沉默蛻皮激素受體對(duì)雌性中黑盲蝽生殖力的影響

黃星星, 鄭宛瑩, 薛 匯, 焦盼陽(yáng), 陳利珍

(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)植物科技學(xué)院, 昆蟲(chóng)資源利用與害蟲(chóng)可持續(xù)治理湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430070)

中黑盲蝽Adelphocorissuturalis屬于半翅目Hemiptera盲蝽科Miridae,是我國(guó)棉花產(chǎn)區(qū)的一種重要害蟲(chóng)[1]。中黑盲蝽是雜食性昆蟲(chóng),寄主范圍廣,主要有棉花Gossypium、大豆Glycinemax、苜蓿Medicagosativa等[2]。此外中黑盲蝽還可捕食棉蚜Aphisgossypii、煙粉虱Bemisiatabaci[3],以及小地老虎Agrotisipsilon、甜菜夜蛾Spodopteraexigua和棉鈴蟲(chóng)Helicoverpaarmigera等昆蟲(chóng)的卵和幼蟲(chóng)[4-5]。

中黑盲蝽的生殖力受諸多因素的影響,如營(yíng)養(yǎng)條件、寄主、溫度等。用四季豆Phaseolusvulgaris單獨(dú)飼養(yǎng)的中黑盲蝽,添加蜂蜜水飼喂后可增加其單雌產(chǎn)卵量和卵孵化率[6]。與取食苜蓿、大豆、常規(guī)棉和扁豆Lablabpurpureus的中黑盲蝽相比,取食四季豆和Bt棉的中黑盲蝽產(chǎn)卵量增加[7]。目前關(guān)于中黑盲蝽生殖調(diào)控的分子機(jī)制研究較少。研究發(fā)現(xiàn)脂肪酰輔酶A還原酶(fatty acyl-CoA reductase, FAR)在中黑盲蝽的生殖過(guò)程中發(fā)揮作用,干擾AsFAR基因后,雌蟲(chóng)卵巢掛卵量?jī)H為對(duì)照組的64%、卵巢干重為對(duì)照組的54%、單雌產(chǎn)卵量是對(duì)照組的48%、卵孵化率減少72%,顯著影響中黑盲蝽雌成蟲(chóng)的生殖力[8]。

蛻皮激素(molting hormone, 20E)在調(diào)節(jié)昆蟲(chóng)生殖中發(fā)揮重要作用,可以誘導(dǎo)脂肪體合成卵黃原蛋白(vitellogenin, Vg)[9]。在分子水平上,20E需要與蛻皮激素受體(ecdysone receptor,EcR)結(jié)合調(diào)控下游基因[10],而EcR需要與超氣門(mén)蛋白(ultraspiracle, USP)形成異源二聚體才能與靶標(biāo)基因上游的蛻皮激素響應(yīng)元件(ecdysone response element, EcRE)結(jié)合[11]。家蠶Bombyxmori體內(nèi)的核受體BmEcR和BmCFl(USP)形成異源二聚體后,與20E結(jié)合成為受體復(fù)合物,從而誘導(dǎo)E74、E75和BR-C等基因表達(dá)[12]。在埃及伊蚊Aedesaegypti中,20E受體復(fù)合物與20E受體復(fù)合物早期應(yīng)答基因Board(Br)、E74編碼的蛋白BR、E74b相互作用激活Vg的轉(zhuǎn)錄[13-14]。黑腹果蠅Drosophilamelanogaster體內(nèi)EcR基因編碼3種20E受體亞型,分別是EcR-A、EcR-B1和EcR-B2,不同亞型在不同發(fā)育階段占主導(dǎo)地位[15]。埃及伊蚊中的EcR亞型AaEcR-B和AaEcR-A轉(zhuǎn)錄本對(duì)20E的敏感性存在顯著差異,在其體內(nèi)卵泡生成過(guò)程中具有不同的生理功能[16]。20E受體復(fù)合物早期應(yīng)答基因Br、E74和E75的表達(dá)直接受20E受體復(fù)合物調(diào)控。E74屬于E-twenty six(Ets)結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子家族,Ets蛋白已被證明是多細(xì)胞動(dòng)物發(fā)育的關(guān)鍵因素,并在細(xì)胞增殖分化、組織發(fā)育以及昆蟲(chóng)發(fā)育等相關(guān)過(guò)程的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控中發(fā)揮重要作用[17]。E75基因在埃及伊蚊體內(nèi)有3個(gè)亞型,分別是AaE75A、AaE75B、AaE75C。E75A是Vg表達(dá)的有效激活因子,而E75C是及時(shí)抑制該基因表達(dá)的關(guān)鍵。干擾E75A,可使Br-Z2表達(dá)量下降;而干擾E75B,則使Brc-Z2表達(dá)量上升[18]。在果蠅卵子發(fā)生過(guò)程中,E75、E74和Broad-Complex(BR-C)以發(fā)育時(shí)期特異性的方式表達(dá),在E75突變的雌蟲(chóng)卵子發(fā)生中期出現(xiàn)卵子發(fā)育停滯和退化現(xiàn)象[19]。

