基于入血成分和網(wǎng)絡藥理學探討降香治療急性心肌梗死的潛在機制

李宗超，孫 康，汪旻峻，遲呈林，王 煒*，劉榮霞*

1.煙臺大學藥學院，新型制劑與生物技術藥物研究山東省高校協(xié)同創(chuàng)新中心、分子藥理和藥物評價教育部重點實驗室，山東 煙臺 264005；2.湖南中醫(yī)藥大學藥學院，湖南 長沙 410208

急性心肌梗死（acute myocardial infarction, AMI）是由于冠狀動脈急劇性供血不足導致的心肌壞死，是冠心病中危害性嚴重的一類病癥[1]。 我國AMI 病人超百萬，且發(fā)病率、死亡率呈快速上升趨勢，是威脅人類生命健康安全的重大隱患[2]。 降香是豆科植物降香檀Dalbergia odorifera T. Chen 樹干和根的干燥心材，收載于2020 版《中華人民共和國藥典》，其味辛、性溫，具有化瘀止血、理氣止痛的功效，具有較高的醫(yī)藥價值[3]。 現(xiàn)代研究表明，降香有抗炎、抗氧化等眾多藥理作用，可用于治療心血管疾病[4]。 降香提取物可改善心肌梗死大鼠的心功能障礙，其復方制劑如冠心Ⅱ號方、降香通脈湯等對AMI 也具有較好的臨床治療效果[5-7]。

網(wǎng)絡藥理學是一種基于系統(tǒng)生物學，通過構建“成分-靶點-通路-疾病”網(wǎng)絡，從整體的角度闡述藥物與疾病相互作用機制并挖掘藥效物質(zhì)基礎的學科，適用于中藥多靶點、多成分治療的特點[8]。 從中藥有效性角度來講，需先明確從藥材成分到入血成分的傳遞-轉化過程，才能挖掘中藥藥效物質(zhì)基礎[9]。然而，在以往的網(wǎng)絡藥理學研究中，多采用數(shù)據(jù)庫搜索中藥成分，不能保證選出的成分是可以吸收入血的物質(zhì)，從而無法保證這些成分的有效性。 因此，本文在課題組前期對降香的植物化學成分系統(tǒng)性分析的基礎上[10]，對降香的入血成進行表征，再采取網(wǎng)絡藥理學的方法，構建“入血成分-靶點-通路-疾病”網(wǎng)絡，系統(tǒng)分析降香治療AMI 的藥效成分及作用機制，并通過分子對接對其中的關鍵靶點與關鍵成分進行驗證。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

HB 10 旋轉蒸發(fā)儀（德國IKA 集團）；Waters Acquity H-class UPLC 系統(tǒng)（美國Waters 公司）；QExactiveTMOrbitrap HRMS 系統(tǒng)（美國Thermo Fisher Scientific 公司）。

乙酸、乙腈（色譜級，美國Merck 公司）；0.5%CMC-Na 溶液自制。

1.2 降香給藥溶液制備

降香購自北京同仁堂，粉碎過40 目篩。 稱取藥材粉末加入10 倍量的95%乙醇浸泡過夜，加熱回流提取1 h（重復3 次）。 將濾液合并，真空旋蒸得降香提取物粉末，用0.5% CMC-Na 溶液重懸。

1.3 動物與給藥方案

6 只雄性SPF 級SD 大鼠，體質(zhì)量（220±20） g，由濟南鵬悅實驗動物飼養(yǎng)有限公司提供，生產(chǎn)許可證號：SCXK（魯）2019-0003。 大鼠飼養(yǎng)于舒適環(huán)境中，動物實驗經(jīng)煙臺大學動物倫理委員會批準（2021-DA-04），實驗過程遵守《實驗動物管理條例》相關指南。實驗設置空白組與給藥組，給藥組灌胃劑量根據(jù)降香生藥臨床用量每人每日15 g[3]，通過體表面積法折算為降香醇提物320 mg/kg，空白組給予相同體積生理鹽水。

1.4 血清樣本的制備與處理

參考相關文獻[11-12]，分別在給藥前及給藥后0.25、0.5、1、2、4 h 于眼眶靜脈取血，3500 r/min 離心10 min，離心半徑8.6 cm，得血清樣本。 取200 μL血清，并加入800 μL 冰乙腈，渦旋1 min，并于12 000 r/min離心10 min，離心半徑8.6 cm。取上清液用氮氣吹干，加入100 μL 初始流動相渦旋復溶，12 000 r/min離心10 min，離心半徑8.6 cm，取上清液進樣分析。

