苦參堿對(duì)缺氧/復(fù)氧小鼠海馬神經(jīng)元HT22細(xì)胞活力、凋亡的影響及機(jī)制研究*

張富慧，張自艷，郝靜峰，羅 玲，王志海

邯鄲市第二醫(yī)院 1.神經(jīng)內(nèi)科，2.內(nèi)分泌科，河北邯鄲 056001

腦缺氧/復(fù)氧(H/R)損傷引起的神經(jīng)元細(xì)胞凋亡在神經(jīng)功能障礙的誘導(dǎo)中發(fā)揮著重要作用，因此，研究神經(jīng)元凋亡的機(jī)制可能有助于發(fā)現(xiàn)潛在的H/R治療靶點(diǎn)[1-2]?？鄥A是從苦參中提取的一種天然生物堿成分，具有抗氧化、抗炎、抗凋亡、神經(jīng)保護(hù)等多種藥理作用[3]。研究證明，苦參堿可通過(guò)減輕中樞神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘程度來(lái)發(fā)揮對(duì)自身免疫性腦脊髓炎大鼠的治療作用[4]。苦參堿除了具有免疫調(diào)節(jié)功能外，對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞也有直接的作用。CHEN等[5]研究顯示，苦參堿能夠改善腦缺血再灌注大鼠的神經(jīng)功能、腦水腫和氧化應(yīng)激反應(yīng)，降低腦細(xì)胞凋亡率，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)是支持腦功能發(fā)育、分化、維持和終生可塑性的關(guān)鍵分子，參與神經(jīng)退行性疾病和精神疾病的病理生理過(guò)程[6]。BDNF在腦H/R損傷大鼠模型中表達(dá)降低，外源添加BDNF可抑制腦H/R損傷大鼠神經(jīng)元凋亡[7]。BDNF發(fā)揮其促進(jìn)作用主要是通過(guò)與酪氨酸激酶受體B(TrkB)結(jié)合，導(dǎo)致TrkB自身磷酸化并激活下游的信號(hào)分子[8]?？鄥A是否對(duì)腦H/R損傷具有保護(hù)作用尚鮮有研究報(bào)道，因此，本文通過(guò)研究苦參堿對(duì)H/R神經(jīng)元HT22細(xì)胞活力和凋亡的影響，同時(shí)初步探討潛在的分子機(jī)制，為苦參堿的臨床應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞 小鼠海馬神經(jīng)元HT22細(xì)胞(上海賓穗生物科技有限公司，批號(hào)CM-4517)。

1.2主要藥物、試劑與儀器 苦參堿(成都瑞芬思德丹生物科技有限公司，原料藥，純度≥99.8%，批號(hào)217-06-13)；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(武漢普諾賽生命科技有限公司，批號(hào)160044、160047)；噻唑藍(lán)(MTT)試劑、膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶(Annexin V-FITC/PI)凋亡檢測(cè)試劑盒、RIPA裂解液、BCA蛋白質(zhì)濃度測(cè)定試劑盒(美國(guó)Amresco公司，批號(hào)M8180-1、CA1020、MZ6127-4、ML5711-3)；化學(xué)發(fā)光試劑(美國(guó)GE公司，批號(hào)517923)；B淋巴細(xì)胞瘤-2基因(Bcl-2)、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-3(Caspase-3)、BDNF、TrkB和β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)抗體(美國(guó)Santa Cruz公司，批號(hào)HZ-061451、HZ-064782、HZ-061482、HZ-061427、HZ-066275、HZ-485251)；兔抗鼠二抗(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號(hào)115-58-264)；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱、酶標(biāo)儀(上海楚定分析儀器有限公司，型號(hào)MCO-18AC、MK3)；流式細(xì)胞儀、電泳儀、凝膠成像儀(北京盛科信德科技有限公司，型號(hào)XL-MCL、FL12-DYCP-43、Platinum HD7)。

