宏基因組二代測(cè)序在非HIV感染型肺孢子菌肺炎中的應(yīng)用研究*

陳佳怡，梁 曉，夏銨冬，楊 蕓，袁 兵，耿嘉蔚△

(云南省第一人民醫(yī)院/昆明理工大學(xué)附屬醫(yī)院:1.感染性疾病及肝病科;2.呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，昆明 650032)

肺孢子菌肺炎(PJP)是由耶氏肺孢子菌(Pj)感染引起的疾病，常見(jiàn)于艾滋病患者和其他免疫機(jī)能低下宿主。近年來(lái)隨著免疫抑制藥物的使用，非HIV感染者的PJP越來(lái)越引發(fā)關(guān)注。既往經(jīng)驗(yàn)來(lái)看，非HIV感染PJP患者往往比HIV感染者發(fā)病更急、疾病進(jìn)展更快、重癥化概率和死亡率更高[1-2]，因此早期診斷尤為重要。在現(xiàn)有臨床Pj檢測(cè)手段中，特殊染色鏡檢的病原檢出率低，免疫組織化學(xué)和PCR等[3]在多數(shù)臨床機(jī)構(gòu)中應(yīng)用有限。近年來(lái)，隨著基因測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，宏基因組二代測(cè)序(mNGS)在病原學(xué)診斷中有越來(lái)越多的實(shí)踐，多用于特殊、罕見(jiàn)感染的鑒定和新發(fā)病原體的解析。本研究報(bào)道m(xù)NGS輔助診斷非HIV感染型PJP患者情況，結(jié)合既往研究闡述mNGS在非HIV感染型PJP病原學(xué)診斷中的價(jià)值和特點(diǎn)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

回顧性分析2019年4月至2021年1月在本院住院并通過(guò)mNGS結(jié)合臨床資料診斷PJP的18例患者。入組標(biāo)準(zhǔn)：>18歲；具有免疫受損疾病基礎(chǔ)[4](3個(gè)月內(nèi)有血液系統(tǒng)或?qū)嶓w惡性腫瘤化療史，自身免疫性疾病、器官移植等疾病史及接受糖皮質(zhì)激素或其他免疫抑制藥物治療>30 d的用藥史，其他免疫功能低下?tīng)顟B(tài))；肺炎伴呼吸困難、低氧血癥或呼吸衰竭表現(xiàn)；胸部CT提示彌漫型或斑片狀融合型磨玻璃影(GGO)、小葉間隔增厚網(wǎng)格影等間質(zhì)性病變征象；伴或不伴G試驗(yàn)、乳酸脫氫酶(LDH)等血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果支持；外周血或呼吸道標(biāo)本mNGS檢出Pj序列；排除HIV感染。本研究通過(guò)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(KHLL2022-KY013)。

1.2 方法

1.2.1臨床資料收集

從住院電子病歷系統(tǒng)中收集入選病例的一般資料，包括性別、年齡、入院時(shí)間等，以及發(fā)病時(shí)間、臨床表現(xiàn)、實(shí)驗(yàn)室檢查、影像學(xué)檢查、合并癥、傳統(tǒng)呼吸道標(biāo)本病原檢測(cè)結(jié)果(涂片+培養(yǎng)等)、二代測(cè)序結(jié)果、治療及轉(zhuǎn)歸等臨床資料?？筆j治療2周以上進(jìn)行療效判斷，好轉(zhuǎn)表現(xiàn)為臨床癥狀及生化指標(biāo)改善，肺CT病灶較前吸收好轉(zhuǎn)；記錄患者院內(nèi)死亡情況。

1.2.2mNGS檢測(cè)

