鼠天樞穴局部皮膚中BK 含量比較（μg/mL，±s）

表1 各組大鼠天樞穴局部皮膚中BK 含量比較（μg/mL，±s）

注：與正常組相比，▲▲P＜0.01；與模型組相比，★★P＜0.01。

組別正常組模型組針刺組艾灸組西藥組n 10 10 10 10 10 BK 含量8.24±2.11 19.09±3.57▲▲12.78±2.33★★10.12±1.51★★10.35±1.49★★

2.4 各組大鼠天樞穴局部皮膚中CGRP、NPY 蛋白相對表達量比較

與正常組相比，模型組大鼠天樞穴局部皮膚中CGRP 相對表達量顯著降低（P＜0.05）；與模型組相比，針刺組、艾灸組和西藥組大鼠天樞穴局部皮膚中CGRP 相對表達量均顯著升高（P＜0.01 或P＜0.05）。 模型組與正常組大鼠相比，針刺組、艾灸組和西藥組分別與模型組大鼠相比，天樞穴局部皮膚中NPY 相對表達量差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。詳見圖2、表2。

圖2 各組大鼠天樞穴局部皮膚中NPY、CGRP 蛋白電泳圖

表2 各組大鼠天樞穴局部皮膚中NPY、CGRP 蛋白相對表達量比較（±s）

表2 各組大鼠天樞穴局部皮膚中NPY、CGRP 蛋白相對表達量比較（±s）

注：與正常組相比，▲▲P＜0.05；與模型組相比，★★P＜0.01，★P＜0.05。

組別正常組模型組針刺組艾灸組西藥組n 10 10 10 10 10 CGRP 1.00±0.20 0.21±0.16▲▲1.35±0.20★1.22±0.04★★1.02±0.09★NPY 1.00±0.12 1.37±0.15 1.21±0.02 1.17±0.06 1.03±0.12

3 討論

現(xiàn)代醫(yī)學治療CD 以控制炎癥、緩解癥狀為治療目標，多使用糖皮質(zhì)激素、生物制劑及免疫抑制劑等作為治療手段[8]。 一旦確診，患者需要面對終身服藥的可能，長期使用產(chǎn)生較多不良反應，同時持續(xù)的西藥較為昂貴[9]，患者易產(chǎn)生恐懼心理，從而導致治療的依從性降低，對其社會功能產(chǎn)生嚴重影響[10]。艾灸和針刺作為我國中醫(yī)傳統(tǒng)治療方法，能夠多靶點、多通路的調(diào)節(jié)全身免疫系統(tǒng)功能，不僅效優(yōu)價廉，而且不良反應較少，且隨訪發(fā)現(xiàn)針灸對于慢性腸道疾病的療效明顯優(yōu)于西藥長期治療，在臨床上取得了良好的治療效果[11]?！端貑枴れ`蘭秘典論》中認為：“小腸者，受盛之官，化物出焉。 大腸者，傳道之官，變化出焉。 ”因此，推測腹痛、腹瀉等CD 的主要臨床癥狀，與“大腸傳導”和“小腸泌別清濁”的功能失常有關，其病位在腸。 針灸治療時辨經(jīng)論治，可選取“起于胃口，下循腹里”的足陽明胃經(jīng)，其經(jīng)脈循行穿過腸腑。天樞穴屬足陽明胃經(jīng)，同時是大腸募穴，符合“經(jīng)脈所過，主治所及”和“局部取穴”等針灸選穴規(guī)律[12]。天樞穴是治療腸腑病癥的要穴，更是運行全身氣機的樞紐，具有調(diào)暢全身氣機、調(diào)節(jié)腸腑功能的作用[13]。因此，本研究選取天樞穴局部皮膚組織，作為針灸治療CD 始動機制的觀察部位。

近年來，隨著皮膚-皮膚神經(jīng)-神經(jīng)內(nèi)分泌軸及免疫系統(tǒng)之間交互作用網(wǎng)絡研究的深入，皮膚與神經(jīng)、免疫、內(nèi)分泌系統(tǒng)之間的緊密聯(lián)系得到了進一步證實。 皮膚免疫細胞中朗格漢斯細胞、角質(zhì)形成細胞、肥大細胞等能夠激活和產(chǎn)生多種炎癥細胞因子和趨化因子，引起炎癥反應[14]。 同時，皮膚中肥大細胞與梅克爾細胞均能與感覺神經(jīng)發(fā)生交互作用，使得皮膚在神經(jīng)調(diào)節(jié)下發(fā)揮穩(wěn)定的效應機制[15]。 由此可見，皮膚不僅是物理屏障，它還是一個巨大的免疫器官、免疫場所，大量的免疫反應在此進行。 “皮膚-神經(jīng)-免疫”學說與傳統(tǒng)醫(yī)學的“臟腑-經(jīng)絡”相關理論有相似之處。 在“臟腑-經(jīng)絡”相關理論中，臟腑的異常改變可以反映到相應的體表穴區(qū)，表現(xiàn)出特定的癥狀和體征，同時刺激特定的穴位可對相應臟腑的生理功能和病理改變起到調(diào)節(jié)作用[16]。研究發(fā)現(xiàn)，針灸天樞穴、氣海穴能夠改善CD 大鼠的腸纖維化，下調(diào)結腸組織中TGF-β 蛋白、Smad4 蛋白及其mRNA 的表達，抑制腸上皮細胞的異常凋亡，保護腸上皮細胞屏障，減輕腸道炎性反應，從而抑制CD 導致的腸上皮纖維化[17]。可見，通過針灸干預相應的腧穴即可治療臟腑的病變，這給針灸治療CD 的機制研究提供了新的思路和方法。 而針灸等外治療法首先作用于腧穴局部的皮膚，其中，皮膚神經(jīng)肽是聯(lián)系皮膚免疫系統(tǒng)與神經(jīng)系統(tǒng)的橋梁，皮膚神經(jīng)末梢分泌神經(jīng)肽能影響活化的免疫細胞[14]。因此，本研究以皮膚免疫系統(tǒng)為切入點，觀察針灸對CD 模型大鼠天樞穴局部皮膚中相關炎癥因子的調(diào)節(jié)作用，旨在從皮膚免疫角度揭示針灸治療CD 的可能作用機制。

