沒食子酸對棉鈴蟲生長發(fā)育的影響及作用機(jī)理

吳思雨, 梁 赫, 劉 秀, 路 偉, 邵雪花

(1.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所, 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部南亞熱帶果樹生物學(xué)與遺傳資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 廣東省熱帶亞熱帶果樹研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 廣州 510640；2.湖南人文科技學(xué)院, 農(nóng)作物有害生物綠色防控湖南省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 婁底 417000; 3.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院, 烏魯木齊 830052)

棉鈴蟲Helicoverpaarmigera(Hübner)屬鱗翅目Lepidoptera夜蛾科Noctuidae,是一種世界性遷飛性害蟲,廣泛分布于我國黃河流域和長江流域棉區(qū)[1]。該蟲能取食30多科200余種作物,包括棉花、玉米、小麥及多種蔬菜等。棉鈴蟲是棉花蕾鈴期重要的鉆蛀性害蟲,它通過取食棉花主莖、花蕾、花和花鈴給棉花生產(chǎn)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[2]。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì),2018年棉鈴蟲對我國棉花生產(chǎn)造成的經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)數(shù)10億元[3], 2019年僅新疆地區(qū)棉鈴蟲發(fā)生面積就高達(dá)8 072.79 hm2[4],為害極其嚴(yán)重。目前主要通過化學(xué)防治為主,生物防治為輔的方式對棉鈴蟲進(jìn)行防控,但長期使用化學(xué)殺蟲劑不僅導(dǎo)致棉鈴蟲對多種有效成分產(chǎn)生了較高的抗性[5],還對環(huán)境安全造成了較大威脅。相較之下,生物農(nóng)藥具有環(huán)境友好、對非靶標(biāo)生物安全、不易產(chǎn)生抗藥性等特點(diǎn),具備很大的開發(fā)利用潛力。印楝素是目前應(yīng)用最成功的生物農(nóng)藥之一,同時也是對鱗翅目、鞘翅目等害蟲殺蟲、拒食活性最高的一類化合物,但其只能從印楝樹的果實(shí)中分離獲得,成本高昂導(dǎo)致田間使用受限[6]。種植Bt棉也是防控棉鈴蟲的主要生物防治方法之一,但長期、廣泛地種植Bt棉花將導(dǎo)致棉鈴蟲對Bt蛋白產(chǎn)生抗性[7],對棉鈴蟲防效降低,同時還可導(dǎo)致其他害蟲增加[8]。因此,尋找新的具有殺蟲活性的天然產(chǎn)物對開發(fā)新型植物源農(nóng)藥具有十分重要的現(xiàn)實(shí)意義。

沒食子酸(gallic acid,GA)是一種多酚類有機(jī)化合物,在自然界中廣泛分布,是橄欖Canariumsubulatum、大葉桉Eucalyptusrobusta、紅景天Rhodiolarosea、芒果Mangiferaindica等多種植物中的主要活性成分之一[9],具有抗炎、抗突變、抗氧化、抗病毒等多種生物活性[10-13],此外,沒食子酸對常見食源性致病菌和腐敗菌有顯著的抑菌作用,其濃度為 0.125 mg/mL對于單核細(xì)胞增生李斯特氏菌Listeriamonocytogenes的抑制效果最為明顯,其抑菌直徑(24.03±0.17)mm[14]。研究表明,沒食子酸濃度為30 mg/mL時能顯著抑制水稻細(xì)菌性條斑病的發(fā)生[15]。He等[16]使用40 μg/mL的沒食子酸處理人卵巢細(xì)胞A2780/CP70和OVCAR-3,發(fā)現(xiàn)其對細(xì)胞增殖抑制率高達(dá)60.90%和97.89%,而對正常卵巢細(xì)胞無毒性。當(dāng)沒食子酸濃度為100 μg/mL時,其對胃癌細(xì)胞HGC-27的增殖抑制率為79.90%,在一定的濃度范圍內(nèi),其濃度與抑制率呈正相關(guān)[17]。由此可見,作為植物中的主要活性成分,沒食子酸的醫(yī)用活性得到了廣泛研究,但其農(nóng)用活性,特別是對昆蟲的生物活性卻鮮見研究報道。

本文以印楝素(azadirachtin)為陽性對照,研究沒食子酸對棉鈴蟲的拒食活性及整個生長發(fā)育歷程的影響,在此基礎(chǔ)上闡明其機(jī)理。以期為天然活性成分沒食子酸的開發(fā)利用提供重要參考,同時也為棉鈴蟲的綠色防控提供新視角。

