補(bǔ)陽(yáng)還五湯調(diào)節(jié)鐵代謝蛋白改善腦缺血神經(jīng)元損傷的研究

梁 祺，吳海輝，王珊珊，楊 彤，葛金文，2*

1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合心腦疾病防治湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410208；

2.湖南省中醫(yī)藥研究院，湖南 長(zhǎng)沙 410006

腦缺血是指由于各種原因引起腦血管堵塞導(dǎo)致組織缺血缺氧壞死，出現(xiàn)偏癱、意識(shí)障礙等以神經(jīng)功能損傷為主的疾病。 腦缺血是一個(gè)持續(xù)數(shù)小時(shí)甚至數(shù)天的空間以及時(shí)間變化的事件，發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，自由基損傷、鈣超載等許多病理生理過(guò)程參與了病程進(jìn)展[1]。 鐵是機(jī)體必需的微量元素，參與了氧的轉(zhuǎn)運(yùn)與利用和髓鞘蛋白合成等過(guò)程，與腦發(fā)育和代謝等生理過(guò)程密切相關(guān)[2]。 研究表明，在腦缺血后出現(xiàn)顯著腦鐵代謝紊亂，鐵沉積會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)元損傷加重[3]。補(bǔ)陽(yáng)還五湯是益氣活血法的代表方，是中醫(yī)臨床治療腦缺血的經(jīng)典方劑。許多研究證明，補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)腦缺血的治療效果顯著，能夠降低腦缺血后鐵沉積[4-6]。本研究通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)?zāi)M半體內(nèi)環(huán)境，以補(bǔ)陽(yáng)還五湯為干預(yù)藥物，探討補(bǔ)陽(yáng)還五湯調(diào)控腦缺血后鐵穩(wěn)態(tài)失衡，改善神經(jīng)元損傷的作用機(jī)制。

1 材料

1.1 動(dòng)物來(lái)源

18 只SPF 級(jí)SD 雄性大鼠，體質(zhì)量200～220 g，購(gòu)于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司[許可證號(hào)：SCXK（湘）2019-0004，質(zhì)量合格證號(hào)：430727201101237013]。飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[使用許可證編號(hào)：SYXK（湘）2019-0009]。 環(huán)境溫度（24.0±0.5） ℃，相對(duì)濕度50%～60%，自由攝食，晝夜光照，適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d。 本研究經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)（倫理編號(hào)：LL201907230006）。

1.2 細(xì)胞來(lái)源

大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞系PC12 細(xì)胞株，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)，貨號(hào)：TCR9。

1.3 藥物制備

補(bǔ)陽(yáng)還五湯藥物組成：生黃芪120 g，當(dāng)歸6 g，赤芍5 g，川芎3 g，地龍3 g，紅花3 g，桃仁3 g（批號(hào)分別為2102003C、2102004C、2107008C、2109015C、2102001C、2103003C、2109002S）。 中藥均購(gòu)自湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)劉林副教授鑒定，符合2015 年版《中國(guó)藥典中藥材及飲片彩色圖鑒》規(guī)定[7]。 取標(biāo)準(zhǔn)中藥飲片加蒸餾水6～8 倍量，分煎2 次后混勻合并，濾過(guò)，濃縮至含生藥2 g/mL，4 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆?。去鐵酮片（批號(hào)H20140379），購(gòu)自加拿大奧貝泰克制藥有限公司，臨用現(xiàn)配。