BK 是激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)的重要組成部分，能夠激活外周神經(jīng)纖維周圍非神經(jīng)細胞上的受體，間接作用于初級感覺神經(jīng)末梢，增大傷害性信息的傳入；通常激肽原在機體遭受過度激活和病理刺激時會產(chǎn)生促炎狀態(tài)[18]。 BK 通過緩激肽B2 受體影響腸道黏膜下神經(jīng)叢環(huán)氧合酶2 的表達，催化花生四烯酸轉化為前列腺素E2 并刺激其釋放，參與腸道炎癥反應[19]。 研究表明，BK 在炎性痛和神經(jīng)病理性痛的發(fā)生、維持中發(fā)揮重要的作用，BK 在疼痛的產(chǎn)生和傳導以及針刺鎮(zhèn)痛過程中起著不可或缺的作用[20]。本實驗模型組在結腸組織發(fā)生損傷、炎癥的情況下，天樞穴局部皮膚中BK 的含量明顯升高，表明天樞穴局部皮膚中致痛物質(zhì)BK 參與神經(jīng)纖維的激活和傳導，激肽原處于激活狀態(tài)，說明在CD 狀態(tài)下天樞穴局部皮膚存在炎性疼痛和神經(jīng)病理性疼痛反應；與模型組相比，艾灸組、針刺組和西藥組3 組大鼠天樞穴局部皮膚中BK 的含量均顯著降低，這可能預示著針灸和西藥都對CD 模型大鼠腸炎癥狀具有緩解作用，與天樞穴局部皮膚中穴區(qū)致痛物質(zhì)和炎癥介質(zhì)含量的調(diào)節(jié)有關。

CGRP 存在于皮膚的感覺神經(jīng)纖維中，主要由背神經(jīng)節(jié)合成，皮膚中淋巴細胞等非神經(jīng)細胞也可表達，傷害性感覺神經(jīng)刺激其末梢釋放CGRP 并傳導疼痛，CGRP 能直接作用于巨噬細胞和樹突細胞，參與調(diào)節(jié)全身炎癥反應，結腸段是CD 的高發(fā)部位，且CGRP 已被證實與結腸內(nèi)臟痛有著密切關系[21-22]；CGRP 可調(diào)節(jié)T 淋巴細胞增殖和細胞毒作用，促進T 淋巴細胞和巨噬細胞分泌TNF-α、IL-6、IL-12 和前列腺素等[23]；CGRP 能夠維持腸道黏膜的完整性，這可能是未來干預CD 等腸道疾病的重要手段[24-25]。研究發(fā)現(xiàn)，通過針灸使體內(nèi)CGRP 含量升高，對于結腸具有保護作用[25]。本研究結果顯示，針刺組和艾灸組天樞穴區(qū)皮膚中CGRP 蛋白相對表達量也顯著上升，猜測其原因可能為針灸刺激傷害性感覺神經(jīng)引起神經(jīng)遞質(zhì)CGRP 釋放，其后與機體皮膚中淋巴細胞、樹突細胞相互作用，調(diào)節(jié)相應細胞因子的分泌。由此推測，CGRP 可能參與了針刺和艾灸干預的皮膚免疫過程。

NPY 廣泛分布于人體的中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)，在皮膚中分布于真皮深層血管周圍[26]。 研究表明，NPY與腸道炎癥反應密切相關，NPY 在炎性腸病大鼠腸內(nèi)神經(jīng)元中的表達水平顯著上調(diào)[27]。 楊敏等[28]使用針灸治療腸易激綜合征模型大鼠，結果顯示針灸能夠改善其腦-腸軸失衡，下調(diào)肥大細胞數(shù)量，升高腦組織和腸組織中的NPY 濃度。 還有研究表明，艾灸足三里后，能夠調(diào)節(jié)局部組織中NPY 的含量，但針刺時含量變化不明顯[29]。本次實驗中，模型組與正常組大鼠之間，針刺組、艾灸組和西藥組3 個治療組與模型組之間對比，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），提示本研究所制備的CD 模型大鼠不足以引起其天樞穴局部皮膚中NPY 產(chǎn)生顯著性變化。

本次實驗通過現(xiàn)代技術手段證明，與正常大鼠相比，CD 模型大鼠天樞穴局部皮膚中CGRP 蛋白的相對表達顯著降低，BK 的含量顯著升高， 提示CD 大鼠天樞穴局部皮膚中BK、CGRP 的變化可能是腸腑病變在體表的客觀反映。 進一步來說，針灸能夠提高CD 模型大鼠穴區(qū)局部皮膚中的CGRP 蛋白水平，降低致痛因子BK 的含量，由此推測，針刺、艾灸對CD 模型大鼠癥狀有緩解作用， 可能與其對天樞穴局部皮膚組織神經(jīng)肽如BK、CGRP 含量的調(diào)節(jié)有關。