按照采樣標(biāo)準(zhǔn)流程采集支氣管肺泡灌洗液(BALF) 5 mL或血標(biāo)本3 mL放置 4 ℃冷藏，并于24 h內(nèi)專(zhuān)人低溫運(yùn)送至第三方測(cè)序中心(華大基因科技有限公司)。測(cè)序平臺(tái)使用BGISEQ-500進(jìn)行測(cè)序。數(shù)據(jù)分析：測(cè)序數(shù)據(jù)下機(jī)后去除低質(zhì)量和長(zhǎng)度<35 bp的數(shù)據(jù)。通過(guò)BWA(http://bio-bwa.sourceforge.net/)比對(duì)，將人源基因組序列數(shù)據(jù)去除，再去除低復(fù)雜度序列數(shù)后與專(zhuān)用微生物大數(shù)據(jù)庫(kù)(ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/)比對(duì)，按照細(xì)菌、真菌、病毒、分枝桿菌和寄生蟲(chóng)等進(jìn)行分類(lèi)和排列。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS25.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)或率表示。計(jì)量資料以M(P25,P75)表示，兩兩比較采用 Mann-WhitneyU檢驗(yàn)；測(cè)序參數(shù)與臨床數(shù)據(jù)進(jìn)行Spearman秩相關(guān)分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 基本信息

18例患者中男15例，女3例，中位年齡46歲。所有患者均有腫瘤、腎病或自身免疫性疾病背景，見(jiàn)表1。其中16例患者使用激素+免疫抑制劑治療基礎(chǔ)疾病，使用時(shí)間10.5(4.0，24.0)個(gè)月，另外2例為正在接受化療的惡性腫瘤患者。

表1 18例患者入院時(shí)的一般情況及實(shí)驗(yàn)室檢查

續(xù)表1 18例患者入院時(shí)的一般情況及實(shí)驗(yàn)室檢查

2.2 臨床資料

患者以急性、亞急性起病，從起病至mNGS標(biāo)本采集的中位時(shí)間為16 d，最短4 d。起病癥狀以發(fā)熱(77.8%)、咳嗽(100.0%)、干咳(50.0%)、氣促(77.8%)為主。所有患者入院時(shí)均有不同程度的低氧血癥，氧合指數(shù)(校正大氣壓后)262(215,297)，LDH水平473.0(303.5,581.3)U/L。15例患者的血清1，3-β-D葡聚糖276.0(178.9,569.8)pg/mL，15例患者的誘導(dǎo)痰細(xì)胞中性粒細(xì)胞比例明顯升高達(dá)73.08%～97.02%，提示肺炎癥損傷重。所有患者入院72 h內(nèi)均進(jìn)行了細(xì)胞免疫功能評(píng)估并記錄 CD4+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)，其中8例<200個(gè)/μL。18例患者均采集呼吸道標(biāo)本送院內(nèi)涂片及培養(yǎng)，2號(hào)病例痰培養(yǎng)出敏感嗜麥芽窄食單胞菌，7、11、13號(hào)病例痰涂片查見(jiàn)真菌孢子和(或)菌絲，但因?qū)嶒?yàn)室條件有限未進(jìn)一步鑒定，其余均為陰性。影像學(xué)上病例均呈現(xiàn)雙肺彌漫性或斑片融合型磨玻璃征，部分可見(jiàn)小葉間隔增厚、網(wǎng)格影、鋪路石征等。

2.3 mNGS結(jié)果

測(cè)序標(biāo)本在入院后7～10 d采集，測(cè)序結(jié)果均于第三方測(cè)序中心收到標(biāo)本約48 h后回報(bào)，標(biāo)本檢出Pj菌種嚴(yán)格比對(duì)的序列數(shù)為14～10 579個(gè)，除1例外其余標(biāo)本的Pj序列相對(duì)豐度在85%以上(圖1)，Pj序列數(shù)在所有檢出微生物種間排名1～14名(圖2)。不同個(gè)體之間的Pj序列數(shù)差異較大，與 PJP 的發(fā)病時(shí)間、氧合指數(shù)、CD4+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)無(wú)明顯相關(guān)性(rs=-0.131、-0.129、-0.040，P>0.05)，見(jiàn)表2。Pj序列數(shù)在采樣前是否經(jīng)驗(yàn)性抗Pj治療(P=0.158)及是否發(fā)生院內(nèi)死亡(P=0.426)的組間比較中也無(wú)明顯差異。其他微生物檢出情況：14例患者標(biāo)本檢出病毒序列，其中，9例檢出人類(lèi)β皰疹病毒5型(CMV)序列，6例檢出人類(lèi)γ皰疹病毒4型(EBV)序列，2例檢出了單純皰疹病毒(HSV1)序列，1例血標(biāo)本檢出了細(xì)環(huán)病毒屬序列。所有BALF標(biāo)本都檢出大量細(xì)菌序列并報(bào)告了可疑致病菌，其中2號(hào)病例檢出軍團(tuán)菌屬，3號(hào)病例檢出李斯特菌、銅綠假單胞菌；2例血標(biāo)本并未檢出細(xì)菌序列。

