表面活性劑增強(qiáng)超聲法提取污泥胞外聚合物

周語桐,楊 英*,李衛(wèi)華,張?zhí)锾?吳 亮，程志龍

(安徽建筑大學(xué) a.環(huán)境與能源工程學(xué)院，b.水污染控制與廢水資源化安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230601)

0 引言

胞外聚合物 (Extracellular Polymeric Substances,EPS)是指細(xì)胞在新陳代謝時(shí)分泌的復(fù)雜高分子混合物，成分和微生物的胞內(nèi)物質(zhì)類似，主要是多糖、蛋白質(zhì)和核酸等高分子聚合物。除細(xì)胞與水分以外，EPS是活性污泥的第3種重要組成部分，約占活性污泥總有機(jī)質(zhì)的50% ～ 90%[1]。細(xì)胞外高分子具有疏水性，不但可以與陽離子相結(jié)合，而且對(duì)污泥絮凝沉淀和脫水特性也有較大的影響。確定一種有效的提取方法是研究胞外聚合物對(duì)污泥性能的影響及分析EPS組成的重要前提。

目前，EPS的提取方法一般有離心法、超聲法、熱萃取法、氫氧化鈉法、EDTA 法、陽離子交換樹脂法、“甲醛+NaOH”法和硫酸法等。超聲法因不會(huì)造成二次污染被廣泛使用。該方法可以使水相中的生物絮凝體分散開來，并將大顆粒物破碎分解成小顆粒物[2]，但是提取效率低，只能提取部分EPS。

表面活性劑是一種被廣泛用于工業(yè)生產(chǎn)的化學(xué)物質(zhì)，可以有效地減少兩相之間的界面張力，具有增溶、潤(rùn)濕、潤(rùn)滑、絮凝、分散、抗靜電等諸多特性，可用于分離污泥中的EPS，使細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)均發(fā)生改變[3]。表面活性劑增強(qiáng)超聲法是一種常用提取方法，可以大大提高胞外聚合物的提取效率。本文將以表面活性劑增強(qiáng)超聲法提取污泥胞外聚合物，并與超聲法和表面活性法進(jìn)行對(duì)比分析，旨在為未來廢物資源化利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)原料

活性污泥取自合肥經(jīng)濟(jì)開發(fā)區(qū)廢水廠中的二次沉淀池，呈深褐色，從污水廠取回實(shí)驗(yàn)室后應(yīng)立即進(jìn)行EPS提取。

1.2 試驗(yàn)儀器

試驗(yàn)用儀器包括：電子分析天平(AS 220.RS，RADWAG公司)；超聲波清洗儀(GTSONIC-D20，廣東固特超聲股份有限公司)；恒溫震蕩箱(ZQTY-70S，上海知楚儀器有限公司)；冷凍高速離心機(jī)(FC-18R，廣州市方統(tǒng)生物科技有限公司)；水浴鍋(HH-S2，常州萬達(dá)升實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)；紫外-可見光分光光度計(jì)(UV-1800，日本島津制作所)。

1.3 試驗(yàn)方法

取30 mL污泥樣品,在3 220 g的離心力下離心10 min后倒掉上清液，再分別加入含0，3，6，9，12，15 g NaCl的重懸液恢復(fù)至原體積。磷酸鹽緩沖液為40 mL 0.1 moL/L NaH2PO4·2H2O和60 mL 0.1 moL/L Na2HPO4·12H2O。

試驗(yàn)過程中采用的提取方法有：①超聲法，將重新懸浮后的污泥放置于槽式超聲波清洗儀中進(jìn)行超聲；②表面活性劑法，向重新懸浮后的污泥中添加不同的表面活性劑，再放置于恒溫震蕩箱中以200 r/min的轉(zhuǎn)速分別震蕩0，15，30，45，60 min；③表面活性劑增強(qiáng)超聲法，向重新懸浮后的活性污泥中添加表面活性劑，以200 r/min的轉(zhuǎn)速在恒溫震蕩箱中震蕩1 h，再進(jìn)行超聲。提取結(jié)束后,將所有樣品置于冷凍離心機(jī)中，在10 000 g的條件下離心15 min,再采用0.45 μm的水系濾膜過濾清液，并檢測(cè)多糖、蛋白質(zhì)和核酸等物質(zhì)。

