2 型糖尿病合并非酒精性脂肪性肝病肝細胞損傷模型的建立及探討

勾陽陽，曾廣嫻，喻 嶸*，陳 聰*

1.貴州中醫(yī)藥大學(xué)，貴州 貴陽 550025；2.黔西南州中醫(yī)院，貴州 興義 562400；3.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙 410208

非酒精性脂肪性肝?。╪on-alcoholic fatty liver disease,NAFLD）是2 型糖尿?。╰ype 2 diabetes, T2DM）的常見并發(fā)癥之一，二者相互影響，呈惡性促進[1-3]。高糖、高脂的過度攝入，使人體的碳水化合物、脂質(zhì)等物質(zhì)發(fā)生代謝紊亂，是導(dǎo)致T2DM 合并NAFLD發(fā)病的主要原因。 中醫(yī)學(xué)認為“毒損肝絡(luò)”病機在T2DM 合并NAFLD 發(fā)展過程中貫穿始終。前期研究也發(fā)現(xiàn)，T2DM 合并NAFLD 的中醫(yī)病機為氣陰兩虛、痰瘀互結(jié)、毒損肝絡(luò)[1-2]。 現(xiàn)代醫(yī)家普遍認為，“毒邪”泛指所有較甚的致病邪氣，其中包括六淫之邪較盛或較久的外毒、 體內(nèi)代謝產(chǎn)物蓄積蘊結(jié)而生的內(nèi)毒[4-5]。 “肝絡(luò)”是中醫(yī)絡(luò)病理論運用于內(nèi)傷雜病辨治的體現(xiàn)，“毒損肝絡(luò)”是指毒邪久傷肝絡(luò)，引起肝臟出現(xiàn)痰凝津滯、氣血瘀滯，以致氣機升降失調(diào)，營衛(wèi)不和，肝絡(luò)失養(yǎng)的病變過程。 在T2DM 合并NAFLD 的發(fā)病中，“肥甘之味”被認為是損傷“肝絡(luò)”的主要因素[6-8]。 根據(jù)病機，采用滋陰益氣、活血解毒法治療，發(fā)現(xiàn)可有效改善糖尿病MKR 鼠的血糖、血脂、肝功能[1-2]。 本課題組通過建立T2DM 合并NAFLD 的體外肝細胞損傷模型，改變肝細胞培養(yǎng)的微環(huán)境，模擬機體高糖、高脂環(huán)境下，肝細胞之間營養(yǎng)物質(zhì)和代謝產(chǎn)物交換的過程，使其形成“毒損肝絡(luò)”的狀態(tài)，進一步探討肝細胞損傷的機制，以期為中醫(yī)藥的治療提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 細胞

正常大鼠肝細胞系，購于上海中喬新舟生物科技有限公司（NO.ZQ0078），培養(yǎng)基：10%胎牛血清（fetal bovine serum, FBS）、90% DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)（1 mL 抗生素，含100 U/mL 青霉素及100 μg/mL 鏈霉素）；培養(yǎng)箱環(huán)境：5% CO2，37 ℃。 培養(yǎng)液2～3 d更換1 次，顯微鏡下觀察細胞生長密度達85%～95%傳代。 實驗場地由貴州中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院教學(xué)實驗中心提供。

1.2 主要試劑

DMEM 高糖培養(yǎng)基（美國Hyclone 公司，批號319005121）、胎牛血清（浙江天杭生物科技有限公司，批號18050302）。

1.3 主要儀器

CO2培養(yǎng)箱（賽默飛世爾科技，thermo scientific midi40）；超凈工作臺（蘇州智凈，SW-CJ-2G 型）。

2 方法

2.1 肝細胞形態(tài)學(xué)觀察

制備密度為1×105/mL 的細胞懸液，在6 孔板孔中，每孔加入1 mL 細胞懸液，放入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱。 培養(yǎng)24 h 后取出培養(yǎng)板，棄培養(yǎng)液，加入4%多聚甲醛固定約30 min，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline, PBS）洗3 次。 加入蘇木素染色液染核，1 min 后棄染色液PBS 洗5 次，于倒置光學(xué)顯微鏡下觀察。