1.4 主要試劑與儀器

PBS 緩沖液（批號(hào)：PB120327，武漢普諾賽生命科技有限公司）；DMEM 高糖培養(yǎng)基（批號(hào)：PM150210,武漢普諾賽生命科技有限公司）；DMEM 無(wú)糖培養(yǎng)基（批號(hào)：PM150270, 武漢普諾賽生命科技有限公司）；胰蛋白酶（批號(hào)：PB180226，武漢普諾賽生命科技有限公司）；青鏈霉素（批號(hào)：PB180120，武漢普諾賽生命科技有限公司）；CCK-8 試劑盒（批號(hào)：ECK-A362，武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司）；BCA 試劑盒（批號(hào)：E-BC-K318-M，武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司）；活性氧（reactive oxygen species, ROS）測(cè)定試劑盒（批號(hào)：E004-1-1，南京建成生物工程研究所）；超氧化物歧化酶活力（superoxide dismutase, SOD）測(cè)定試劑盒（批號(hào)：A001-3-2，南京建成生物工程研究所）；丙二醛（malondialdehyde, MDA）測(cè)定試劑盒（批號(hào)：A003-1-2，南京建成生物工程研究所）；轉(zhuǎn)鐵蛋白受體（transferrin receptor,TFR）多克隆抗體（批號(hào)：A5865，武漢愛(ài)博泰克生物科技有限公司）；鐵調(diào)素（hepcidin, HEP）多克隆抗體（批號(hào)：ab30760，Abcam 公司）；膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（ferroportin, FPN）多克隆抗體（批號(hào)：ab58695，Abcam 公司）；GAPDH 抗體（批號(hào)：10494-1-AP，武漢三鷹生物技術(shù)有限公司）；山羊抗小鼠（批號(hào)：EAB-1001，武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司）；山羊抗兔（批號(hào)：E-AB-1003，武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司）；甲醇（批號(hào)：10014118，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；Tween-20（批號(hào)：#T8220，北京索萊寶科技有限公司）；ECL 化學(xué)發(fā)光底物（批號(hào)：170-5，伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品(上海)有限公司）；CO2培養(yǎng)箱（型號(hào)：3131，賽默飛世爾科技公司）；全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)（型號(hào)：Tanon5200，上海天能公司）。

2 方法

2.1 動(dòng)物處理

18 只SD 雄性大鼠隨機(jī)分為6 組，分別予以極低、低、中、高劑量補(bǔ)陽(yáng)還五湯藥液、鐵離子螯合劑去鐵酮片和等量的生理鹽水灌胃，1 mL/100 g，1 次/d。補(bǔ)陽(yáng)還五湯中劑量為25.8 g/kg（按60 kg 成年人每日劑量生藥為依據(jù)，大鼠劑量按體表面積換算，相當(dāng)人臨床等效劑量的2 倍）。 極低、低、中、高劑量濃度比為0.5∶1∶2∶4。 連續(xù)灌胃7 d 后，末次給藥1 h 后腹主動(dòng)脈采血，3.8%枸櫞酸鈉抗凝（1∶9），4 ℃、3000 r/min（離心半徑r=15.9 cm） 離心15 min 取上清液，0.22 μm孔篩過(guò)濾滅菌后置于-80 ℃留存?zhèn)溆谩?各給藥組各鼠血漿等量混合即為含藥血漿， 空白組各鼠血漿等量混合即為空白血漿。

2.2 細(xì)胞OGD 模型建立

按照GOLDBERG 等[8]的方法進(jìn)行改良處理，細(xì)胞培養(yǎng)液換為預(yù)先通以缺氧混合氣（94% N2+5%CO2+1% O2）30 min 的無(wú)糖培養(yǎng)液，隨后將細(xì)胞立即置于缺氧密閉室內(nèi)，繼續(xù)通予缺氧混合氣，于37 ℃飽和濕度條件下培養(yǎng)。 OGD 損傷6 h 后進(jìn)行藥物干預(yù)[9-10]。

2.3 實(shí)驗(yàn)分組及給藥

2.3.1 篩選補(bǔ)陽(yáng)還五湯最佳給藥濃度 細(xì)胞正常培養(yǎng)后分為正常組、模型組、空白血漿組、補(bǔ)陽(yáng)還五湯含藥血漿組（極低、低、中、高劑量組），共7 組。 采用三氣培養(yǎng)箱進(jìn)行氧糖剝奪（oxygen-glucose depriva tion, OGD）造模。根據(jù)羅銀河和陳剛等[11-12]實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇10%含藥血漿進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，各組細(xì)胞造模后分別給予等體積相應(yīng)10%含藥血漿的培養(yǎng)基干預(yù)。 繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后進(jìn)行細(xì)胞活力檢測(cè)，同時(shí)顯微鏡下觀測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)。