圖1 18例標(biāo)本Pj序列數(shù)及相對(duì)豐度

圖2 18例標(biāo)本Pj序列數(shù)在微生物序列中的種間排名

2.4 治療反應(yīng)及預(yù)后

所有患者在采樣前均接受抗菌藥物治療，其中4例患者經(jīng)驗(yàn)性使用磺胺甲噁唑/甲氧芐啶或棘白菌素類(lèi)抗Pj治療，其余患者在mNGS結(jié)果回報(bào)后加用上述藥物抗Pj治療，部分患者胸部CT特征見(jiàn)圖3。最終3例患者因膿毒癥多器官衰竭而發(fā)生院內(nèi)死亡，其余患者均好轉(zhuǎn)出院隨訪。

表2 Pj序列數(shù)與部分臨床指標(biāo)的相關(guān)性分析

A：2號(hào)、4號(hào)、12號(hào)、15號(hào)、16號(hào)、18號(hào)病例PJP特征表現(xiàn)主要為雙肺彌漫性磨玻璃影，可見(jiàn)網(wǎng)格影和鋪路石征(箭頭)等；B：20號(hào)病例抗Pj治療后病灶吸收；C：8號(hào)病例從起病局部磨玻璃影(2020-01-23)進(jìn)展為雙肺彌漫性病變(2020-02-22)，最后抗Pj治療好轉(zhuǎn)(2020-03-06)。

3 討 論

PJP是免疫抑制宿主常見(jiàn)的嚴(yán)重機(jī)會(huì)性感染疾病，在國(guó)內(nèi)外的報(bào)道中，PJP的發(fā)病率在侵襲性真菌感染疾病中排名前4[5-6]。早期診斷對(duì)PJP患者的預(yù)后有重要意義[7]，然而既往臨床實(shí)踐中直接獲得PJP病原學(xué)證據(jù)較為困難，新興的mNGS技術(shù)具有高靈敏度、覆蓋廣、無(wú)偏倚的特點(diǎn)，給感染病診斷帶來(lái)更多的病原信息，且抗菌藥物使用對(duì)mNGS的影響小于傳統(tǒng)培養(yǎng)[8]，因此臨床上得以實(shí)踐應(yīng)用。

本研究中主要檢測(cè)PJP患者的下呼吸道標(biāo)本，盡管Pj也可以在人類(lèi)Ⅰ型肺泡上皮細(xì)胞表面定植生長(zhǎng)[9]，但免疫正常和免疫抑制人群中的呼吸道病原譜仍有明顯差異。WU等[10]分析了多中心329例重癥肺炎BALF標(biāo)本的mNGS，Pj序列均在免疫受損的肺炎病例中檢出，而免疫功能正常的264例病例中并未檢出，既往大樣本呼吸道標(biāo)本mNGS研究中Pj序列檢出率也并不高[8]，提示免疫受損人群的Pj陽(yáng)性結(jié)果有較大意義。此外，有研究觀察到非HIV型PJP BALF中的Pj載量明顯低于HIV型PJP[11]，因此雖然部分標(biāo)本僅檢出少量Pj序列，本研究仍然將此作為支持診斷的重要依據(jù)。

除呼吸道標(biāo)本外，血液 mNGS在PJP診斷中也有良好的敏感性，且一般不受呼吸道定植菌的干擾。在顧鵬等[12]研究中，外周血mNGS對(duì)腎臟病合并PJP的診斷靈敏度和特異度達(dá)到了94.59%和100%。另一項(xiàng)研究分析了14例腎移植術(shù)后的PJP患者，92.8%的患者均通過(guò)外周血或呼吸道標(biāo)本mNGS發(fā)現(xiàn)Pj序列，且與PCR驗(yàn)證結(jié)果一致[13]，值得注意的是，在該研究中呼吸道標(biāo)本匹配到的Pj序列數(shù)(488～29 751)明顯高于血標(biāo)本(6～260)，并且在2例患者的4份同源同期標(biāo)本中得到驗(yàn)證，提示呼吸道標(biāo)本可能有更高的檢測(cè)效能。