中黑盲蝽是棉花上的一種重要害蟲(chóng),但關(guān)于中黑盲蝽的生殖調(diào)控分子機(jī)制鮮有報(bào)道。在以往的研究中,昆蟲(chóng)生殖的分子調(diào)控機(jī)制主要包括昆蟲(chóng)保幼激素(juvenile hormone, JH)信號(hào)通路、20E信號(hào)通路和營(yíng)養(yǎng)信號(hào)通路[20]。因此我們克隆了中黑盲蝽20E通路上的受體基因EcR和USP并進(jìn)行了序列分析，同時(shí)使用RNAi方法研究EcR和USP對(duì)中黑盲蝽生殖的影響。為中黑盲蝽的生殖調(diào)控分子機(jī)制研究打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx(chóng)

中黑盲蝽采集于華中農(nóng)業(yè)大學(xué)棉花基地,養(yǎng)殖方法參照陸宴輝等[21]的方法。飼養(yǎng)條件是溫度(26±1)℃、相對(duì)濕度(75±5)%、光周期L∥D=16 h∥8 h。試蟲(chóng)養(yǎng)殖在塑料保鮮盒(20 cm×13 cm×8 cm)中,其中放入約0.3 cm寬的濾紙條,將中黑盲蝽接入后用醫(yī)用紗布覆蓋,防止逃逸。成蟲(chóng)的飼養(yǎng):以四季豆為飼料并作為產(chǎn)卵基質(zhì),每隔2 d更換四季豆,保證飼料新鮮。四季豆使用前用0.5%的次氯酸鈉溶液浸泡10 min,隨后用流動(dòng)的水沖洗30 min,晾干后存于4℃冰箱待用。若蟲(chóng)以綠豆Vignaradiata芽和鮮食甜玉米Zeamays為飼料飼養(yǎng),每隔2 d更換綠豆芽和玉米。3齡之后每2 d添1次豌豆蚜。卵:將含有蟲(chóng)卵的四季豆室溫條件下放置2 d, 2 d后和新鮮玉米(以防1齡若蟲(chóng)孵化后缺乏食物餓死)一起放入保鮮盒。

1.2 方法

1.2.1中黑盲蝽總RNA提取與cDNA反轉(zhuǎn)錄

采用TRIzol法提取中黑盲蝽成蟲(chóng)總RNA。提取的RNA經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)條帶完整性,并用Backman Coulter DU730測(cè)定RNA 濃度與OD值。提取的RNA于-80℃保存。使用Prime ScriptTMRT Master Mix(perfect real time)試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。