1 材料和方法

1.1 供試蟲源

供試棉鈴蟲購于河南省科云生物有限公司,在室內(nèi)培養(yǎng)箱中用人工飼料繼代飼養(yǎng),飼養(yǎng)條件為溫度(26±1)℃,相對濕度(70±10)%,光周期L∥D=14 h∥10 h。幼蟲生長至3齡初期時,分接于扎孔的養(yǎng)蟲管中單頭飼養(yǎng),在管口上封一層滅菌紙防止其逃逸?；己髮⒂既〕鱿?，然后放入養(yǎng)蟲籠,成蟲羽化后用10%蜂蜜水為其補(bǔ)充營養(yǎng),并及時更換蜂蜜水。使用白色紗布作為棉鈴蟲成蟲的產(chǎn)卵載體。每天更換紗布,并將有卵粒的紗布置于新的養(yǎng)蟲籠中等待其孵化,待孵化后按照上述方法繼續(xù)飼養(yǎng)下一代,繁衍種群。期間不接觸任何化學(xué)藥劑。

1.2 儀器與試劑

供試藥劑：沒食子酸(gallic acid,GA),CAS號：149-91-7,純度≥98%,四川省維克奇生物科技有限公司,結(jié)構(gòu)式見圖1；印楝素(azadirachtin,Aza),CAS號：11141-17-6,純度≥98%,來自華南農(nóng)業(yè)大學(xué)亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護(hù)與利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，由廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所資源與環(huán)境研究室保存。

圖1 沒食子酸結(jié)構(gòu)式

佛手柑內(nèi)酯、茴芹內(nèi)酯、異茴芹內(nèi)酯、異歐前胡素、雙香豆素、7-甲氧基香豆素、檸檬油素、傘形花內(nèi)酯、異牡荊黃素、番石榴苷、東莨菪苷、根皮苷、(-)-沒食子兒茶素、(-)-表沒食子兒茶素、(+)-表兒茶素、香葉木素 7-O-β-D-葡萄糖苷、(±)-兒茶精、(-)-兒茶素、槲皮素、沒食子酸甲酯均購自四川省維克奇生物科技有限公司,純度均≥98%。

試驗(yàn)前以二甲基亞砜為溶劑將所有化合物配制成1 g/L的母液,置于4℃冰箱內(nèi)保存。

供試儀器：SPX-250B-G型微電腦光照培養(yǎng)箱購自上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；FB224 電子天平(1/10 000)由上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司提供；體視顯微鏡(MZ101)、顯微鏡相機(jī)(MSX2)購于廣州市明美光電技術(shù)有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.121種化合物對棉鈴蟲的拒食活性測定

采用浸漬葉碟法對棉鈴蟲進(jìn)行非選擇性拒食測定[18]。具體過程為：將鮮嫩的甘藍(lán)Brassicaoleracea洗凈后晾干,用打孔器打取直徑1.3 cm的圓形葉碟備用；將供試化合物使用0.3% tween-80水溶液稀釋為50 μg/mL,以0.3% tween-80水溶液作為陰性對照,50 μg/mL印楝素為陽性對照。將葉碟在藥液中浸泡8～10 s,取出置于干凈玻璃板上自然晾干,以浸濕的脫脂棉包住鑷子,用鑷子將葉碟置于養(yǎng)蟲盒中,每盒1片葉碟,接入10頭已饑餓處理4 h的棉鈴蟲1齡末幼蟲,每種化合物重復(fù)3盒。放置于溫度(26±1)℃,相對濕度(70±10)%,光周期L∥D=14 h∥10 h的培養(yǎng)箱中飼養(yǎng)。隨時觀察對照組葉片取食情況,當(dāng)陰性對照葉片被取食1/2以上時,立刻向養(yǎng)蟲盒中注水,以阻止棉鈴蟲繼續(xù)取食。將取食后的葉碟平鋪在玻璃板上,做好標(biāo)記并拍照掃描,掃描分辨率設(shè)置為600 dpi,用于計(jì)算取食面積。選擇初篩結(jié)果中拒食活性較好的化合物使用0.3% tween-80水溶液等比稀釋成6.25、12.5、25、50、100 μg/mL 5個濃度,以0.3% tween-80溶液為對照,每濃度3次重復(fù),按照上述方法進(jìn)一步測定其對棉鈴蟲的拒食活性。