此外，非HIV型PJP患者常為免疫機(jī)能受損的重癥患者，往往非單一病原體感染。在本研究中，BALF測(cè)序都報(bào)告了可疑致病菌序列，部分檢測(cè)出非典型細(xì)菌病原體，如軍團(tuán)菌屬、李斯特菌等，給治療用藥提供了參考。而2例血標(biāo)本測(cè)序雖然沒(méi)有報(bào)告細(xì)菌序列，但患者的臨床資料均有細(xì)菌性肺炎的表現(xiàn)，如咳黃痰、中性粒細(xì)胞升高及影像學(xué)實(shí)變征等，入院后給予經(jīng)驗(yàn)性抗菌藥物治療。既往PJP研究中血mNGS的細(xì)菌檢出率也僅有21.6%[12]，在另一項(xiàng)重癥肺炎(SCAP)的診斷研究中，以血培養(yǎng)為金標(biāo)準(zhǔn)，外周血mNGS的敏感性和一致率均不如呼吸道標(biāo)本[14]，提示呼吸道標(biāo)本對(duì)非HIV型PJP的診療更有優(yōu)勢(shì)。

目前對(duì)于判斷mNGS檢出序列為致病菌尚無(wú)定量標(biāo)準(zhǔn)，有研究提出Pj序列的相對(duì)豐度>85%或序列數(shù)排名前15名可能提供較滿意的診斷閾值[15]。在本研究中，17例標(biāo)本中Pj序列相對(duì)豐度>85%，包括2例血標(biāo)本。也有研究觀察到血標(biāo)本中Pj序列相對(duì)豐度差異較大分布離散[12]，由于均為小樣本觀察性研究，還需要更多前瞻性研究來(lái)進(jìn)一步驗(yàn)證。此外，測(cè)序結(jié)果不能單一解讀，共識(shí)建議[16]若mNGS結(jié)果符合患者的臨床表現(xiàn)和其他實(shí)驗(yàn)室檢查，可以根據(jù)結(jié)果指導(dǎo)臨床決策。

本組病例的誘導(dǎo)痰細(xì)胞分類(lèi)發(fā)現(xiàn)中性粒細(xì)胞明顯升高，且入院時(shí)均有不同程度的低氧血癥或呼吸衰竭，提示患者肺炎癥損傷重。有研究對(duì)比了HIV型PJP患者的BALF細(xì)胞分類(lèi)，在非HIV患者中觀察到更高的中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)，間接提示非 HIV型PJP有更嚴(yán)重的肺損傷[11]。影像學(xué)上，PJP典型的CT特征為雙肺散在斑片樣或彌漫性磨玻璃影、小葉間隔增厚，但不具有特異性。血清G試驗(yàn)可以輔助診斷PJP，但需要和其他真菌如念珠菌屬、鐮刀菌屬、曲霉菌屬等感染相鑒別。有研究認(rèn)為下呼吸道標(biāo)本PCR結(jié)合G試驗(yàn)可以有效地區(qū)分PJP定植和感染[17-18]，但G試驗(yàn)最佳診斷閾值各不相同，需要進(jìn)一步驗(yàn)證。此外，mNGS指導(dǎo)抗菌藥物調(diào)整后的治療反應(yīng)也可以作為依據(jù)。本研究不足之處在于缺乏特殊染色等驗(yàn)證試驗(yàn)，還有部分患者隨訪不足，未能觀察到疾病的遠(yuǎn)期變化，未來(lái)需要前瞻性研究設(shè)計(jì)來(lái)改進(jìn)。

綜上所述，在非HIV感染型PJP的診斷中，BALF和血標(biāo)本mNGS均有較好的靈敏度。非HIV型PJP往往呈現(xiàn)重癥化和混合感染的趨勢(shì)，條件允許時(shí)仍建議優(yōu)選下呼吸道標(biāo)本如BALF送檢，以獲得更全面的病原學(xué)信息。此外，Pj序列的相對(duì)豐度對(duì)致病菌的判定可能有提示作用，Pj序列數(shù)與臨床指標(biāo)及預(yù)后無(wú)明顯相關(guān)，但需要前瞻性更大樣本研究來(lái)驗(yàn)證。mNGS的結(jié)果需要綜合其他臨床資料綜合判斷。