1.3實(shí)驗(yàn)分組、造模及給藥 用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基在37 ℃、5% CO2條件培養(yǎng)HT22細(xì)胞，條件為37 ℃、5% CO2，當(dāng)細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分組：對(duì)照組、H/R組及苦參堿低、中、高濃度組。對(duì)照組HT22細(xì)胞采用無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基在正常環(huán)境下培養(yǎng)28 h；H/R組HT22細(xì)胞采用無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基在37 ℃、5% CO2、95% N2的缺氧培養(yǎng)箱中維持4 h，隨后轉(zhuǎn)移到無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基中，在37 ℃常氧條件下(5% CO2、95%空氣)培養(yǎng)24 h[9]；苦參堿低、中、高濃度組的H/R處理同H/R組，同時(shí)在無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基中加入濃度分別為10、20、30 μmol/L的苦參堿進(jìn)行干預(yù)[10]，培養(yǎng)24 h。

1.4MTT法檢測(cè)HT22細(xì)胞活力 將HT22細(xì)胞以5×103/孔接種于96孔板中(200 μL/孔)，待細(xì)胞融合后，按1.3中方法進(jìn)行干預(yù)，培養(yǎng)結(jié)束前4 h加入MTT溶液(20 μL/孔)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，再加入100 μL二甲基亞砜均勻振蕩10 min，用酶標(biāo)儀(波長(zhǎng)600 nm處)測(cè)定吸光度值，并計(jì)算細(xì)胞存活率(細(xì)胞存活率=各處理組A值/對(duì)照組A值×100%)。

1.5流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)HT22細(xì)胞凋亡 將HT22細(xì)胞以5×104/孔接種于6孔板內(nèi)(3 mL/孔)，待細(xì)胞融合后，按1.3中方法進(jìn)行干預(yù)，添加5 μL Annexin V-FITC和10 μL PI，檢測(cè)HT22細(xì)胞凋亡率。

1.6蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)Bcl-2、Bax、Caspase-3、BDNF、TrkB蛋白水平 將HT22細(xì)胞以5×104/孔接種于6孔板內(nèi)(3 mL/孔)，待細(xì)胞融合后，按1.3中方法進(jìn)行干預(yù)后收獲細(xì)胞，加入RIPA裂解液，冰浴2 h，離心取上清，用BCA法進(jìn)行蛋白定量，調(diào)整蛋白濃度，上樣并進(jìn)行電泳(每孔上樣量為20 μg)、轉(zhuǎn)膜，將膜與Bcl-2(1∶500)、Bax(1∶200)、Caspase-3(1∶400)、BDNF(1∶200)、TrkB(1∶200)和β-actin(1∶1 000)一抗進(jìn)行孵育，4℃過(guò)夜，添加二抗(1∶2 000)在室溫下孵育30 min，顯色，采集圖像，通過(guò)Image Lab軟件獲取信號(hào)并估計(jì)強(qiáng)度，以β-actin為內(nèi)參計(jì)算目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié) 果

2.1苦參堿對(duì)HT22細(xì)胞活力的影響 與對(duì)照組比較，H/R組HT22細(xì)胞A值、存活率降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與H/R組比較，苦參堿低、中、高濃度組HT22細(xì)胞A值、存活率依次升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，呈濃度依賴性。見表1。

表1 各組HT22細(xì)胞A值、存活率比較

2.2苦參堿對(duì)HT22細(xì)胞凋亡的影響 與對(duì)照組比較，H/R組HT22細(xì)胞凋亡率升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與H/R組比較，苦參堿低、中、高濃度組HT22細(xì)胞凋亡率依次降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，呈濃度依賴性。見表2和圖1。