1.3.2沒食子酸對棉鈴蟲生長發(fā)育影響的測定

采用飼料拌毒法測定沒食子酸對棉鈴蟲生長發(fā)育的影響[19]。在40～50℃未凝固的飼料中加入沒食子酸溶液使其含量為10 μg/g,迅速混勻,待其凝固后備用。以正常飼料為陰性對照。將同一天孵化的棉鈴蟲幼蟲共1 000頭,分別接入拌毒飼料與陰性對照中喂養(yǎng),每處理3次重復(fù)。待其生長至2齡末時,分別選取400頭幼蟲,轉(zhuǎn)移至扎孔的養(yǎng)蟲管中單頭飼養(yǎng),根據(jù)情況及時添加新鮮飼料。每天稱量并記錄棉鈴蟲的體重直至化蛹結(jié)束；成蟲羽化后飼喂10%蜂蜜水,每天觀察成蟲產(chǎn)卵情況并記錄；分別隨機(jī)挑選出300粒卵在50 μg/mL沒食子酸中浸8～10 s后取出晾干,以0.3% tween-80水溶液作為對照,觀察卵孵化情況并記錄數(shù)據(jù),每組設(shè)3次重復(fù)。期間每天對其進(jìn)行拍照。

1.3.3棉鈴蟲中腸病理切片

使用含50 μg/g沒食子酸的飼料飼喂棉鈴蟲2 齡幼蟲,48 h后解剖中腸。

石蠟切片觀察：在PBS緩沖液中解剖沒食子酸處理和對照棉鈴蟲幼蟲(n=10)中腸,在4℃下使用4%多聚甲醛固定24 h,用70%乙醇小心沖洗若干次。按照石蠟切片法[20]脫水浸蠟、包埋、切片(4 μm)、蘇木素-伊紅(HE)雙重染色、脫水封片,干燥后用尼康光學(xué)顯微鏡觀察拍照。

1.3.4棉鈴蟲生長發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)測定

使用50 μg/g沒食子酸飼料飼喂棉鈴蟲2 齡幼蟲,24 h后提取中腸RNA。

RNA提取與cDNA合成：將棉鈴蟲2齡幼蟲的中腸樣品置于已滅菌研缽中,用動物總RNA快速抽提試劑盒[B518621,生工生物工程(上海)股份有限公司]提取中腸RNA。質(zhì)量合格的RNA用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(RR047A,TaKaRa)合成 cDNA第一鏈,步驟為：中腸RNA 4 μL,5×PrimeScriptTMRT Master Mix(for Real Time)2 μL,RNase free ddH2O 4 μL。反應(yīng)條件為：37℃ 20 min,85℃ 2 min,16℃ 5 min,反應(yīng)結(jié)束后置于-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

棉鈴蟲生長發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)分析：利用實(shí)時熒光定量PCR(采用ABI QuantStudio 5實(shí)時熒光定量PCR系統(tǒng),賽默飛)分析沒食子酸處理后棉鈴蟲生長發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá),設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù),以Actin為內(nèi)參基因(表1)。反應(yīng)體系為：cDNA 1 μL,2× M5 HiPer Realtime PCR Super mix with Low Rox 5 μL,10 μmol/L上、下游引物各 0.25 μL,RNase Free ddH2O 3.5 μL。反應(yīng)程序：95℃ 30 s；95℃ 5 s,60℃ 30 s,40 個循環(huán)；95℃ 15 s,60℃ 1 min,95℃ 15 s。

表1 棉鈴蟲生長發(fā)育相關(guān)基因的 RT-qPCR引物

1.4 數(shù)據(jù)分析

使用Photoshop CS6計(jì)算取食面積后計(jì)算拒食率；使用DPS軟件計(jì)算拒食中濃度AFC50；使用Microsoft Excel 2022計(jì)算棉鈴蟲幼蟲與蛹的體重、化蛹率、羽化率；使用Origin 2019b進(jìn)行繪圖；使用SPSS 21.0中單因素方差分析和鄧肯氏多重比較進(jìn)行樣本之間的差異顯著性分析；石蠟切片使用Case Viewer 2.0軟件進(jìn)行處理。使用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)引物。

拒食率=[(對照組取食面積-處理組取食面積)/對照組取食面積]×100%=[1-(A-處理組剩余像素值)/(A-對照組取食像素值)]×100%,其中A為空白處理組單個葉碟的像素值；

化蛹率=化蛹的試蟲數(shù)/試蟲總數(shù)×100%；

蛹畸形率=畸形蛹數(shù)/總化蛹數(shù)×100%；

羽化率=羽化的試蟲數(shù)/化蛹數(shù)×100%；

成蟲畸形率=畸形的成蟲數(shù)/羽化的試蟲數(shù)×100%；

孵化率=孵化的卵粒數(shù)/卵粒總數(shù)×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 酚類化合物對棉鈴蟲幼蟲的拒食活性