2.3.2 藥物干預(yù)各組細(xì)胞 確定補(bǔ)陽(yáng)還五湯最佳給藥濃度后，細(xì)胞分為正常組、模型組、補(bǔ)陽(yáng)還五湯最佳含藥血漿組（低劑量組）、去鐵酮組，共4 組。 采用三氣培養(yǎng)箱進(jìn)行OGD 造模。正常組和模型組使用含有10%空白血漿的基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)，補(bǔ)陽(yáng)還五湯最佳含藥血漿組和去鐵酮組分別使用含10%各自藥物的基礎(chǔ)培養(yǎng)基處理。藥物干預(yù)24 h 后進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè)。

2.4 指標(biāo)檢測(cè)

2.4.1 CCK-8 法檢測(cè)細(xì)胞活性 細(xì)胞接種于96 孔板，除正常組外，其余各組完成OGD 造模并進(jìn)行含藥血漿干預(yù)后，向每個(gè)孔中加入CCK-8 溶液10 μL，轉(zhuǎn)移培養(yǎng)板到培養(yǎng)箱中孵育1 h，然后在酶標(biāo)儀450 nm 處測(cè)量各組OD 值并進(jìn)行計(jì)算。

2.4.2 檢測(cè)ROS 含量 將DCFH-DA 按照1∶1000用無(wú)血清培養(yǎng)液稀釋，終濃度為10 μmol /L。 細(xì)胞經(jīng)過(guò)OGD 造模后去除原有培養(yǎng)液，每個(gè)皿加入不少于1 mL 稀釋后的DCFH-DA，充分蓋住細(xì)胞。 37 ℃下孵育20 min。 再用無(wú)血清培養(yǎng)液輕洗細(xì)胞3 次，去除多余的DCFH-DA。 在熒光分光光度計(jì)下調(diào)整激發(fā)波長(zhǎng)488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)525 nm 進(jìn)行檢測(cè)。

2.4.3 檢測(cè)SOD 活力 細(xì)胞經(jīng)OGD 造模并進(jìn)行含藥血漿培養(yǎng)基干預(yù)，消化吹打后將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)入離心管，1000 r/min（離心半徑r=15.9 cm）離心10 min，棄上清，冰上裂解沉淀細(xì)胞20 min，充分裂解后將樣品12 000 r/min（離心半徑r=8.6 cm）離心10 min，取上清，按試劑盒說(shuō)明書(shū)配制工作液進(jìn)行SOD 檢測(cè)，同時(shí)用BCA 試劑盒測(cè)定蛋白濃度，按公式計(jì)算SOD 活力。

2.4.4 檢測(cè)MDA 含量 細(xì)胞經(jīng)OGD 造模并進(jìn)行含藥血漿培養(yǎng)基干預(yù)，消化吹打后將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)入離心管，1000 r/min（離心半徑r=15.9 cm）離心10 min，棄上清，冰上裂解沉淀細(xì)胞20 min，充分裂解后將樣品12 000 r/min（離心半徑r=8.6 cm）離心10 min，取上清，按試劑盒說(shuō)明書(shū)配制工作液進(jìn)行MDA 檢測(cè)，同時(shí)用BCA 試劑盒測(cè)定蛋白濃度，按公式計(jì)算MDA 含量。