1.4 分析方法

用蒽酮-硫酸比色法測(cè)定多糖含量，葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)；采用考馬斯亮藍(lán)G250法測(cè)定蛋白質(zhì)含量，以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)；采用二苯胺法測(cè)定DNA，小牛胸腺DNA為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。所有樣品測(cè)定3次，取平均值為最終測(cè)定值。

2 結(jié)果與討論

2.1 液相環(huán)境對(duì)EPS提取效果的影響

NaCl投加量對(duì)EPS各組分提取效果的影響如圖1所示。由圖1可知，NaCl的投加量對(duì)EPS各組分的提取效果影響很大。投加9 g NaCl時(shí)，EPS的提取量最高。當(dāng)NaCl投加量在3～9 g時(shí)，隨著投加量增大，多糖與蛋白質(zhì)提取量也在不斷增加；而超過9 g時(shí)，多糖與蛋白質(zhì)的含量均下降。DNA提取量隨著投加量增大而緩慢增加。因此，重懸液確定為投加量為9 g NaCl的PBS溶液，不僅能確保細(xì)胞始終處于相對(duì)完整的狀態(tài)，也能促進(jìn)EPS釋放。

圖1 NaCl投加量對(duì)EPS各組分提取效果的影響

2.2 表面活性劑對(duì)EPS提取效果的影響

表面活性劑對(duì)EPS各組分提取效果的影響如圖2所示。由圖2可知，添加表面活性劑可有效提高EPS提取量。其中，添加CTAB的EPS提取量最高，尤其是多糖的提取量提升最為顯著，其次是SDS。這是由于EPS和二價(jià)陽離子均對(duì)生物的絮凝作用有顯著影響。吐溫對(duì)提高EPS各組分的提取量的作用雖然最低，但其DNA含量卻高于SDS，并且這3種表面活性劑的DNA含量都顯著高于空白組，說明高濃度的表面活性劑有可能導(dǎo)致細(xì)胞破裂。因此，采用CTAB提取EPS。

圖2 表面活性劑對(duì)EPS各組分提取效果的影響

2.3 CTAB投加量對(duì)EPS提取效果的影響

CTAB投加量對(duì)EPS各組分提取效果的影響如圖3所示。由圖3可知，隨著CTAB投加量從4 mg增加到48 mg，多糖和蛋白質(zhì)的提取量大幅度提升；而當(dāng)投加量繼續(xù)提升至60 mg時(shí)，多糖的提取量增加緩慢，蛋白質(zhì)提取量基本不變。其原因在于，較高濃度的表面活性劑對(duì)細(xì)胞的破壞程度較大，使胞內(nèi)的物質(zhì)(蛋白質(zhì)、酸性多糖)被提取出來，又由于其自身具有絮凝作用而部分沉淀在污泥中。隨著CTAB投加量增加，DNA提取量不斷上升，說明更高濃度的表面活性劑對(duì)細(xì)胞的破壞程度更大，胞內(nèi)物質(zhì)可能會(huì)污染EPS。綜合考慮，確定投加48 mg CTAB提取EPS。

圖3 CTAB投加量對(duì)EPS各組分提取效果的影響

2.4 提取時(shí)間對(duì)EPS提取效果的影響

提取時(shí)間對(duì)EPS各組分提取效果的影響如圖4所示。

圖4 提取時(shí)間對(duì)EPS各組分提取效果的影響

由圖4可知，在0～45 min時(shí)，CTAB對(duì)多糖和蛋白質(zhì)的提取量均隨著時(shí)間增加而增加；提取時(shí)間達(dá)到45 min時(shí),EPS的提取量達(dá)到最高值;提取時(shí)間繼續(xù)增加到60 min時(shí)，EPS提取量下降。這是因?yàn)椴糠諩PS的提取只有在厭氧的條件下才能正常進(jìn)行，EPS在長(zhǎng)時(shí)間震蕩的情況下會(huì)與氧氣充分接觸，無法達(dá)到厭氧條件。此外，隨著時(shí)間增加，DNA的提取量先逐步上升，在30～60 min時(shí)始終保持穩(wěn)定狀態(tài)。綜合考慮確定CTAB的最佳提取時(shí)間為45 min。Fr?lund等[4]曾提出EPS最佳提取時(shí)間為0.5～1 h，此時(shí)細(xì)胞裂解的風(fēng)險(xiǎn)最低。