2.2 肝細胞鑒定

調(diào)細胞密度為1×105/mL 的細胞懸液，6 孔板（放入爬片）加入1 mL 細胞懸液，放入37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱。培養(yǎng)24 h 后取出培養(yǎng)板，棄原培養(yǎng)液，PBS 洗2 次，加入4%多聚甲醛固定約30 min，PBS洗3 次，每次5 min。 滴加100 μL 1% Triton 至爬片孵育2 min，PBS 洗3 次，每次5 min；加入100 μL 5%牛血清白蛋白，室溫孵育30 min。 棄牛血清白蛋白，加入CK18 一抗（1∶100 用PBS 稀釋），放置4 ℃過夜。 加入PBS 洗3 次，每次5 min。 避光加入配置好的熒光二抗工作液，37 ℃孵育40 min，PBS 洗3次，每次5 min。 滴加100 μL 4'，6-二脒基-2-苯基吲哚工作液復(fù)染細胞核，室溫孵育4 min，PBS洗3次，每次5 min。 滴加一滴防淬滅熒光封片劑封片。激光共聚焦熒光顯微鏡下觀察、拍片。

2.3 肝細胞損傷模型建立

調(diào)5×104/mL 的細胞懸液，接種于96 孔板，每孔100 μL，放入37 ℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。 用不含F(xiàn)BS 的DMEM 基礎(chǔ)培養(yǎng)液撤血清培養(yǎng)6 h 后進行分組，正常組通過完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，高糖（high glucose,HG）組通過在完全培養(yǎng)基基礎(chǔ)上加入葡萄糖注射液，調(diào)D-葡萄糖終濃度為30、50、100、150、200 mmol/L；油酸（oleic acid, OA）組通過在完全培養(yǎng)基基礎(chǔ)上加入油酸溶液，終濃度為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mmol/L；再通過HG 5 個濃度組與OA 5 個濃度組排列組合，分設(shè)25 個聯(lián)合刺激組。 每個濃度設(shè)6 個復(fù)孔、5個干預(yù)時間點，每組均設(shè)調(diào)零孔加入培養(yǎng)基及干預(yù)藥物，不加細胞。 在培養(yǎng)12、24、36、48、60 h，分別取出培養(yǎng)板，每孔避光條件下加入CCK8 液10 μL，放入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)避光孵育2 h，酶標(biāo)儀450 nm 波長測各孔的OD 值，重復(fù)實驗3 次，取均值。 計算抑制率：抑制率=[（正常組OD 值-調(diào)零孔）-（實驗組OD 值-調(diào)零孔）]/（正常組OD 值-調(diào)零孔）。

2.4 油紅O 染色法

調(diào)細胞密度為1×105/mL 的細胞懸液，接種于6孔板，每孔1 mL，培養(yǎng)24 h 后取出培養(yǎng)板，撤血清同步化處理6 h，棄培養(yǎng)液，PBS 洗滌2 次，分為：正常組、HG 組（100 mmol/L D-葡萄糖）、OA 組（0.2 mmol/L OA）、HG+OA 組（100 mmol/L D-葡萄糖+0.2 mmol/L OA），每孔分別加入1 mL 對應(yīng)造模濃度的培養(yǎng)基，放入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。取出培養(yǎng)板，棄培養(yǎng)基，PBS洗滌2次， 加入細胞樣品固定液25 min，棄固定液，PBS 洗3 次。 加入油紅O 染色液，密閉染色15 min，棄染色液，PBS 洗5 次。加入Mayer 蘇木素染色液復(fù)染核1 min， 棄染色液，PBS洗5 次。 加入oro buffer 1 min，棄去后晾干。 于倒置光學(xué)顯微鏡下觀察、拍片。

2.5 生化指標(biāo)測定

分組及干預(yù)同“2.4”。每孔分別加入1mL 對應(yīng)造模濃度的培養(yǎng)基，放入37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。 取出培養(yǎng)板，收集培養(yǎng)液離心（3000 r/min，20 min）。 收集細胞，加入PBS 分別調(diào)整每組細胞密度為1.5×106/mL，超聲粉碎細胞，離心（3000 r/min，20 min）收集上清。在全自動生化分析儀上設(shè)置相應(yīng)參數(shù)，分別檢測細胞上清液中谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine transaminase, ALT）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate aminotransferase, AST）含量；細胞沉淀裂解后上清液中甘油三酯（triglyceride, TG）、總膽固醇（total cholesterol, TC）含量。