2.4.5 Western blot 檢測(cè)TFR、HEP、FPN 蛋白的表達(dá)水平 細(xì)胞經(jīng)OGD 造模并進(jìn)行含藥血漿培養(yǎng)基干預(yù)，洗滌后加入RIPA 裂解液和蛋白酶抑制劑，裂解后離心，取上清液并采用BCA 測(cè)量蛋白濃度，制備SDS 上樣液，-80 ℃保存。制備10%分離膠和5%濃縮膠，上樣后進(jìn)行蛋白電泳，轉(zhuǎn)膜1.5 h 后脫脂牛奶室溫封閉1 h，TBST 稀釋一抗 （Hepcidin 稀釋比為1∶500，TFR 稀 釋比 為1∶1000，F(xiàn)PN 稀 釋 比 為1∶500，GAPDH 稀釋比為1∶5000），4 ℃孵育，過(guò)夜。 次日洗膜，滴加相應(yīng)二抗（山羊抗兔1∶8000、山羊抗小鼠1∶8000）后37 ℃孵育1 h，最后顯色并進(jìn)行分析。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 篩選補(bǔ)陽(yáng)還五湯含藥血漿最佳給藥濃度

與正常組比較，模型組細(xì)胞存活力出現(xiàn)顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，空白血漿組的細(xì)胞活力無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而補(bǔ)陽(yáng)還五湯各劑量含藥血漿組的細(xì)胞活力均出現(xiàn)明顯升高（P＜0.05）；與低劑量組比較，中劑量、高劑量含藥血漿組的細(xì)胞活力出現(xiàn)明顯下降（P＜0.01），極低劑量組細(xì)胞活力有下降趨勢(shì)，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 詳見(jiàn)圖1。

圖1 補(bǔ)陽(yáng)還五湯含藥血漿濃度梯度的細(xì)胞活性比較

3.2 不同藥物對(duì)細(xì)胞活力的影響

顯微鏡觀察各組間細(xì)胞形態(tài)改變的結(jié)構(gòu)如圖2所示，正常組細(xì)胞形態(tài)規(guī)整，呈兩級(jí)或多級(jí)，胞體大而明顯，樹(shù)突相互纏繞。與正常組比較，模型組細(xì)胞出現(xiàn)顯著損傷，細(xì)胞數(shù)目明顯減少，形態(tài)凌亂，樹(shù)突明顯稀疏、長(zhǎng)度縮短，細(xì)胞活力顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，低劑量組和去鐵酮組的細(xì)胞損傷情況明顯改善，細(xì)胞數(shù)目明顯增加，形態(tài)明顯規(guī)整，樹(shù)突明顯增加，細(xì)胞活力顯著升高（P＜0.01）。細(xì)胞活力檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖2 各組間細(xì)胞形態(tài)比較（×200）

圖3 各組間細(xì)胞活力比較

3.3 不同藥物對(duì)各組間細(xì)胞ROS 含量的影響

與正常組比較，模型組細(xì)胞損傷明顯，ROS 含量急劇升高（P＜0.01）；與模型組比較，低劑量組和去鐵酮組的細(xì)胞ROS 含量明顯下降（P＜0.01）。詳見(jiàn)圖4。

圖4 各組間細(xì)胞ROS 含量比較

3.4 不同藥物對(duì)各組間細(xì)胞SOD 的影響

與正常組比較，模型組細(xì)胞SOD 活力顯著下降（P＜0.01）；與模型組比較，低劑量組和去鐵酮組的細(xì)胞SOD 活力出現(xiàn)明顯上升趨勢(shì)（P＜0.05）。詳見(jiàn)圖5。

圖5 各組間細(xì)胞SOD 活力比較

3.5 不同藥物對(duì)各組間細(xì)胞MDA 的影響

與正常組比較，模型組細(xì)胞過(guò)氧化損傷明顯，MDA含量顯著上升（P＜0.01）；與模型組比較，低劑量組和去鐵酮組的細(xì)胞MDA 含量明顯下降（P＜0.01）。詳見(jiàn)圖6。