通過葉碟試驗(yàn)測定21種酚類化合物及陽性對照印楝素對棉鈴蟲1齡末幼蟲的拒食活性,初篩濃度為50 μg/mL,檢測結(jié)果表明,其中14種酚類化合物對棉鈴蟲幼蟲不具有拒食活性,而7-甲氧基香豆素、傘形花內(nèi)酯、番石榴苷、根皮苷、香葉木素 7-O-β-D-葡萄糖苷、槲皮素、沒食子酸等7種化合物表現(xiàn)出一定的拒食活性。沒食子酸、香葉木素 7-O-β-D-葡萄糖苷和槲皮素在濃度為50 μg/mL下對棉鈴蟲1齡末幼蟲的拒食率分別為50.0%、37.5%和25.5%(表2)。在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步檢測了這3種化合物對棉鈴蟲1齡末幼蟲的拒食中濃度,結(jié)果表明，槲皮素因拒食活性較差(表3)未測出AFC50，香葉木素7-O-β-D-葡萄糖苷對棉鈴蟲的AFC50為72.54 mg/L,沒食子酸的AFC50為50.21 mg/L(表4)。

表2 21個酚類化合物對棉鈴蟲幼蟲的拒食活性篩選1)

表3 3種藥劑對棉鈴蟲幼蟲的拒食活性1)

表4 3種藥劑對棉鈴蟲1齡幼蟲拒食活性的回歸分析1)

2.2 沒食子酸對棉鈴蟲生長發(fā)育的影響

10 μg/g沒食子酸對棉鈴蟲幼蟲生長有明顯的抑制作用,部分高齡幼蟲未能完成蛻皮化蛹過程,導(dǎo)致蛹與成蟲畸形(圖2b,c)。沒食子酸處理第8～10 天時與對照組相比,棉鈴蟲5～6齡幼蟲的蟲重分別下降了26.85%、26.27%和19.85%(圖3a)。對照組(正常飼料)的蛹重(0.299 8 g/個)、化蛹率(86.67%)均顯著高于沒食子酸處理組(蛹重0.219 9 g/個,化蛹率為78.00%),對照組蛹畸形率(9.62%)顯著低于沒食子酸處理組的蛹畸形率(20.51%)(圖3b,圖4)。沒食子酸處理組棉鈴蟲羽化率(61.54%)是對照組(88.46%)的30.43%(P<0.05),而成蟲的畸形率(25.00%)則是對照(13.04%)的1.92倍(P<0.05)(圖4)。綜上,沒食子酸不僅能抑制棉鈴蟲體重增加,還可降低化蛹率和與羽化率,同時增加蛹和成蟲的畸形率,影響棉鈴蟲的整個生長發(fā)育歷程。

圖2 沒食子酸處理引起的棉鈴蟲形態(tài)變化

圖3 沒食子酸對棉鈴蟲幼蟲的生長發(fā)育的抑制

圖4 沒食子酸對棉鈴蟲生長發(fā)育的影響

2.3 沒食子酸損傷棉鈴蟲中腸,干擾其營養(yǎng)代謝

用含 50 μg/g沒食子酸的飼料飼喂棉鈴蟲2齡幼蟲48 h后解剖中腸進(jìn)行病理檢測,發(fā)現(xiàn)沒食子酸處理組的棉鈴蟲中腸腸壁增厚,杯狀細(xì)胞(GC)和消化細(xì)胞(DC)膨大并呈現(xiàn)空泡化,整個腸壁上的細(xì)胞從肌肉層脫落向內(nèi)腔擠壓,圍食膜(PM)細(xì)胞嚴(yán)重脫落,導(dǎo)致食物(F)直接與腸壁細(xì)胞接觸,中腸細(xì)胞大面積凋亡(圖5A)。進(jìn)一步提取中腸RNA進(jìn)行熒光定量PCR檢測,結(jié)果表明：沒食子酸處理后棉鈴蟲胰島素受體基因InR、葡萄糖異生基因G6Pase、凋亡指示基因p53、自噬指示基因Atg8顯著上調(diào)(圖5B)。說明沒食子酸干擾了棉鈴蟲的營養(yǎng)代謝,與病理切片(HE)檢測到的中腸組織損傷相吻合。