2.6 肝細胞CK8、CK18 蛋白檢測

分組及干預(yù)同“2.4”。 每孔分別加入1 mL 對應(yīng)造模濃度的培養(yǎng)基，放入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。 收集細胞后提總蛋白，蛋白定量，加入上樣緩沖液后變性。 取10 μg 蛋白，SDS-PAGE 凝膠電泳后轉(zhuǎn)膜，采用5%脫脂牛奶，封閉1 h；去封閉液后，稀釋一抗，4 ℃孵育過夜。 TBST 洗3 次，5 min/次。稀釋二抗（按照說明書），用二抗稀釋液室溫孵育膜1 h，用TBST 洗3 次，5 min/次。 采用增強化學(xué)發(fā)光液（enhanced chemiluminescence, ECL）化學(xué)法顯影，在全自動化學(xué)發(fā)光分析儀中拍照，讀取數(shù)據(jù)，采用β-actin 作為內(nèi)參校正。

2.7 肝細胞培養(yǎng)上清中炎癥因子含量測定

分組及干預(yù)同“2.4”。 每孔分別加入1 mL 對應(yīng)造模濃度的培養(yǎng)基，放入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。 收集上清液，離心（3000 r/min，5 min）后取上清，避光條件下取出試劑盒中酶標(biāo)板，按照酶聯(lián)免疫試劑盒說明書檢測肝細胞上清液中炎癥因子含量。重復(fù)實驗3 次，取均值，根據(jù)每個指標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)品濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，依據(jù)樣本OD 值及稀釋倍數(shù)，對照標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算每孔樣本的實際濃度。

2.8 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 26.0 統(tǒng)計軟件，數(shù)據(jù)滿足正態(tài)性和方差齊性檢驗，采用單因素方差分析（One-way ANOVA），結(jié)果以“±s”表示。 以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 肝細胞的鑒定

細胞形態(tài)：生長狀態(tài)良好的肝細胞直徑約20 μm，為多邊形，細胞核大而圓，位于細胞正中，部分細胞可以見到雙核；分化較好的細胞體伸出明顯的樹枝樣突起連接相鄰細胞，生長到融合狀態(tài)時，呈鋪路石樣外觀。 免疫熒光染色：細胞核呈藍色熒光，CK18蛋白陽性表達呈紅色熒光。 詳見圖1。

圖1 肝細胞形態(tài)及CK18 蛋白表達（免疫熒光，×400）

3.2 各組肝細胞增殖抑制率的比較

與正常組相比，當(dāng)D-葡萄糖終濃度為150 mmol/L 時，肝細胞增殖開始出現(xiàn)抑制（P＜0.01）；當(dāng)D-葡萄糖終濃度為200 mmol/L 時，各時間點肝細胞增殖受到顯著抑制（P＜0.01）。0.1 mmol/L OA 刺激肝細胞36、48、60 h 與0.2 mmol/L OA 刺激肝細胞24、36、48、60 h 同0.3、0.4、0.5 mmol/L 各時間點刺激肝細胞OD值與正常組對比明顯下降（P＜0.01 或P＜0.05），且肝細胞增殖抑制率隨OA 濃度增加及刺激時間延長呈上升趨勢。 肝細胞經(jīng)HG 聯(lián)合OA 刺激，30 mmol/L HG+0.1 mmol/L OA 刺激12 h，50 mmol/L HG+0.1 mmol/L OA刺激12 h、24 h、36 h，50 mmol/L HG+0.2 mmol/L OA 刺激12 h 均未出現(xiàn)抑制作用，其余各組聯(lián)合濃度刺激均表現(xiàn)出明顯抑制作用（P＜0.01），經(jīng)100 mmol/L HG 聯(lián)合0.2 mmol/L OA 刺激肝細胞24 h 后，細胞增殖抑制率接近半數(shù)抑制濃度。 見表1～3。