1.2.2中黑盲蝽EcR、USP基因克隆

利用本實(shí)驗(yàn)室中黑盲蝽基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)(數(shù)據(jù)未發(fā)表)設(shè)計(jì)引物(表1)克隆EcR和USP基因的ORF全長(zhǎng)序列。PCR反應(yīng)體系:cDNA 0.2 μL,10×LA PCR Buffer 2.0 μL,LATaq(5 U/μL)1.0 μL,dNTP Mixture(2.5 mmol/L)3.2 μL,正反向引物(10 μmol/L)各 0.4 μL,補(bǔ)充ddH2O至20 μL。反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性3 min;95℃變性30 s,退火溫度下反應(yīng)30 s,72℃延伸2 min,循環(huán)30次;72℃延伸10 min,4℃保存。1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物,溴化乙錠(EB)染色,紫外燈下觀察電泳結(jié)果,切下目的條帶,使用Omega凝膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物。-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 中黑盲蝽EcR和USP基因克隆所用引物

取目的片段膠回收產(chǎn)物5 μL與1 μL Blunt載體于25℃連接10 min。重組載體轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞T1 后,加入已滅菌的LB液體培養(yǎng)基至600 mL,37℃、150 r/min培養(yǎng)1 h。取200 μL菌液均勻涂布在氨芐抗性的LB培養(yǎng)基平板上,37℃過(guò)夜培養(yǎng)。經(jīng)菌落PCR篩選出陽(yáng)性克隆,送武漢擎科生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

1.2.3中黑盲蝽EcR、USP基因序列分析

通過(guò)SMART(http:∥smart.embl.de/)預(yù)測(cè)蛋白結(jié)構(gòu)域。使用MEGA 7.0軟件,采用鄰接法構(gòu)建中黑盲蝽EcR和USP氨基酸序列與NCBI登錄的其他昆蟲(chóng)同源序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù),bootstrap為1 000。

1.2.4EcR、USP基因在中黑盲蝽不同發(fā)育階段蟲(chóng)態(tài)、組織中轉(zhuǎn)錄水平分析

選取中黑盲蝽1～5齡若蟲(chóng)，1日齡雌、雄成蟲(chóng)，8日齡雌、雄成蟲(chóng)作為不同基因轉(zhuǎn)錄水平的樣品,每處理3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。解剖中黑盲蝽剛到達(dá)卵巢成熟期的8日齡雌蟲(chóng),選取頭、胸、卵巢、脂肪體和中腸為不同組織基因轉(zhuǎn)錄水平分析樣品,每處理3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。提取上述樣品RNA并反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。方法同1.2.1。

qPCR以EF1γ[22]為內(nèi)參基因,根據(jù)已有的序列設(shè)計(jì)引物(表 2)。qPCR反應(yīng)體系為SYBR PremixExTaqMix(2×)10.0 μL，10 μmol/L 上、下游引物各0.6 μL，cDNA模板 2.0 μL，ddH2O 6.8 μL;反應(yīng)程序?yàn)?95℃,預(yù)變性30 s;95℃變性5 s,62℃復(fù)性延伸30 s,40個(gè)循環(huán)。40個(gè)循環(huán)后對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行溶解曲線(xiàn)分析(60～95℃)和瓊脂糖凝膠電泳,檢測(cè)其特異性。每個(gè)反應(yīng)設(shè)置3個(gè)技術(shù)重復(fù)。

表2 中黑盲蝽EcR和USP基因qPCR所用引物序列

1.2.5中黑盲蝽EcR、USP基因dsRNA合成

以1.2.1中含中黑盲蝽EcR、USP基因片段的感受態(tài)細(xì)胞T1為試驗(yàn)材料,用Omega Plasmid Mini Kit I提取含有目的片段的質(zhì)粒。以該質(zhì)粒為模板,利用特異性的dsRNA合成引物(表 3)進(jìn)行PCR擴(kuò)增,PCR體系和反應(yīng)程序同1.2.2,1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)目標(biāo)條帶。利用酚氯仿抽提法純化PCR產(chǎn)物,并用Backman Coulter DU730檢測(cè)產(chǎn)物濃度和OD值。