圖6 各組間MDA 含量比較

3.6 Western blot 檢測(cè)TFR、HEP、FPN 蛋白的表達(dá)水平

與正常組比較，模型組TFR 和HEP 蛋白表達(dá)顯著增加（P＜0.01），F(xiàn)PN 蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，低劑量組和去鐵酮組TFR和HEP 蛋白的相對(duì)表達(dá)量均有不同程度下降（P＜0.05），F(xiàn)PN 蛋白表達(dá)水平明顯升高（P＜0.01）。 詳見(jiàn)圖7。

圖7 各組間TFR、HEP、FPN 蛋白表達(dá)水平比較

4 討論

臨床調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，中國(guó)是世界上卒中發(fā)病率較高的國(guó)家之一，其中缺血性卒中占我國(guó)卒中分型的69.6%～70.8%[13-14]。 研究發(fā)現(xiàn)，興奮性毒性、離子失衡、氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡等因素均可導(dǎo)致腦組織功能障礙，從而加重腦卒中的損傷[15-16]。 鐵是人體最豐富的過(guò)渡金屬元素，在生理狀態(tài)下鐵攝取、利用及儲(chǔ)存處于穩(wěn)態(tài)；病理情況下，鐵超載可引起細(xì)胞內(nèi)過(guò)氧化反應(yīng)，鐵穩(wěn)態(tài)被打破[17]。鐵聚集性沉積可導(dǎo)致肝臟、心臟等器官出現(xiàn)病變，腦卒中后鐵沉積通過(guò)Fenton 反應(yīng)加重神經(jīng)系統(tǒng)功能紊亂[18-19]。

TF 是一類可逆的結(jié)合鐵的糖蛋白，與TFR 結(jié)合后形成復(fù)合體，通過(guò)胞吞方式將鐵轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)[20-22]。FPN 是目前已知唯一的膜鐵輸出蛋白，在各種細(xì)胞中FPN 蛋白的表達(dá)普遍存在[23]。 HEP 被認(rèn)為是機(jī)體鐵代謝轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的主要調(diào)節(jié)分子，其表達(dá)受到炎癥和激素等信號(hào)通路的調(diào)節(jié)[24-26]。 研究發(fā)現(xiàn)，HEP 能夠與FPN 直接作用，促進(jìn)FPN 內(nèi)化降解，同時(shí)抑制十二指腸處的鐵吸收和利用[27]，二者形成的HEP-FPN軸作用于人體參與了人體鐵代謝的各個(gè)階段，并維持鐵的動(dòng)態(tài)平衡，發(fā)揮調(diào)控機(jī)體鐵穩(wěn)態(tài)的作用[28-29]。