表2 各組HT22細(xì)胞凋亡率比較

圖1 各組HT22細(xì)胞凋亡流式圖

2.3苦參堿對(duì)HT22細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白(Bcl-2、Bax、Caspase-3)水平的影響 與對(duì)照組比較，H/R組HT22細(xì)胞Bcl-2蛋白水平降低，Bax、Caspase-3蛋白水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與H/R組比較，苦參堿低、中、高濃度組HT22細(xì)胞Bcl-2蛋白水平依次升高，Bax、Caspase-3蛋白水平依次降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，呈濃度依賴性。見圖2～3。

注：A為對(duì)照組，B為H/R組，C為苦參堿低濃度組，D為苦參堿中濃度組，E為苦參堿高濃度組。圖2 各組HT22細(xì)胞Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白質(zhì)印跡圖

注：與對(duì)照組比較，aP<0.05；與H/R組比較，bP<0.05；與苦參堿低濃度組比較，cP<0.05；與苦參堿中濃度組比較，dP<0.05。圖3 各組HT22細(xì)胞Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表達(dá) 水平比較(/β-actin)

2.4苦參堿對(duì)HT22細(xì)胞BDNF/TrkB信號(hào)通路蛋白表達(dá)水平的影響 與對(duì)照組比較，H/R組HT22細(xì)胞BDNF、TrkB蛋白表達(dá)水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與H/R組比較，苦參堿低、中、高濃度組HT22細(xì)胞BDNF、TrkB蛋白表達(dá)水平依次升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，呈濃度依賴性。見圖4～5。

注：A為對(duì)照組，B為H/R組，C為苦參堿低濃度組，D為苦參堿中濃度組，E為苦參堿高濃度組。圖4 各組HT22細(xì)胞BDNF、TrkB蛋白質(zhì)印跡圖

注：與對(duì)照組比較，aP<0.05；與H/R組比較，bP<0.05；與苦參堿低濃度組比較，cP<0.05；與苦參堿中濃度組比較，dP<0.05。圖5 各組HT22細(xì)胞BDNF、TrkB蛋白表達(dá)水平比較 (/β-actin)

3 討 論

腦H/R是腦缺血再灌注的直接體現(xiàn)，也是導(dǎo)致中樞神經(jīng)元損傷的主要因素之一，表現(xiàn)為神經(jīng)元細(xì)胞存活減少，凋亡增加。如何減輕腦H/R損傷對(duì)于臨床上治療腦缺血再灌注損傷至關(guān)重要[11]?？鄥A是一種有效的針對(duì)局灶性腦缺血的神經(jīng)保護(hù)劑。有研究報(bào)道，苦參堿可抑制腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡來(lái)減輕局灶性腦缺血性損傷，從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[12]。WANG等[13]發(fā)現(xiàn)，苦參堿可通過(guò)抑制少突膠質(zhì)細(xì)胞凋亡和增強(qiáng)線粒體自噬發(fā)揮對(duì)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎大鼠的治療作用。本研究發(fā)現(xiàn)，H/R組HT22細(xì)胞存活率低于對(duì)照組，凋亡率高于對(duì)照組；經(jīng)苦參堿干預(yù)后，HT22細(xì)胞存活率呈濃度依賴性升高，凋亡率呈濃度依賴性降低。與趙艷武等[12]和WANG等[13]研究結(jié)果一致，表明苦參堿可通過(guò)抑制HT22細(xì)胞凋亡來(lái)保證其存活。從而保護(hù)因腦H/R導(dǎo)致的神經(jīng)元損傷。