表3 本研究所用合成dsRNA的引物

以1 μg純化產(chǎn)物為模板合成dsRNA。在反應(yīng)體系中加入5×Transcription buffer 10 μL，ATP、CTP、GTP、UTP(100 mmol/L)各2 μL，RNA酶抑制劑1.5 μL，T7 RNA Polymerase(200 U/μL)0.5 μL,最后加入DEPC H2O至50 μL。37℃水浴4 h。在上述反應(yīng)體系中加入DNase(1 U/μL)2 μL，10×Reaction buffer 6 μL，DEPC H2O 1.5 μL,37℃水浴1 h消化DNA模板,結(jié)束后用酚氯仿抽提法純化dsRNA。用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)dsRNA質(zhì)量,并用NanoDrop 2000檢測(cè)產(chǎn)物濃度和OD值。dsRNA保存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.6對(duì)中黑盲蝽USP、EcR基因進(jìn)行RNA干擾

取羽化1 d內(nèi)的中黑盲蝽雌成蟲(chóng),通過(guò)顯微注射儀Nanolater2010從后胸與腹部節(jié)間膜的最外側(cè)將dsRNA注射到雌成蟲(chóng)體內(nèi),dsRNA濃度15 000 ng/μL,每蟲(chóng)注射100 nL,共注射1 500 ng。取注射dsRNA后第3、6、9、12、15、18天全蟲(chóng)提取RNA,通過(guò)qPCR檢測(cè)基因轉(zhuǎn)錄水平的變化檢測(cè)沉默效率,每組處理3頭蟲(chóng),每處理組3次生物學(xué)重復(fù)。

1.2.7RNA干擾后中黑盲蝽雌蟲(chóng)卵巢掛卵量和生殖力測(cè)定

中黑盲蝽雌蟲(chóng)卵巢內(nèi)卵的數(shù)量統(tǒng)計(jì):初羽化雌蟲(chóng)注射dsEcR和dsUSP,對(duì)照組注射相應(yīng)量的dsGFP。分別解剖不同dsRNA處理后第10天的雌蟲(chóng),每個(gè)處理解剖30頭未交配雌蟲(chóng)。觀察卵巢形態(tài),拍照記錄。統(tǒng)計(jì)卵巢內(nèi)卵的數(shù)量,所有處理均進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)。

生殖力測(cè)定:初羽化雌蟲(chóng)注射dsRNA,對(duì)照組注射相應(yīng)量的dsGFP。注射后的雌蟲(chóng)與初羽化的雄蟲(chóng)放入一次性塑料杯內(nèi)交配,每塑料杯內(nèi)含雌、雄成蟲(chóng)各1頭。以新鮮的四季豆作為飼料和產(chǎn)卵基質(zhì),每3 d更換并統(tǒng)計(jì)四季豆上卵的數(shù)量。一旦發(fā)現(xiàn)雄蟲(chóng)死亡,立即補(bǔ)充新的性成熟的未交配雄蟲(chóng)。分別統(tǒng)計(jì)單雌產(chǎn)卵量和產(chǎn)卵前期,每處理共統(tǒng)計(jì)30對(duì)成蟲(chóng),所有處理均進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)。

1.2.8數(shù)據(jù)分析

利用SPSS 17.0軟件,中黑盲蝽EcR、USP基因在不同蟲(chóng)態(tài)、組織中轉(zhuǎn)錄水平分析用單因素方差分析,Tukey檢驗(yàn)。RNA干擾后雌蟲(chóng)卵巢掛卵量和生殖力的差異顯著性采用獨(dú)立樣本t測(cè)驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 中黑盲蝽EcR的序列特征

中黑盲蝽EcR基因的ORF序列全長(zhǎng)為1 413 bp,編碼470個(gè)氨基酸。通過(guò)預(yù)測(cè)得到的編碼蛋白質(zhì)分子量是53.65 kD,pI值為7.79。通過(guò)SMART網(wǎng)站分析EcR蛋白序列的功能結(jié)構(gòu)域,結(jié)果表明該序列含有典型的類(lèi)固醇核受體轉(zhuǎn)錄因子家族的蛋白結(jié)構(gòu)。N端有核激素受體C4 鋅指結(jié)構(gòu)域(c4 zinc finger in nuclear hormone receptors, ZnF-C4),靠近C端有一個(gè)激素受體配體結(jié)構(gòu)域(ligand binding domain of hormone receptors, HOLI)(圖1a)。該蛋白氨基酸序列與半翅目綠盲蝽Apolyguslucorum相似度最高,達(dá)97.0%;與溫帶臭蟲(chóng)Cimexlectularius、大猿葉甲Colaphellusbowringi、褐飛虱Nilaparvatalugens和飛蝗Locustamigratoria的EcR蛋白氨基酸序列的相似度分別是81.9%、77.5%、72.7%和76.2%(圖1b)。與其他19種昆蟲(chóng)一起構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中,其與半翅目昆蟲(chóng)的EcR蛋白聚在一起,并與綠盲蝽的EcR蛋白進(jìn)化關(guān)系最近(圖2)。

