不同干旱脅迫及亞精胺復水對南方紅豆杉生理特性的影響

溫家康，邢長杰，王亞萍，楊 樂，鄭 偉，李文楊

（1.信陽農林學院林學院信陽市林木遺傳育種重點實驗室，河南信陽 464000；2.新疆農業(yè)大學林學與風景園林學院新疆教育廳干旱區(qū)林業(yè)生態(tài)與產業(yè)技術重點實驗室，烏魯木齊 830052）

0 引言

南方紅豆杉（Tɑxus chinensisvar.mɑirei），也叫紫杉，屬于紫杉科（Taxaceae），紅豆杉屬植物（Tɑxus），主要分布于中國南方，其植物中提取的紫杉醇是公認的珍貴抗癌藥物，具有極高的利用價值和研究潛力[1,2]。近年來，自然災害突發(fā)頻率增大，在各種自然災害中，旱災具有持續(xù)時間長、影響范圍廣、頻率高等特征，給幼苗期的紅豆杉帶來極大的危害[3,4]。據(jù)報道，干旱對植物的影響是全方位的，往往能夠導致細胞結構發(fā)生改變，從而對植物的光合作用、生理活性產生影響，導致植物生長受限，嚴重時甚至會導致植物死亡[5]。利用外源物質提高植物抗逆性是簡便、有效、可行的方法之一[6]。

多胺（PAs）屬于在植物體廣泛存在的一類脂肪族含氮堿化合物，是植物內源性成長調節(jié)劑之一，主要有腐胺（Put）、精胺（Spm）和亞精胺（Spd）等[7,8]。由于亞精胺（Spd）的多聚陽離子性能最好，在逆境脅迫條件下起到了保護性物質和信號分子的作用，它的調節(jié)作用主要體現(xiàn)在植物的抗逆性上，因此，亞精胺與逆境脅迫之間的關系研究最為廣泛[9,10]。由于它能與酶分子直接結合，使單位酶活力增加，過氧化氫含量下降，可以在一定程度上減輕植物受干旱脅迫的損害[11]。已有研究發(fā)現(xiàn)外源Spd起到緩解干旱脅迫對甜瓜幼苗傷害的作用，增強甜瓜幼苗對干旱逆境的適應性[12]；魏曉凱等[6]研究發(fā)現(xiàn)噴施最佳濃度Spd能夠有效提高烤煙幼苗的抗旱能力；胡勝男等[13]發(fā)現(xiàn)噴施Spd顯著影響閩楠幼苗各項生理、光合指標，緩解了閩楠幼苗因干旱受到的損傷，并從光合角度篩選出適合閩楠幼苗的最佳Spd濃度。目前對于外源亞精胺與植物逆境脅迫雖有一定研究，但在南方紅豆杉的領域研究還較為匱乏，且對南方紅豆杉干旱脅迫后噴施最佳Spd濃度也未有研究。鑒于此，本試驗通過設置不同干旱梯度脅迫以及不同濃度亞精胺復水處理，探究南方紅豆杉葉片生理活性和功能物質對干旱脅迫的協(xié)同變化，比較不同濃度外源亞精胺復水處理對南方紅豆杉生理特性的影響，以期為南方紅豆杉的高產栽培和應用推廣提供科學依據(jù)。

1 試驗材料與方法

1.1 試驗材料和試驗地概況

2022年6-8月在河南省信陽市平橋區(qū)信陽農林學院林學院試驗基地（114°06′E、31°12.5′N）進行南方紅豆杉干旱脅迫試驗。試驗材料選用設施大棚中培養(yǎng)的3 a生南方紅豆杉幼苗，植株生長一致、健康、無病蟲害，平均樹高0.7 m，胸徑1.5 cm。棚內平均氣溫34～37℃，平均相對濕度60%～65%，利用一層遮陽網遮陰，通風良好，控制設施大棚內光照、溫度和濕度，使所有植株均始終處于相同外界條件。