1.5 UHPLC-Q-Orbitrap HRMS 分析

色 譜 條 件：Waters Acquity UPLC HSS T3 柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流速0.4 mL/min；柱溫40 ℃；進樣量5 μL。 流動相為0.05%乙酸水（A）、乙腈（B）。設置洗脫條件為0～19 min，17%～23%B；19～26 min，23%～25% B；26～36 min，25～40% B；36～41 min，40%～60% B；41～42 min，60%～90% B；42～44 min，90% B。

質(zhì)譜條件：在負離子模式下采用HESI 源通過Full MS/dd-MS2方式掃描。 掃描范圍50～800 m/z，噴霧電壓選擇-2.8 kV，離子源溫度設置350 ℃，輔助氣和吹掃氣流速分別為10 L/min 和0 L/min，歸一化碰撞能量分別為20、40、60 eV。

1.6 靶點的獲取

在TCMSP 數(shù)據(jù)庫和SwissTargetPrediction 數(shù)據(jù)庫中查找入血成分靶點。 以“acute myocardial infarction”為檢索詞在GeneCards、OMIM 數(shù)據(jù)庫獲取AMI的靶點。 在Genecards 數(shù)據(jù)庫中，Score 值高的靶點與疾病相關度高，因此，保留Score 值在中位數(shù)以上的靶點[13]。 合并數(shù)據(jù)庫搜索結果，刪除冗余條目，得成分與疾病的靶點。

1.7 PPI 網(wǎng)絡的構建與關鍵靶點的篩選

將成分和疾病的共有靶點導入STRING 11.5數(shù)據(jù)庫獲取PPI 網(wǎng)絡文件，并進一步通過Cytoscape 3.7.0 軟件分析網(wǎng)絡拓撲參數(shù)。Degree 反應節(jié)點與節(jié)點之間的相互聯(lián)系，Degree 值越大的節(jié)點其重要性越高。因此，關鍵靶點以2 倍Degree 值中位數(shù)為標準篩選。

1.8 通路富集與網(wǎng)絡構建

利用DAVID 6.8 數(shù)據(jù)庫對關鍵靶點進行富集分析，以P＜0.01 為篩選條件。 基于上述結果，通過Cytoscape 3.7.0 軟件構建“入血成分-靶點-通路-疾病”網(wǎng)絡。

1.9 分子對接

選擇PPI 網(wǎng)絡中Degree 值排名前6 的關鍵靶點與關鍵成分進行分子對接驗證。 通過在線數(shù)據(jù)庫搜索成分與靶標蛋白晶體結構，導入Sybyl-X 2.1.1軟件進行分子對接，以對接分值評價對接結合活性，分值越高表明對接活性越好。

2 結果

2.1 入血成分的鑒定

在降香提取物入血樣品總離子流圖中（圖1），對前期降香定性研究得到的成分進行搜索，對比空白血清、給藥血清與降香提取物質(zhì)譜數(shù)據(jù)，根據(jù)保留時間、一級質(zhì)量數(shù)和二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)，共鑒定出24 個降香入血成分（表1），包含異黃酮8 個、新黃酮4個、二氫異黃酮4 個、二氫黃酮3 個、查爾酮2 個、黃酮醇1 個、二氫異黃酮醇1 個、有機酸1 個。

表1 降香入血成分信息

圖1 降香提取物入血樣品總離子流圖

2.2 關鍵靶點與成分

通過檢索，獲得入血成分靶點516 個，疾病靶點1812 個，其中共有靶點248 個。 在PPI 網(wǎng)絡（圖2）中，根據(jù)條件篩選出56 個關鍵靶點。 而染料木素（genistein）、山柰酚（kaempferol）、柚皮素（naringenin）、甘草素（liquiritigenin）、大豆苷元（daidzein）、芒柄花黃素（formononetin）6 個成分連接關鍵靶點最多，可能在降香治療AMI 過程中起重要作用。

圖2 PPI 網(wǎng)絡圖

2.3 富集分析

富集結果按P 值排序，分別將富集排名靠前的通路可視化。GO 功能富集（圖3）顯示降香主要參與調(diào)節(jié)受體結合、激酶活性等分子功能，胞質(zhì)溶膠、血小板顆粒管腔等細胞組分，以及凋亡過程、蛋白激酶等生物過程。KEGG 富集（圖4）通路中，與AMI 相關的有PI3K/AKT 信號通路、HIF-1 信號通路、FOXO信號通路等。

圖3 GO 富集分析圖（排名前10）

圖4 KEGG 富集分析圖（排名前20）

2.4 復合網(wǎng)絡的構建

將篩選的關鍵靶點及其對應的成分、前20 條相關通路導入Cytoscape 軟件，構建“入血成分-靶點-通路-疾病”復合網(wǎng)絡（圖5）。 該網(wǎng)絡圖包含101 個節(jié)點、820 條邊。