圖1 中黑盲蝽EcR蛋白功能結(jié)構(gòu)域與氨基酸序列比對(duì)

圖2 中黑盲蝽EcR和其他昆蟲(chóng)同源序列系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析

2.2 中黑盲蝽USP的序列特征

中黑盲蝽USP基因的ORF序列全長(zhǎng)1 209 bp,編碼402個(gè)氨基酸。通過(guò)預(yù)測(cè)得到的蛋白質(zhì)分子量是44.99 kD,pI值為7.94。通過(guò)SMART網(wǎng)站分析USP蛋白氨基酸序列的功能結(jié)構(gòu)域,結(jié)果表明該序列含有典型的類(lèi)固醇核受體轉(zhuǎn)錄因子家族的蛋白結(jié)構(gòu)。N端有ZnF-C4結(jié)構(gòu)域,靠近C端有一個(gè)HOLI配體結(jié)構(gòu)域(圖3a)。將該蛋白氨基酸序列與其他昆蟲(chóng)USP蛋白氨基酸序列進(jìn)行比對(duì),結(jié)果表明它與溫帶臭蟲(chóng)相似度最高,為82.7%;與德國(guó)小蠊Blattellagermanica、飛蝗、赤擬谷盜Triboliumcastaneum和家蠶Bombyxmori中的USP蛋白氨基酸序列的相似度分別是77.1%、79.9%、70.5%和52.7%(圖3b)。與其他21種昆蟲(chóng)一起構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中,它與半翅目昆蟲(chóng)的USP聚在一起,并與溫帶臭蟲(chóng)的USP蛋白進(jìn)化關(guān)系較近(圖4)。

圖3 中黑盲蝽USP蛋白功能結(jié)構(gòu)域與氨基酸序列比對(duì)

圖4 中黑盲蝽USP和其他昆蟲(chóng)同源序列系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析

2.3 EcR、USP基因在中黑盲蝽不同發(fā)育階段和組織中轉(zhuǎn)錄水平分析

通過(guò)qPCR對(duì)中黑盲蝽不同發(fā)育階段和組織中的EcR、USP轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果顯示EcR在8日齡雌、雄成蟲(chóng)中的基因轉(zhuǎn)錄水平最低,其次是5齡若蟲(chóng);在3齡若蟲(chóng)和1日齡雌成蟲(chóng)中基因轉(zhuǎn)錄水平最高,分別是5齡若蟲(chóng)轉(zhuǎn)錄水平的3.38倍和3.41倍,其他齡期差異不顯著(圖5a)。EcR在卵巢剛進(jìn)入成熟期時(shí)(8日齡)的不同組織中,在脂肪體中的基因轉(zhuǎn)錄水平顯著高于其他組織,其次是頭,在胸、卵巢和中腸中的基因轉(zhuǎn)錄水平無(wú)顯著差異(圖5b)。USP在剛羽化的1日齡雌、雄成蟲(chóng)中的轉(zhuǎn)錄水平顯著高于其他齡期,分別是5齡若蟲(chóng)基因轉(zhuǎn)錄水平的8.96倍和6.25倍,在其他齡期中的基因轉(zhuǎn)錄水平無(wú)顯著差異(圖5c)。USP在8日齡雌成蟲(chóng)的頭和脂肪體的基因轉(zhuǎn)錄水平最高,分別是卵巢中基因轉(zhuǎn)錄水平的3.67倍和3.42倍,在中腸中的基因轉(zhuǎn)錄水平最低(圖5d)。