1.2 試驗處理

于6月中旬選取48株3 a生幼苗期南方紅豆杉，采用盆栽控水法（口徑40 cm、高50 cm），進行干旱脅迫處理。調整土壤濕度一致后，根據(jù)正常生理需水量，設置3個處理：輕度脅迫T1處理（50 mL/d）、中度脅迫T2處理（33 mL/d）、重度脅迫T3處理（0 mL/d），設置正常澆水（100 mL/d）為空白對照（CK），單株處理，每處理12個重復，分別在處理的第0、7、14、21和28 d對南方紅豆杉成熟葉片取樣，液氮速凍后-80℃冰箱保存后留待備用。

亞精胺復水試驗：干旱脅迫處理28 d后，因部分重度脅迫（T3組）可能導致植株死亡，且輕度脅迫（T1組）相比中度脅迫（T2組）各項指標影響較小，為使復水效果更為顯著，對中度干旱脅迫的南方紅豆杉進行復水試驗。試驗共分4個處理。N1處理：正常復水（100 mL/d）+噴施0.5 mmol/L外源亞精胺溶液；N2處理：正常復水（100 mL/d）+噴施1.0 mmol/L外源亞精胺溶液；N3處理：正常復水（100 mL/d）+噴施1.5 mmol/L外源亞精胺溶液；以正常復水不噴施外源亞精胺的中度干旱脅迫南方紅豆杉為EGCK處理，單株處理，重復3次。噴施時靠近植株葉片的正反面，噴施量以葉片葉面水珠凝結滴落為標準，處理后的第3 d進行南方紅豆杉成熟葉片的采集，使用液氮速凍后放-80℃冰箱進行保存，留待備用。

1.3 測定方法

本研究以乙醇浸出法、考馬斯亮藍染色法、氮藍四唑光化還原法以及愈創(chuàng)木酚法分別測定了南方紅豆杉葉片中的葉綠素總量、可溶性蛋白含量、SOD活性和過氧化物酶活性，具體操作參考劉家堯等[14]編著的《植物生理學實驗教程》。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

通過Excel 2019進行標準曲線繪制與實驗數(shù)據(jù)的統(tǒng)計，利用SPSS 24.0數(shù)據(jù)分析軟件進行方差分析（ANOVA）以及Duncan多重比較分析，使用Origin 2021作圖。

2 結果與分析

2.1 不同干旱脅迫對南方紅豆杉葉綠素含量的影響

不同干旱處理下南方紅豆杉葉片的葉綠素總含量如圖1所示，在土壤持續(xù)干旱過程中，與CK相比，3個脅迫處理葉片的葉綠素總含量均呈增加趨勢，整體上呈“升——降——升——降”的趨勢，在第7 d和第21 d達到峰值，脅迫至第7 d，處理T3的葉片葉綠素總含量達到最高值，比CK葉片葉綠素總含量高126.1%，其次為T2處理，高出CK含量125.0%，最低為T1處理，高出CK葉綠素含量的77.2%；隨著干旱時間的延長，在短暫的下降后，在第21 d葉綠素總量達到第2次峰值，此時處理T3的葉片葉綠素總含量最高，顯著高于T2和T1處理（P＜0.05），且比CK高出139.8 %，其次為T2和T1處理，分別比CK高52.3%、23.9%；脅迫至第28 d葉綠素含量均呈下降趨勢，此時重度脅迫T3組顯著低于CK組（P＜0.05）。在葉綠素含量曲線波動中，在28 d之前，相比CK的葉綠素總含量總是T3＞T2＞T1，且短期干旱脅迫處理對南方紅豆杉葉綠素含量呈正向促進作用。

圖1 不同持續(xù)干旱脅迫對南方紅豆杉生理活性的影響Fig.1 Effects of different persistent drought stresses on physiological activity of T.chinensis var.mairei

2.2 不同干旱脅迫對南方紅豆杉丙二醛含量的影響

圖1結果所示，隨脅迫天數(shù)的增加3組葉片中丙二醛（MDA）含量均呈上升趨勢，脅迫至21 d到達峰值，隨后趨于平緩，且處理T1、T2南方紅豆杉葉片中MDA含量上升趨勢相比T3較為平緩，處理至21 d，T1、T2、T3組南方紅豆杉葉片中MDA含量均達到最高含量水平，此時T3處理的MDA含量最高，且顯著高于T2和T1處理（P＜0.05），相比CK高出145.2%；其次為T2，比CK高出48.9%；而脅迫較輕的T1處理MDA含量最低，比CK高出39.1%。綜合來看，3個不同脅迫程度的MDA含量均顯著高于CK（P＜0.05），且葉片MDA含量與脅迫梯度以及脅迫時間呈正相關。