圖5 “入血成分-靶點-通路-疾病”網(wǎng)絡圖

2.5 對接結果

根據(jù)相關文獻，對接分值在4.25 以上則表明成分與靶蛋白具有對接活性[14]。 對接結果（表2）顯示，活性成分與關鍵靶蛋白大部分具有結合活性，其中SRC、EGFR 與各成分的對接活性最好，表明其潛在活性相對較高。每個靶點選擇與其對接分值最高的成分進行可視化（圖6）。

圖6 成分與靶蛋白分子對接圖

表2 分子對接結果

3 討論

AMI 是由于冠狀動脈閉塞、心肌急劇缺血缺氧導致的心肌組織壞死。 粥樣斑塊內(nèi)部炎癥浸潤，以及缺氧導致的氧化應激激活、血管損傷等過程促進AMI 的發(fā)生和發(fā)展。 降香是一味活血化瘀中藥，能夠降低血瘀動物的血液黏度，改善梗死大鼠心肌組織損傷[15]。 因此，本文對降香治療AMI 的潛在機制展開研究。

本研究首先對降香的入血成分進行分析，并對其進行網(wǎng)絡藥理學研究。結果顯示黃酮類化合物是降香的主要入血成分，同時也是網(wǎng)絡藥理學研究預測的主要活性成分。 據(jù)報道，黃酮類化合物是降香中的主要活性成分之一，具有良好的心血管保護活性以及抗炎活性[16-17]。 另有研究發(fā)現(xiàn)，降香醇提物在體內(nèi)外均具有促進血管新生的作用，分析發(fā)現(xiàn)醇提物含有多種黃酮類成分，推測可能是其藥效成分[18]。上述成果提示，黃酮類成分可能是降香治療AMI 的重要藥效成分。

其次，研究通過PPI 網(wǎng)絡的拓撲參數(shù)篩選出關鍵靶點，并對其進行富集分析，探討可能調(diào)節(jié)的生物過程。 結果顯示相互作用較強的SRC、EGFR 等靶點以及富集程度較高的PI3K/AKT、FOXO、HIF-1 等信號通路，可能是降香改善AMI 的活性靶點與潛在通路。 PI3K/AKT 信號通路是體內(nèi)重要的調(diào)節(jié)體系，參與心功能障礙等多種生物學功能的調(diào)節(jié)[19-20]。而EGFR可與多種配體結合，作用于下游PI3K/AKT、MAPK等通路，參與細胞增殖、血管生成等作用[21]。 研究顯示，降香醇提物可通過作用于血管內(nèi)皮細胞生長因子受體和PI3K/MAPK 通路促進血管生成，芒柄花黃素可能是重要活性成分[18]。另外，柚皮素可通過介導PI3K/AKT 通路以及提高EGF 的表達等方式，促進大鼠梗死心肌的血管新生，改善大鼠心肌損傷[22-23]。FOXO 家族是一類重要的轉錄因子，其成員FOXO1誘導內(nèi)皮細胞損傷，抑制血管新生；且FOXO1 過表達會引起缺血/再灌注小鼠心肌梗死面積增加[24-25]。而染料木素可調(diào)控FOXO1 轉錄活性，改善小鼠的血管新生[26-27]。 研究顯示，HIF-1α 是機體介導低氧信號的重要轉錄因子，在AMI 患者血清中顯著增加[28]。山柰酚是膳食黃酮的一種，能夠有效抑制缺氧條件下的HIF-1 活性；也可以通過抑制NADPH 氧化酶活性，調(diào)控體內(nèi)活性氧水平，減輕AMI 致使的心肌損傷[29-30]。 SRC 作為一種酪氨酸蛋白激酶，參與能量代謝、細胞增殖等多種生物學功能調(diào)節(jié)；有研究顯示AMI 大鼠心肌組織SRC 被激活，抑制SRC 磷酸化則可減少心肌炎性浸潤，減輕AMI 病變[31-32]。芒柄花黃素可顯著抑制SRC 磷酸化，抑制炎癥反應[33]。 在本研究中，上述成分與SRC、EGFR 等關鍵靶點具有較好的對接活性，進一步提示黃酮類成分可能是降香治療AMI 的重要藥效成分，并通過調(diào)控SRC、EGFR等靶點以及PI3K/AKT 等信號通路，參與調(diào)節(jié)機體炎癥反應、氧化應激和血管新生等過程，治療AMI。

綜上所述，本實驗通過UHPLC-Q-Orbitrap HRMS技術，鑒定降香入血成分24 個，并借助網(wǎng)絡藥理學以及分子對接技術初步探索了降香治療AMI 的潛在機制，為其進一步的體內(nèi)、外研究提供理論依據(jù)。本研究是對作用機制的初步預測，今后需要進一步實驗進行驗證。