圖5 中黑盲蝽EcR、USP的時(shí)空表達(dá)模式

2.4 dsEcR與dsUSP的沉默效率

1日齡雌成蟲(chóng),注射dsEcR或dsUSP后,取第3、6、9、12、15、18 天的成蟲(chóng)。利用qPCR檢測(cè)EcR或USP的轉(zhuǎn)錄水平變化,結(jié)果顯示,干擾EcR后除第3 天外,6～18 d內(nèi)的EcR基因轉(zhuǎn)錄水平均顯著下降,沉默效率均在50%以上(圖6a);干擾USP3～18 d內(nèi)的USP基因轉(zhuǎn)錄水平均顯著下降,沉默效率均在50%以上(圖6b)。

圖6 EcR、USP沉默后基因表達(dá)量檢測(cè)

2.5 EcR對(duì)中黑盲蝽生殖的影響

處理組中黑盲蝽卵巢的掛卵量顯著減少,僅有對(duì)照組的31.5%(圖7 a)。注射dsEcR或dsGFP后的1日齡雌成蟲(chóng)單獨(dú)與雄成蟲(chóng)成對(duì)飼養(yǎng),每3 d統(tǒng)計(jì)一次雌成蟲(chóng)產(chǎn)卵量并記錄產(chǎn)卵日期。結(jié)果顯示,處理組與對(duì)照組的產(chǎn)卵前期沒(méi)有顯著差異(圖7b);單雌產(chǎn)卵量有極顯著差異,處理組僅為對(duì)照組的19.6%(圖7c);處理組產(chǎn)卵趨勢(shì)與對(duì)照組基本一致,對(duì)照組7～9 d產(chǎn)卵量大幅增加,13～15 d達(dá)到產(chǎn)卵高峰,處理組整體卵量都比較少,10～12 d和16～18 d產(chǎn)卵量最多(圖7 d)。

圖7 干擾EcR的表達(dá)對(duì)中黑盲蝽雌蟲(chóng)生殖力的抑制

解剖注射dsRNA后第10 天的卵巢時(shí)發(fā)現(xiàn)卵巢內(nèi)成型的卵較少,因此分別在注射dsEcR或dsGFP后第2、4、6、8、10、12、14、16天和第18 天解剖卵巢,觀察其發(fā)育情況。從圖8可以看出第4天對(duì)照組就有成熟的卵產(chǎn)生,第10天開(kāi)始有大量卵產(chǎn)生。而處理組自14 d才開(kāi)始有完整的卵產(chǎn)生,且量明顯少于對(duì)照組。注射dsEcR使卵巢在發(fā)育過(guò)程中卵的產(chǎn)生推遲,卵的數(shù)量減少。

圖8 沉默EcR后2～18 d中黑盲蝽體內(nèi)卵巢發(fā)育情況

2.6 USP對(duì)中黑盲蝽生殖的影響

對(duì)1日齡雌成蟲(chóng)注射dsUSP或dsGFP后第10 天解剖雌蟲(chóng)并統(tǒng)計(jì)卵巢內(nèi)的掛卵量。處理組的中黑盲蝽卵巢的掛卵量顯著減少,與對(duì)照組相比減少13.4%(圖9a)。注射dsUSP或dsGFP后的1日齡雌成蟲(chóng)與雄成蟲(chóng)成對(duì)飼養(yǎng),每3 d統(tǒng)計(jì)1次雌成蟲(chóng)的產(chǎn)卵量并記錄產(chǎn)卵日期。結(jié)果顯示,處理組與對(duì)照組的產(chǎn)卵前期沒(méi)有顯著差異(圖9b);單雌產(chǎn)卵量存在顯著差異,處理組比對(duì)照組減少36%(圖9c);處理組產(chǎn)卵趨勢(shì)與對(duì)照組一致,7～9 d達(dá)到產(chǎn)卵高峰,之后緩慢下降,每3 d的卵量都比對(duì)照組少(圖9d)。