表1 不同濃度HG 對細胞增殖OD 值的影響（±s，n=6）

表1 不同濃度HG 對細胞增殖OD 值的影響（±s，n=6）

注：與正常組比較，**P＜0.01。

分組正常組30 mmol/L HG 組50 mmol/L HG 組100 mmol/L HG 組150 mmol/L HG 組200 mmol/L HG 組12 h 0.81±0.01 0.92±0.03**1.03±0.06**0.99±0.08**0.77±0.02**0.31±0.01**24 h 1.07±0.05 1.49±0.02**1.64±0.05**1.43±0.03**0.87±0.03**0.24±0.01**36 h 1.19±0.01 1.92±0.02**1.96±0.05**2.19±0.03**0.95±0.02**0.40±0.02**48 h 1.34±0.03 1.74±0.04**2.02±0.06**2.23±0.01**1.05±0.04**0.22±0.02**60 h 1.56±0.03 2.44±0.04**2.48±0.02**2.77±0.02**1.25±0.02**0.61±0.02**

表2 不同濃度OA 對細胞增殖OD 值的影響（±s，n=6）

表2 不同濃度OA 對細胞增殖OD 值的影響（±s，n=6）

注：與正常組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

分組正常組0.1 mmol/L OA 組0.2 mmol/L OA 組0.3 mmol/L OA 組0.4 mmol/L OA 組0.5 mmol/L OA 組12 h 0.81±0.01 1.04±0.06**1.05±0.05**0.62±0.02**0.42±0.02**0.22±0.02**24 h 1.07±0.05 1.08±0.03 1.00±0.06**0.36±0.03**0.32±0.02**0.21±0.01**36 h 1.19±0.01 1.14±0.02*1.02±0.05**0.35±0.03**0.21±0.04**0.20±0.02**48 h 1.34±0.03 1.17±0.07**1.05±0.03**0.18±0.001**0.17±0.004**0.19±0.01**60 h 1.56±0.03 1.32±0.07**1.22±0.01**0.25±0.04**0.18±0.02**0.2±0.01**

表3 HG 聯(lián)合OA 對肝細胞增殖抑制率的影響（n=6）

3.3 各組肝細胞內(nèi)脂滴的比較

與正常組相比，油紅O 染色顯示，肝細胞經(jīng)100 mmol/L HG 組刺激24 h 后，細胞質(zhì)內(nèi)開始出現(xiàn)少量脂滴；經(jīng)0.2 mmol/L OA 組刺激24 h 后，細胞內(nèi)脂滴明顯多于正常組和HG 組；經(jīng)100 mmol/L HG聯(lián)合0.2 mmol/L OA 刺激24 h 后，HG+OA 組細胞內(nèi)脂滴出現(xiàn)大量蓄積，均多于正常組、HG 組及OA 組。詳見圖2。

圖2 肝細胞脂肪變性（油紅O 染色，×400）

3.4 各組肝細胞ALT、AST、TG、TC 含量的比較

與 正 常 組 相 比，HG 組、OA 組 及HG+OA 組ALT、AST、TG、TC 指標(biāo)均升高（P＜0.01 及P＜0.05）。與HG 組、OA 組比較，HG+OA 組ALT、AST、TC 指標(biāo)均顯著高于HG 組（P＜0.01 及P＜0.05）。詳見表4。

表4 各組肝細胞生化指標(biāo)（±s，n=6）

表4 各組肝細胞生化指標(biāo)（±s，n=6）

注：與正常組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與HG 組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；與OA 組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。

組別正常組HG 組OA 組HG+OA 組ALT/（U/L）25.11±0.92 29.42±2.64*34.97±0.62**41.54±1.50**▲▲△△AST/（U/L）22.24±1.46 29.28±1.24**30.04±1.57**38.18±1.53**▲▲△△TG/（mmol/L）0.39±0.02 0.44±0.01**0.43±0.03*0.48±0.01**△TC/（mmol/L）0.59±0.04 0.75±0.08**0.70±0.05*0.86±0.02**▲△△

3.5 各組肝細胞內(nèi)CK8、CK18 蛋白的比較

與正常組相比，HG 組、OA 組及HG+OA 組細胞內(nèi)CK8、CK18 蛋白表達均增加（P＜0.01）；與HG 組比較，HG+OA 組細胞內(nèi)CK8、CK18 蛋白表達均顯著高于HG 組（P＜0.01）；與OA 組比較，HG+OA 組細胞內(nèi)CK8、CK18 蛋白表達均顯著高于OA 組（P＜0.01及P＜0.05）。 詳見表5、圖3。