2.3 不同干旱脅迫對南方紅豆杉SOD活性的影響

南方紅豆杉受到干旱脅迫后，其葉片中的保護酶活性均發(fā)生不同程度的變化。隨著處理時間的增加，酶活性整體呈上升趨勢，其中0～7 d各處理SOD活性變化較為平緩，脅迫至第14 d，此時3個處理的SOD活性顯著增加且高于CK（P＜0.05），此時T3處理的SOD達到最高活性水平，隨后T2和T1分別在21 d和28 d達到峰值，且T3的峰值顯著高于T2和T1處理（P＜0.05），T1處理SOD活性上升較為緩慢。T3處理在脅迫14 d后，呈現(xiàn)下降趨勢，脅迫至28 d，T3處理的SOD活性顯著低于CK（P＜0.05），此時T2處理最高，其次為T1。綜合來看，T3處理的SOD活性上升最快，且峰值來臨時間最早，其次為T2以及T1處理，且峰值過后葉片SOD活性持續(xù)高于對照組，說明T3受干旱脅迫的影響較大，且干旱脅迫對脅迫中前期的SOD活性呈正相關。

2.4 不同干旱脅迫對南方紅豆杉可溶性蛋白的影響

由圖1可知，南方紅豆杉受到干旱脅迫后，其葉片中的可溶性蛋白含量均發(fā)生不同程度的變化。可溶性蛋白峰值水平顯著高于同時期CK（P＜0.05），總體呈現(xiàn)先升后降的波動趨勢，其中0～7 d各處理可溶性蛋白含量變化較為平緩，脅迫至第14 d，此時3個處理的可溶性蛋白含量顯著增加且高于CK（P＜0.05），T3處理可溶性蛋白含量達到最高水平；隨后T2和T1可溶性蛋白的含量分別在21 d和28 d達到最高水平，且T3的峰值含量顯著高于T2和T1處理（P＜0.05），T3處理在脅迫14d達到最高水平后，呈現(xiàn)下降趨勢，脅迫至28 d，T3處理的可溶性蛋白含量顯著低于CK處理（P＜0.05），T2在脅迫21 d達到最高水平后，呈現(xiàn)下降趨勢，T1在0～21 d期間可溶性蛋白變化較為平緩，脅迫至28 d可溶性蛋白含量到達最高水平。綜合來看，短期干旱可以使南方紅豆杉葉片的可溶性蛋白含量上升，與脅迫處理程度呈正向促進作用，并且與葉片SOD活性呈協(xié)同變化趨勢。

2.5 外源亞精胺復水對南方紅豆杉生理活性的影響

由圖1可知，重度脅迫T3處理在第28 d時，葉綠素總含量、SOD活性和可溶性蛋白含量均低于正常組CK，可能達到生理閾值，不能作為復水最佳選擇。為使復水效果更為顯著，對中度脅迫T2處理進行亞精胺復水，生理活性變化如圖2所示。在干旱復水后，4個不同處理葉綠素總含量水平均不同程度地高于復水前，且N2處理的南方紅豆杉葉片葉綠素總含量最高，為EGCK的140.5 %，與復水前以及EGCK呈顯著差異（P＜0.05），其中N3處理葉綠素總含量僅次于N2處理，且噴施亞精胺處理均高于EGCK處理。復水后4個處理的MDA含量均有不同程度下降，且組間差異顯著（P＜0.05），其中N2處理的南方紅豆杉葉片MDA含量最低，相比EGCK降幅最大，為EGCK的31.6%，且N3處理MDA含量降幅僅次于N2處理。復水后3個亞精胺處理的SOD活性均有不同程度上升，且組間差異顯著（P＜0.05），其中N2處理的南方紅豆杉葉片SOD活性最高，相比EGCK上升程度最大，為EGCK的23.4 %，且N3處理SOD活性升高程度僅次于N2處理。復水后4個處理的可溶性蛋白含量均有不同程度升高，且組間差異顯著（P＜0.05），其中N2處理的南方紅豆杉葉片可溶性蛋白含量最高，相比EGCK上升程度最大，為EGCK的34.5 %，且N3處理可溶性蛋白含量升高程度僅次于N2處理。綜合來看，噴施3種濃度的亞精胺相比單一復水處理均有較強的促進作用，其中N2處理組對南方紅豆杉的生理活性影響最大，N3處理的復水促進作用僅次于N2處理，其次為N1處理。