神經(jīng)元凋亡是加速腦缺血后組織損傷的關(guān)鍵事件。眾所周知，Caspase是細(xì)胞內(nèi)半胱氨酸蛋白酶家族，參與細(xì)胞凋亡的啟動(dòng)和執(zhí)行[14]。Caspase-3是Caspase依賴性細(xì)胞凋亡的最終效應(yīng)物，研究證實(shí)在腦缺血性損傷中可觀察到神經(jīng)元Caspase-3表達(dá)水平增加[15]。此外，由促凋亡和抗凋亡成員組成的Bcl-2家族蛋白對(duì)凋亡途徑和下游Caspase的激活至關(guān)重要。抗凋亡蛋白Bcl-2位于線粒體膜上，有助于維持膜的完整性并防止細(xì)胞色素C釋放到細(xì)胞質(zhì)中。相比之下，促凋亡蛋白Bax是一種細(xì)胞質(zhì)蛋白，當(dāng)細(xì)胞受到各種凋亡刺激時(shí)，該蛋白會(huì)特異性轉(zhuǎn)移至線粒體，從而導(dǎo)致Bax和Bcl-2之間的不平衡。這種不平衡導(dǎo)致線粒體通透性變化并促進(jìn)細(xì)胞色素C從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)，隨后激活Caspase-3導(dǎo)致腦缺血誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡[16]。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)H/R誘導(dǎo)后HT22細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)水平降低，Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)水平升高，這與以往的研究結(jié)果一致[14-16]，表明HT22細(xì)胞中凋亡途徑被激活；經(jīng)苦參堿干預(yù)后，HT22細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)水平呈濃度依賴性升高，Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)水平呈濃度依賴性降低；表明苦參堿可通過(guò)調(diào)控Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)水平，抑制HT22細(xì)胞凋亡，本研究支持了苦參堿具有抗凋亡活性的觀點(diǎn)[12-13]。

BDNF/TrkB信號(hào)通路與中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過(guò)程密切相關(guān)，BDNF在腦缺血和神經(jīng)元細(xì)胞凋亡中起重要作用[17]。BDNF是神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子家族的一員，廣泛分布于整個(gè)大腦，是維持神經(jīng)元正常生理功能、增加突觸可塑性和修復(fù)受損神經(jīng)元的必要因子[18]。TrkB是BDNF的內(nèi)源性受體，BDNF特異性結(jié)合TrkB受體，啟動(dòng)下游的級(jí)聯(lián)反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)中樞神經(jīng)系統(tǒng)受損時(shí)，腦組織BDNF和TrkB表達(dá)水平均降低[19]。激活BDNF/TrkB信號(hào)通路可降低凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3和Bax-2的表達(dá)水平，增強(qiáng)Bcl-2表達(dá)水平，抑制神經(jīng)元凋亡發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[20]。然而，由于血腦屏障的作用，外源性給予BDNF很難進(jìn)入腦組織發(fā)揮作用，因此，激活內(nèi)源性BDNF的表達(dá)水平將對(duì)大腦起到保護(hù)作用?？鄥A已被報(bào)道可上調(diào)BDNF表達(dá)水平發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[21]。本研究發(fā)現(xiàn)，H/R組HT22細(xì)胞BDNF、TrkB蛋白表達(dá)水平低于對(duì)照組，苦參堿可呈濃度依賴性的升高H/R誘導(dǎo)的HT22細(xì)胞中BDNF、TrkB蛋白表達(dá)水平，這與以往的研究結(jié)果一致[21]。提示，苦參堿可能通過(guò)激活BDNF/TrkB信號(hào)通路減弱H/R后的神經(jīng)元凋亡發(fā)揮對(duì)HT22細(xì)胞H/R的保護(hù)作用。

綜上所述，苦參堿可改善H/R小鼠海馬神經(jīng)元HT22細(xì)胞活力，抑制HT22細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與激活BDNF/TrkB信號(hào)通路有關(guān)。本研究的創(chuàng)新之處是從體外細(xì)胞水平上闡明了BDNF/TrkB信號(hào)通路的激活可能參與苦參堿對(duì)神經(jīng)元的保護(hù)作用，為苦參堿用作治療腦缺血再灌注損傷的有效神經(jīng)保護(hù)劑提供了一定的理論依據(jù)。然而，腦缺血再灌注損傷后的神經(jīng)元凋亡涉及多種途徑，需要進(jìn)一步的研究以確定苦參堿介導(dǎo)的神經(jīng)保護(hù)作用的分子靶點(diǎn)。