圖9 干擾USP的表達(dá)對(duì)中黑盲蝽雌蟲(chóng)生殖力的抑制

2.7 EcR、USP對(duì)中黑盲蝽壽命的影響

注射dsEcR、dsUSP后的1日齡雌成蟲(chóng)與雄成蟲(chóng)成對(duì)飼養(yǎng),每天記錄存活情況。結(jié)果顯示,注射dsGFP的中黑盲蝽(對(duì)照)與注射dsEcR的中黑盲蝽前9 d存活率一致,之后每天存活的數(shù)量均逐漸減少,但處理組中黑盲蝽存活率減少幅度更大(圖10b)。成蟲(chóng)壽命有顯著差異,處理組平均比對(duì)照組少5 d,表明沉默EcR會(huì)影響中黑盲蝽雌成蟲(chóng)的壽命(圖10a)。注射dsGFP的中黑盲蝽(對(duì)照)與注射dsUSP的中黑盲蝽前5 d存活率一致,之后每天的存活率均逐漸減少,但處理組中黑盲蝽存活率減少幅度更大(圖10d);成蟲(chóng)壽命有顯著差異,處理組平均比對(duì)照組少2.4 d,表明沉默USP會(huì)影響中黑盲蝽雌成蟲(chóng)的壽命(圖10c)。

圖10 干擾EcR、USP對(duì)中黑盲蝽壽命和存活率的影響

3 結(jié)論與討論

20E受體EcR和USP有相似的結(jié)構(gòu)域,通常由5個(gè)結(jié)構(gòu)域組成,依次是擁有轉(zhuǎn)錄激活功能的A/B域(transactivation domain)、起到結(jié)合DNA作用的C域(DNA-binding domain)、能識(shí)別DNA并與DNA有高度親和性的D域(linker domain)、負(fù)責(zé)結(jié)合配體的E域(ligand binding domain,LBD)和F域[23-25]。本研究預(yù)測(cè)的中黑盲蝽EcR和USP的蛋白序列中有2個(gè)功能結(jié)構(gòu)域,分別是ZnF-C4結(jié)構(gòu)域和HOLI配體結(jié)構(gòu)域。鋅指(zinc finger, ZnF)結(jié)構(gòu)域是一組相對(duì)較小的蛋白質(zhì)基序,包含多個(gè)指狀突起,通過(guò)一個(gè)或多個(gè)鋅離子(Zn2+)實(shí)現(xiàn)配位穩(wěn)定[26-27]。ZnF-C4在核受體中的作用是結(jié)合基因組DNA上的特定位點(diǎn)從而激活下游基因的轉(zhuǎn)錄[28-29]。HOLI配體結(jié)構(gòu)域也稱(chēng)為L(zhǎng)BD。LBD除了能識(shí)別配體,還包含一個(gè)激活功能域(AF-2),對(duì)配體介導(dǎo)的核受體活性非常重要[30]。

USP和EcR在不同昆蟲(chóng)中的時(shí)空表達(dá)模式不同。在中黑盲蝽中,USP在剛羽化的1日齡雌成蟲(chóng)中的轉(zhuǎn)錄水平最高(圖5c);在雌成蟲(chóng)剛到達(dá)卵巢成熟期(8日齡)時(shí),USP在頭和脂肪體中的轉(zhuǎn)錄水平最高,其次是胸和卵巢,在中腸中轉(zhuǎn)錄水平最低(圖5d)。但是在梨小食心蟲(chóng)Grapholitamolesta中,GmUSP在腸道的轉(zhuǎn)錄水平顯著高于頭、馬氏管、表皮和脂肪體[31]。EcR在3齡若蟲(chóng)和剛羽化的1日齡雌成蟲(chóng)中的轉(zhuǎn)錄水平最高(圖5a)。卵巢剛到達(dá)成熟期的8日齡雌成蟲(chóng)不同組織中，EcR在脂肪體的轉(zhuǎn)錄水平顯著高于其他組織(圖5b)。在太平洋碩蠊Diplopterapunctata雌成蟲(chóng)中,DpEcR在咽側(cè)體、卵巢和神經(jīng)組織中高度表達(dá),在脂肪體中的轉(zhuǎn)錄水平較低[32]。在10日齡蝗蟲(chóng)雌成蟲(chóng)的脂肪體內(nèi)SchgrEcR轉(zhuǎn)錄水平最高[33]。在綠盲蝽成蟲(chóng)中也發(fā)現(xiàn)EcR在脂肪體和表皮中轉(zhuǎn)錄水平最高,在卵巢中轉(zhuǎn)錄水平最低[34]。昆蟲(chóng)的脂肪體是一種功能多樣化的組織,在昆蟲(chóng)生殖過(guò)程中負(fù)責(zé)提供卵黃原蛋白前體(yolk protein precursor)[35]以及卵巢內(nèi)卵成熟所需要的能量[36]。EcR在昆蟲(chóng)脂肪體內(nèi)有許多功能,有研究表明EcR介導(dǎo)的蛻皮激素信號(hào)能抑制果蠅脂肪體內(nèi)脂質(zhì)的積累[37]。在家蠶中20E信號(hào)在誘導(dǎo)饑餓條件下激活脂肪三?；视椭久富駼rummer導(dǎo)致脂肪體內(nèi)脂肪分解[38]。