圖2 不同濃度外源亞精胺復水對南方紅豆杉生理活性的影響Fig.2 Effects of different concentrations of exogenous spermidine rehydration on physiological activity of T.chinensis var.mairei

3 討論

干旱脅迫是植物在生長過程中遭受到主要的非生物脅迫，可導致植物生理代謝活動雙向波動，且適度的干旱脅迫也可促進植物的生長量[15,16]。其中葉綠素在植物光能吸收和轉化中起重要作用，當環(huán)境發(fā)生劇烈變化時，植物可以通過光合色素的動態(tài)變化來保證正常的光合作用，葉綠素總含量是直接反映其受逆境脅迫程度的重要指標之一[17]。本研究表明，相比對照組不同持續(xù)干旱脅迫均顯著升高了葉綠素總含量（P＜0.05），葉綠素含量首次出現(xiàn)高峰表明，南方紅豆杉幼苗在短時間和低強度干旱脅迫下，會首先發(fā)生應激反應，提高葉片的葉綠素總含量，以適應干旱脅迫引起的植物代謝產物急劇下降，干旱脅迫下植物葉綠素總含量變化代表植物光合能力和對水分脅迫的敏感度[18]。脅迫至21 d，葉片中的葉綠素含量經歷了短暫的下降，達到了第2個峰值，推測此時隨著干旱時間持續(xù)增加，土壤干旱脅迫程度不斷加深，南方紅豆杉幼苗開始適應脅迫環(huán)境，從而產生了相應的生理反應，這與張玉玉等[19]研究結果相似。持續(xù)脅迫至后期，重度脅迫的葉綠素總含量驟然下降且低于對照，推測此時植物生理調節(jié)能力可能已達極限，造成不可逆失活，這與阮凌暄等[20]研究結果一致。本試驗中適度干旱使葉綠素含量升高，葉綠素又是植物光合作用的重要因素，因此適度的干旱脅迫能夠提高南方紅豆杉的光合能力，增加植株的生物量[21]。

丙二醛是機體內脂質過氧化的最終產物之一，其含量高低可一定程度地反映植物受氧化傷害的程度[22,23]。本研究表明，3種不同持續(xù)干旱脅迫相比對照顯著增加了丙二醛含量，且隨脅迫梯度的增加，MDA含量的累積呈較高水平，其中持續(xù)重度脅迫處理的葉片MDA含量顯著高于其他2組處理，說明持續(xù)重度脅迫對南方紅豆杉的損傷最大，且隨脅迫梯度的增加，MDA含量的累積呈較高水平。

植物對逆境脅迫的生理反應是以酶的催化活動實現(xiàn)的，SOD的活性水平已被證實與機體自身的抗性密切相關，是植物細胞內抵御活性氧（ROS）傷害的主要保護性酶類，對清除和阻止ROS的產生起到重要作用[24,25]。本研究結果顯示，與CK相比3種不同持續(xù)干旱脅迫處理顯著提高了SOD活性，且脅迫越嚴重越為顯著。干旱脅迫越嚴重，酶活性峰值到來越早，持續(xù)脅迫至后期，重度脅迫條件下酶活性達到峰值過后呈下降趨勢，推測在低強度和短時間干旱脅迫情況下，能誘導南方紅豆杉葉片保護酶活性提高，并能清除部分活性氧，從而減輕干旱對植物機體的損害[26]。但持續(xù)的重度干旱脅迫打破了植物細胞自由基產生和清除的動態(tài)平衡，進而出現(xiàn)活性氧過量累積，加劇膜脂過氧化而造成整體膜的損傷，導致植物死亡[27]。由于在短期的干旱脅迫中，SOD活性水平與干旱脅迫呈正相關，因此適度干旱脅迫鍛煉，也可以增加南方紅豆杉的抗逆性，使植物在逆境環(huán)境中性狀更為穩(wěn)定。