圖3 各組肝細胞內(nèi)CK8、CK18 蛋白相對表達量

表5 各組肝細胞內(nèi)CK8、CK18 蛋白相對表達量（±s，n=6）

表5 各組肝細胞內(nèi)CK8、CK18 蛋白相對表達量（±s，n=6）

注：與正常組比較，**P＜0.01；與HG 組比較，▲▲P＜0.01；與OA 組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。

組別正常組HG 組OA 組HG+OA 組CK8/β-Actin 0.06±0.04 0.53±0.08**0.70±0.04**0.80±0.03**▲▲△CK18/β-Actin 0.06±0.02 0.09±0.01 0.13±0.03**0.20±0.01**▲▲△△

3.6 各組肝細胞上清中NLRP-3、Caspase-1、IL-1β含量的比較

與正常組相比，HG 組和HG+OA 組細胞培養(yǎng)上清中炎癥因子NLRP-3、Caspase-1、IL-1β 含量均增加（P＜0.01 及P＜0.05）。 與HG 組比較，HG+OA 組細胞培養(yǎng)上清中炎癥因子NLRP-3、Caspase-1、IL-1β含量均顯著升高（P＜0.01）。 與OA 組比較，HG+OA組細胞培養(yǎng)上清中炎癥因子NLRP-3、Caspase-1、IL-1β 含量均顯著升高（P＜0.01）。 詳見表6。

表6 各模型組肝細胞培養(yǎng)上清NLRP-3、Caspase-1、IL-1β 含量（±s，n=6）

表6 各模型組肝細胞培養(yǎng)上清NLRP-3、Caspase-1、IL-1β 含量（±s，n=6）

注：與正常組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與HG 組比較，▲▲P＜0.01；與OA 組比較，△△P＜0.01。

NLRP-3/（ng/mL）18.42±0.91 19.78±0.26*19.40±0.13 21.65±0.52**▲▲△△Caspase-1/（pmol/L）29.83±0.23 34.59±0.42**35.82±0.84**41.02±1.75**▲▲△△IL-1β/（pg/mL）36.10±0.33 39.77±1.37**41.87±0.07**47.86±0.56**▲▲△△組別正常組HG 組OA 組HG+OA 組

4 討論

《非酒精性脂肪性肝病防治指南（2018 更新版）》中指出，NAFLD 的診斷除病理學(xué)影像學(xué)發(fā)現(xiàn)肝組織脂肪變性外，肝臟生物化學(xué)指標(biāo)異常是主要診斷依據(jù)，其中包括血清氨基酸轉(zhuǎn)移酶和（或）TG 的持續(xù)增高。 該指南中還指出，當(dāng)NAFLD 合并T2DM 時，血清氨基酸轉(zhuǎn)移酶和（或）CK-18 的持續(xù)增高的患者是診斷NASH 的高危人群[9]。 本實驗通過油紅O 染色及細胞生化檢測發(fā)現(xiàn)，HG 聯(lián)合OA 誘導(dǎo)的肝細胞脂滴蓄積以及TG、TC 指標(biāo)均顯著高于正常培養(yǎng)的肝細胞，同時HG 聯(lián)合OA 誘導(dǎo)肝細胞后，細胞培養(yǎng)上清中的ALT、AST 含量顯著高于正常組。提示肝細胞出現(xiàn)脂肪變性，肝細胞功能受損。通過檢測細胞培養(yǎng)上清中的NLRP-3、Caspase-1、IL-1β 炎癥因子含量，發(fā)現(xiàn)HG 聯(lián)合OA 誘導(dǎo)肝細胞后，細胞培養(yǎng)上清中的相關(guān)炎癥因子含量顯著高于正常組，提示誘導(dǎo)后的細胞中NLRP-3 相關(guān)炎癥信號通路被過度激活，肝細胞內(nèi)產(chǎn)生炎癥反應(yīng)。 有研究發(fā)現(xiàn)CK8 以及CK18 的異常，與癌癥及肝臟的損傷程度呈正相關(guān)[10-11]。通過檢測肝細胞內(nèi)的CK8、CK18 蛋白的表達發(fā)現(xiàn)，HG 聯(lián)合OA 組的CK8、CK18 蛋白表達較正常組均顯著升高，進一步說明HG 聯(lián)合OA 可誘導(dǎo)肝細胞發(fā)生損傷。 相比單純HG 或OA 刺激，HG 聯(lián)合OA 誘導(dǎo)肝細胞損傷更顯著，提示T2DM 合并NAFLD 體外細胞損傷模型成功建立。