圖5 沒食子酸損傷棉鈴蟲幼蟲中腸并干擾營養(yǎng)信號通路

3 結(jié)論與討論

發(fā)展植物源農(nóng)藥是目前對害蟲進(jìn)行綠色防控的迫切需求,也是實(shí)現(xiàn)鄉(xiāng)村綠色振興的重要舉措。植物源農(nóng)藥的活性成分來源于植物,且具有對環(huán)境友好、對非靶標(biāo)生物安全、作用方式獨(dú)特、不易產(chǎn)生抗性的優(yōu)點(diǎn),并兼具殺蟲、殺菌、抗逆等功能,是化學(xué)農(nóng)藥的理想替代品[21]。因此,從天然產(chǎn)物中挖掘兼具植物內(nèi)吸特性的高活性物質(zhì),是開發(fā)新型植物源農(nóng)藥的關(guān)鍵。

利用植物源活性成分防治棉鈴蟲的研究層出不窮。孫文琰測定了24種植物對棉鈴蟲的活性,其中兒茶Senegaliacatechu枝條、白頭翁Pulsatillachinensis根和牡丹Paeonia×suffruticosa根皮90%乙醇提取物對棉鈴蟲的拒食率為33.22%、10.37%、16.54%[22]；楊雪峰等[23]測定了質(zhì)量濃度分別為0.80%的崗松精油、桉葉精油、鴉膽子與苦參堿對棉鈴蟲的拒食活性,結(jié)果顯示,其拒食率分別為52.75%、42.03%、50.57%、52.35%；崔正芳[24]使用20 mg/mL的白花曼陀羅Daturametel甲醇粗提物處理棉鈴蟲2齡中期幼蟲,其72 h拒食率為56.4%；王麗英[25]用不同溶劑提取苜蓿種子中的活性成分,并測定了提取物對棉鈴蟲的拒食活性,結(jié)果表明,20 mg/mL甲醇與乙醇提取物對棉鈴蟲的拒食活性分別為55.76%和52.01%。沒食子酸是一類廣泛存在于植物界中的多酚類化合物,具有安全性高、易降解、成本低、易獲取的特點(diǎn)[26],并具備多種生物活性,目前廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥領(lǐng)域,但對農(nóng)業(yè)害蟲的研究與應(yīng)用卻鮮見報道。本研究發(fā)現(xiàn)該化合物對棉鈴蟲幼蟲具備顯著的拒食活性,同時損傷中腸,干擾其營養(yǎng)代謝,抑制害蟲的生長發(fā)育。沒食子酸的作用方式與作用機(jī)理同印楝素類似[27],雖其活性略低于印楝素,但由于沒食子酸成本低且易獲得的優(yōu)勢更容易在生產(chǎn)中推廣應(yīng)用。

本文研究中發(fā)現(xiàn)沒食子酸處理后棉鈴蟲蟲體小于對照組,尤其是2齡與3齡幼蟲,這可能是由于鱗翅目低齡幼蟲對藥物敏感[28],齡期愈大,藥物的效果愈低,故推薦最佳給藥時期為幼蟲3齡前。本研究中對照組的棉鈴蟲在第10 天時因已進(jìn)入預(yù)蛹期故呈現(xiàn)出體重驟降的現(xiàn)象,而沒食子酸處理的棉鈴蟲出現(xiàn)體重驟減是在給藥處理第12～13天,證明沒食子酸處理可致使棉鈴蟲化蛹推遲2～3 d,李春英[29]用何首烏Pleuropterusmultiflorus干粉飼喂棉鈴蟲幼蟲,發(fā)現(xiàn)其幼蟲期延長5 d。沒食子酸處理后化蛹率、羽化率、孵化率均顯著降低,而蛹與成蟲的畸形率顯著增加,部分高齡幼蟲甚至無法完成蛻皮化蛹,這可能是由于沒食子酸抑制了棉鈴蟲的營養(yǎng)吸收,從而使其無法儲存足夠營養(yǎng)供幼蟲生長發(fā)育與蛻皮化蛹,這與棉鈴蟲中腸損傷及營養(yǎng)相關(guān)基因上調(diào)相吻合。

本研究明確了沒食子酸對棉鈴蟲具有良好的拒食活性,同時損傷中腸、干擾營養(yǎng)代謝途徑,抑制了棉鈴蟲的生長發(fā)育。沒食子酸作為天然活性成分,且安全、無毒易降解、成本低、易獲得等優(yōu)點(diǎn),具備開發(fā)成為植物源農(nóng)藥的巨大潛力。但鑒于活性較低,后續(xù)可進(jìn)一步研究沒食子酸與化學(xué)農(nóng)藥混配,達(dá)到藥物活性與安全性的平衡,并進(jìn)行田間防效試驗(yàn),以期為棉鈴蟲的綠色防控提供新的思路。