補(bǔ)陽(yáng)還五湯是治療中風(fēng)氣虛血瘀證的經(jīng)典方劑，由清代醫(yī)家王清任創(chuàng)立。 黃芪補(bǔ)氣升陽(yáng)、養(yǎng)血通痹，為君藥；當(dāng)歸活血祛瘀、補(bǔ)血，為臣藥；赤芍散瘀止痛、活血涼血；川芎活血行氣；地龍通絡(luò)化瘀；桃仁祛瘀活血；紅花活血通經(jīng)、散瘀止痛。 諸藥同用，共奏活血通絡(luò)祛瘀之效。 研究發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)陽(yáng)還五湯中的藥物成分具有擴(kuò)張血管、改善微循環(huán)的作用，能夠有效改善腦缺血組織損傷[30]?，F(xiàn)代研究表明，補(bǔ)陽(yáng)還五湯可以促進(jìn)腦缺血損傷區(qū)域的血管生成，增加腦血流量，為梗死區(qū)域及周圍組織輸送氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，促進(jìn)新生細(xì)胞向神經(jīng)元分化，通過(guò)多途徑、多靶點(diǎn)促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)等[31-32]。 吳萬(wàn)豐等[33]通過(guò)分析補(bǔ)陽(yáng)還五湯干預(yù)后缺血性卒中大鼠的腸道菌群以及血漿代謝產(chǎn)物，認(rèn)為補(bǔ)陽(yáng)還五湯通過(guò)抗氧化參與缺血性卒中的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制，并降低缺血性腦卒中血液高凝狀態(tài)。 臨床資料分析表明，卒中恢復(fù)期使用補(bǔ)陽(yáng)還五湯治療有明顯效果[34]。此外，由補(bǔ)陽(yáng)還五湯臨證化裁而研制的中藥復(fù)方也可明顯抑制神經(jīng)細(xì)胞過(guò)氧化造成的損傷，減少腦神經(jīng)細(xì)胞缺血性損害[35]。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)模擬半體內(nèi)環(huán)境，以補(bǔ)陽(yáng)還五湯為干預(yù)藥物，探討其調(diào)控腦缺血后鐵穩(wěn)態(tài)失衡，改善神經(jīng)元損傷的作用機(jī)制。 由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可得知不同濃度補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)損傷神經(jīng)元均具有一定改善作用，低劑量濃度改善作用最顯著，細(xì)胞活性和形態(tài)較其他劑量組均有明顯改善。 去鐵酮片中的主要成分是去鐵酮，一種與鐵離子螯合清除機(jī)體多余鐵的螯合劑。 既往研究發(fā)現(xiàn)，去鐵酮可以通過(guò)下調(diào)腦缺血后TFR 的表達(dá)并上調(diào)FPN 的表達(dá)，促進(jìn)缺血后鐵外排，降低缺血后鐵的異常沉積[36]。 當(dāng)鐵穩(wěn)態(tài)失衡時(shí)，細(xì)胞攝鐵量增加，排鐵量減少，最終導(dǎo)致鐵沉積。 過(guò)量沉積的鐵誘導(dǎo)ROS 產(chǎn)生，激活氧化應(yīng)激反應(yīng)[37]。補(bǔ)陽(yáng)還五湯干預(yù)后細(xì)胞活性的增加和ROS 含量的降低趨勢(shì)與去鐵酮組基本一致，細(xì)胞的損傷形態(tài)明顯改善。通過(guò)對(duì)造模后干預(yù)處理的細(xì)胞進(jìn)行SOD 與MDA 檢測(cè)結(jié)果表明，補(bǔ)陽(yáng)還五湯和去鐵酮進(jìn)行干預(yù)后的細(xì)胞損傷情況與模型組相比得到改善，SOD活力顯著上升，MDA 含量下降，即細(xì)胞對(duì)抗自由基繼發(fā)損傷的能力提高，并且部分細(xì)胞過(guò)氧化損傷有所改善。 TF 與TFR 結(jié)合，將鐵轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)后，誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)Smads 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白磷酸化，p-Smads 與Smad4 結(jié)合并進(jìn)入細(xì)胞核促進(jìn)HEP 的表達(dá)，HEP 高表達(dá)可增加FPN 的泛素化與降解，導(dǎo)致鐵沉積，加重?fù)p傷[38]。 通過(guò)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可看出，與模型組比較，補(bǔ)陽(yáng)還五湯和去鐵酮進(jìn)行干預(yù)后，TFR、HEP 蛋白的表達(dá)明顯降低，F(xiàn)PN 表達(dá)明顯增加，表明補(bǔ)陽(yáng)還五湯可以改善細(xì)胞損傷后鐵代謝轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白紊亂的狀態(tài)，TFR 與HEP 表達(dá)降低，減少鐵離子輸入，F(xiàn)PN 表達(dá)增加，可有效促進(jìn)鐵外排。由此推測(cè)補(bǔ)陽(yáng)還五湯可能是通過(guò)抑制TFR 的表達(dá)，降低HEP 的產(chǎn)生，改善下游FPN 內(nèi)化降解現(xiàn)象，在鐵輸入與輸出蛋白的協(xié)同作用下，促進(jìn)神經(jīng)元損傷后鐵沉積外排，增加細(xì)胞抗氧化能力，發(fā)揮改善腦缺血神經(jīng)元損傷的作用。