本研究結(jié)果顯示,干擾EcR和USP使中黑盲蝽雌成蟲(chóng)的單雌產(chǎn)卵量分別下降了80.4%和36%,卵子發(fā)育進(jìn)度減緩。EcR和USP介導(dǎo)的20E信號(hào)可以控制卵巢發(fā)育早期生殖干細(xì)胞的分化[39-40]。在EcR突變的果蠅雌成蟲(chóng)卵巢中,缺少卵黃發(fā)生階段的卵室;在卵黃發(fā)生早期(8期和9期)的卵室中,卵泡細(xì)胞減少,且營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞核變小或破裂的現(xiàn)象[41]。10期卵母細(xì)胞中脂質(zhì)的階段特異性積累需要EcR通過(guò)促進(jìn)脂質(zhì)生成轉(zhuǎn)錄因子固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白(sterol regulatory element binding protein)的活化和控制LDL受體同源物L(fēng)pR2的表達(dá)來(lái)誘導(dǎo)[42]。在10B期,EcR正向調(diào)控核內(nèi)周期/基因擴(kuò)增(E/A)開(kāi)關(guān)[43]。EcR-B2是唯一一個(gè)在果蠅成熟卵泡細(xì)胞中起作用的EcR亞型,它介導(dǎo)了排卵所必需的20E信號(hào)[44]。EcR-B1亞型和USP共同介導(dǎo)了一個(gè)卵黃膜基因(vitelline membrane gene)VM32E的轉(zhuǎn)錄調(diào)控,該基因的產(chǎn)物是卵黃膜和絨毛膜內(nèi)層的組成部分[45]。同時(shí)20E信號(hào)在昆蟲(chóng)排卵過(guò)程中需要基質(zhì)金屬蛋白2(matrix metalloproteinase 2)的激活[46]。

本研究結(jié)果顯示,干擾EcR和USP使中黑盲蝽雌成蟲(chóng)的壽命分別減少了5 d和2.4 d。但有研究得出了完全相反的結(jié)果,EcR突變的果蠅雄成蟲(chóng)和雌成蟲(chóng)的平均壽命分別增加了40%～50%,生育能力沒(méi)有下降[47]。自然界中壽命和繁殖力呈負(fù)相關(guān)是普遍存在的情況[48],如取食JH類(lèi)似物的果蠅早期繁殖力增加但壽命縮短[49]。影響昆蟲(chóng)壽命的內(nèi)在因素還有胰島素樣肽(insulin-like peptide)[50-51]、單磷酸腺苷依賴(lài)的蛋白激酶(AMP-activated protein kinase)[52]和雷帕霉素靶標(biāo)(target of rapamycin)[53]等信號(hào)通路。因此干擾20E受體后中黑盲蝽壽命和生殖力同時(shí)降低的原因有待進(jìn)一步研究,可能涉及與其他信號(hào)通路的相互作用。