研究認為肝臟中的微循環(huán)是“肝絡(luò)”的基本構(gòu)成[12]。南征教授團隊通過實驗發(fā)現(xiàn)，“毒損肝絡(luò)”的現(xiàn)代病理機制是肝內(nèi)炎癥反應(yīng)[13]。通過文獻研究發(fā)現(xiàn)，“毒損肝絡(luò)”病機在T2DM 合并NAFLD 發(fā)展過程貫穿始終，其中的“毒”既是病理產(chǎn)物，又是致病因素，這與細胞炎癥因子的作用軌跡具有相似性[14-16]。 “毒”在機體代謝中均存在惡性循環(huán)。清代醫(yī)家葉天士言：“經(jīng)主氣，絡(luò)主血”，“初為氣結(jié)在經(jīng)，久則血傷入絡(luò)”（《臨證指南醫(yī)案》），體現(xiàn)了邪毒致病從無形到有形的過程[17-19]。 基于吳以嶺教授團隊近年來總結(jié)前人經(jīng)驗提出的“絡(luò)脈—微血管”論[20]，結(jié)合肝臟微循環(huán)的生理功能，本實驗在建立T2DM 合并NAFLD 的體外細胞損傷模型時，通過改變肝細胞培養(yǎng)的微環(huán)境，模擬機體高糖、高脂環(huán)境下，肝臟微循環(huán)與肝細胞之間營養(yǎng)物質(zhì)和代謝產(chǎn)物交換的過程，制備“毒損肝絡(luò)”細胞損傷模型。 當(dāng)100 mmol/L HG 聯(lián)合0.2 mmol/L OA 誘導(dǎo)肝細胞24 h 培養(yǎng)條件下，肝細胞增殖出現(xiàn)半數(shù)抑制，肝功能出現(xiàn)明顯改變，肝細胞脂肪變性、炎癥反應(yīng)和細胞損傷程度遠高于HG 組合OA 組，提示高糖高脂環(huán)境改變肝臟微循環(huán)條件，相當(dāng)于疾病久積“血傷入絡(luò)”的狀態(tài)。

中醫(yī)學(xué)認為T2DM 合并NAFLD 的主要病因之一為過食“肥”“甘”，本實驗基于中醫(yī)理論及前期研究認識，運用HG 聯(lián)合OA 模擬病因，制造“毒損肝絡(luò)”的狀態(tài)，再依據(jù)T2DM 合并NAFLD 病機演變，早期（脾氣虧虛）、中期（濕熱內(nèi)蘊）、后期（肝腎陰虛、痰瘀互結(jié)），發(fā)現(xiàn)本實驗?zāi)Ｐ徒M肝細胞內(nèi)脂質(zhì)大量蓄積，肝細胞功能受損，出現(xiàn)了形質(zhì)和功能的同時改變。 此時的肝細胞更接近于T2DM 合并NAFLD 中后期的改變，細胞內(nèi)產(chǎn)生有形實邪的蓄積和相互搏結(jié)。 同時，肝細胞內(nèi)炎癥因子NLRP-3、Caspase-1、IL-1β 含量均升高，提示“毒損肝絡(luò)”狀態(tài)下存在肝內(nèi)炎癥的發(fā)生，且其發(fā)生的物質(zhì)基礎(chǔ)可能與NLRP-3 炎性小體及其下游炎性分子的過度活化有關(guān)。 因此，針對脾氣虧虛、濕熱內(nèi)蘊、肝腎陰虛、痰瘀互結(jié)導(dǎo)致“毒損肝絡(luò)”病機，可采用滋陰益氣活血解毒法，使得肝細胞內(nèi)外炎性微環(huán)境得到改善，則肝絡(luò)疏達；肝細胞功能得到改善，則肝體得養(yǎng)；同時肝細胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積含量明顯減少，則肝積得化；從而從根本上達到改善肝細胞損傷的目的。