2.5 提取方法對(duì)EPS提取效果的影響

提取方法對(duì)EPS各組分提取效果的影響如圖5所示。由圖5可知，表面活性劑聯(lián)合超聲波法對(duì)EPS的提取量高于超聲波法和表面活性劑法。這是由于表面活性劑中的親水和疏水基團(tuán)具有降低界面間表面張力的作用，從而導(dǎo)致超聲的空化現(xiàn)象增加。一般認(rèn)為，降低表面張力能夠有效提升超聲波的處理效果，降低超聲過程的能耗。

圖5 提取方法對(duì)EPS各組分提取效果的影響

2.6 超聲條件對(duì)EPS提取效果的影響

超聲條件對(duì)EPS各組分提取效果的影響如圖6所示。由圖6可知，當(dāng)提取功率相同時(shí),隨著作用時(shí)間從2 min增加到10 min,多糖和蛋白質(zhì)的提取量均有所上升。這是由于隨著時(shí)間增加,在超聲波作用下部分大顆粒物的粒徑因水力剪切作用變小,從而使溶解度提高。當(dāng)作用時(shí)間相同時(shí),隨著提取功率增加,多糖和蛋白質(zhì)的提取量雖略有增加，但是總體趨勢(shì)趨于平緩。這表明高的超聲功率與表面活性劑的交叉相關(guān)性較差。因?yàn)槌暡ǖ墓β试酱?消耗的能量越大,考慮到能量損耗,最后確定最佳提取功率為100 W。在功率為100 W時(shí)，時(shí)間越長(zhǎng)，EPS提取量越高,但是在2～5 min之間,DNA的提取量變化較為穩(wěn)定,繼續(xù)增加到10 min時(shí),DNA的提取量急劇上升。這是因?yàn)槌暡ㄗ饔脮r(shí)間越長(zhǎng),細(xì)胞的受損程度越大,細(xì)胞內(nèi)的DNA更容易泄露出來。綜合考慮,超聲條件確定為100 W，5 min。

圖6 超聲條件對(duì)EPS各組分提取效果的影響

3 紅外光譜與熒光光譜分析

3.1 紅外光譜分析

不同方法提取的活性污泥EPS的紅外光譜如圖7所示。

圖7 不同方法提取的活性污泥EPS的紅外光譜

3.2 熒光光譜分析

不同方法提取的EPS的三維熒光光譜如圖8所示。提取的EPS主要包含酪氨酸、色氨酸類蛋白質(zhì)、腐殖酸和富里酸。3種方法所提取的EPS在物質(zhì)濃度以及熒光特性上存在區(qū)別。其中，表面活性劑法不能對(duì)腐殖酸和富里酸進(jìn)行有效提取。超聲法和表面活性劑增強(qiáng)超聲法均含有色氨酸特征峰、腐殖酸特征峰和富里酸特征峰，表面活性劑聯(lián)合超聲法的光譜圖中還出現(xiàn)了酪氨酸特征峰，表明此種方法對(duì)酪氨酸的提取優(yōu)于超聲法。表面活性劑聯(lián)合超聲法提取EPS的熒光強(qiáng)度最高，表面活性劑法熒光強(qiáng)度次之，超聲法熒光強(qiáng)度最弱。

(a) 表面活性劑法 (b) 表面活性劑聯(lián)合超聲法 (c) 超聲法圖8 不同方法提取的EPS的三維熒光光譜

4 結(jié)論

表面活性劑增強(qiáng)超聲法EPS提取量最高，提取組分最全面。添加CTAB后，EPS的提取量高于添加其他表面活性劑，且其最佳投加量為48 mg，最佳提取時(shí)間為45 min；在超聲功率為100 W，有效超聲時(shí)間為5 min的優(yōu)化條件下使用CTAB表面活性劑會(huì)使提取效率提高。