可溶性蛋白的含量是植物組織里重要的滲透調節(jié)物質和營養(yǎng)物質，亦是植物抗旱能力的重要指標之一[28]。在干旱條件下，細胞會通過積累滲透調節(jié)物質來維持膨壓，以保持植物正常生理活動，植物細胞缺水會促使植物主動累積可溶性蛋白等滲透物質，以降低細胞滲透勢，增加細胞持水量[29]。本研究結果顯示，南方紅豆杉葉片可溶性蛋白含量總體呈先升后降的趨勢，干旱脅迫越嚴重，可溶性蛋白含量峰值到來越早，此時可溶性蛋白含量越高。南方紅豆杉為適應一定范圍內的干旱脅迫，短時間內依靠合成更多的可溶性蛋白來調節(jié)自身的滲透勢，這與徐瀾等[30]研究結果一致。但植物依靠合成滲透調節(jié)物質蛋白質等來適應脅迫的能力是有限的，隨著脅迫程度的增加，滲透調節(jié)系統(tǒng)逐漸紊亂，組織中的可溶性蛋白質含量也隨之降低[31]。并且在干旱脅迫過程中，可溶性蛋白與SOD活性變化趨勢呈現(xiàn)協(xié)同性，因此適度干旱鍛煉，可溶性蛋白的含量對南方紅豆杉抗旱性具有重要意義。

為探究南方紅豆杉有效緩解干旱脅迫的方法，本研究對南方紅豆杉持續(xù)干旱脅迫后進行亞精胺復水試驗。結果顯示，噴施外源亞精胺處理相比單一復水處理均有較強的促進作用，其顯著提高了葉綠素含量、SOD活性以及可溶性蛋白，顯著降低了MDA含量，有效提高了干旱脅迫下南方紅豆杉的光合能力，加速了活性氧的清除，增加了南方紅豆杉的滲透調節(jié)能力，緩解了因長期干旱脅迫而膜脂過氧化造成的損傷，這與孫天國等[12]研究結果一致。通過對比不同濃度的外源亞精胺復水，結果顯示，1.0 mmol/L的外源亞精胺復水處理效果最為顯著，相比0.5 mmol/L以及1.5 mmol/L，噴施1.0 mmol/L的外源亞精胺復水處理對南方紅豆杉的干旱恢復作用最強。在實際生產中，對南方紅豆杉干旱林區(qū)適當噴施1.0 mmol/L的外源亞精胺，也具有一定的緩解作用。本試驗僅對幼苗期南方紅豆杉葉片干旱脅迫以及外源亞精胺復水第3 d的生理活性變化進行了分析，只觀測短期變化，對南方紅豆杉生長發(fā)育的影響需長期觀察繼續(xù)研究。另外，外源亞精胺提高植物抗旱能力途徑有很多種，如增強干旱信號的傳導，提高南方紅豆杉某些保護酶（主要是POD）的活性，直接參與氧自由基的清除，以及增強南方紅豆杉的滲透調節(jié)能力等，這些途徑之間的關聯(lián)還尚未完全清楚，外源亞精胺對干旱脅迫更深層次的抗旱機理與作用途徑還有待進一步研究。

4 結論

通過對幼苗期南方紅豆杉持續(xù)干旱脅迫表明，前期的干旱處理對南方紅豆杉起正向積極作用，干旱脅迫可顯著提高南方紅豆杉葉片的葉綠素總含量、MDA含量、SOD活性以及可溶性蛋白含量，并呈現(xiàn)不同的波動變化，特別是重度干旱脅迫下，其各項數(shù)值的變化幅度更大，且SOD活性、可溶性蛋白含量的峰值來臨時間最早。其中對幼苗期南方紅豆杉復水+1 mmol/L外源亞精胺的組合，能有效緩解干旱脅迫帶來的損傷，并提高幼苗期南方紅豆杉對干旱脅迫的恢復能力。由于適度的干旱脅迫導致生理代謝活動雙向波動，從而促進植物的生長量，因此在干旱缺水地區(qū)，把干旱脅迫鍛煉和噴施亞精胺結合，不僅可以降低植株耗水量、節(jié)約灌溉用水、維持作物生長和養(yǎng)分吸收，還可以提高葉片和植株水平的水分利用效率，增強植株的抗逆性。