結(jié)核分枝桿菌Ag85B多克隆抗體的制備、純化及鑒定＊

李 慧，姚 思，楊雨欣，張 煒，萬巧鳳

（1.寧夏醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)與免疫學(xué)系，寧夏 銀川 750004；2.寧夏醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，寧夏 銀川 750004）

結(jié)核?。╰uberculosis，TB）是由結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，以下簡稱“M.tb”）感染所致的一種慢性傳染病，是世界3大傳染性疾病之一?！?021年全球結(jié)核病報告》數(shù)據(jù)顯示，中國2020年結(jié)核病新發(fā)患者數(shù)為84.2萬，發(fā)病率約為0.059%，在全球30個結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國家中，中國高居第二[1]，因此防治該病極其重要。

M.tb的分泌性蛋白是誘導(dǎo)宿主發(fā)揮免疫效應(yīng)的靶標(biāo)，也是開發(fā)疫苗或診斷試劑的潛在分子[2]。Ag85復(fù)合物是M.tb的分泌蛋白，占M.tb分泌蛋白總量的45%，該復(fù)合物包括Ag85A、Ag85B和Ag85C這3種組分，其中Ag85B占22%[3]。Ag85B是由M.tb的Rv1886c基因編碼的早期分泌性蛋白，其能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生較強(qiáng)的T細(xì)胞和B細(xì)胞免疫反應(yīng)[4]。由此可見，Ag85B可作為良好的免疫原及TB早期診斷的潛在分子。本研究采用微針注射法將Ag85B真核表達(dá)質(zhì)粒pcD-Ag85B經(jīng)大腿肌肉免疫SD大鼠，誘導(dǎo)產(chǎn)生Anti-Ag85B多克隆抗體，旨在為進(jìn)一步研究Ag85的功能及早期診斷結(jié)核病奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

本實驗室成功構(gòu)建了真核表達(dá)質(zhì)粒pcD-Ag85B[5]。Protein G購自上海翊圣生物科技有限公司，硫酸卡那霉素、ⅠPTG、瓊脂糖、胰化蛋白胨及酵母提取物均購自寧夏科博生物科技有限公司，質(zhì)粒無內(nèi)毒素大量提取試劑盒購自O(shè)mega Bio-Tek，鼠抗Ag85B單抗購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司，蛋白marker購自北京全式金生物技術(shù)有限公司，HRP標(biāo)記的羊抗鼠ⅠgG二抗購自美國Merck公司，其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物

實驗動物為SPF級6～7周齡、體重（180±20）g的SD雄性大鼠6只，購自寧夏醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心（合格證書編號為SCXK（寧）2022-0001）。

1.2.2 多克隆抗體制備及滴度測定

適應(yīng)性飼養(yǎng)SD鼠3 d后，采用微針經(jīng)大腿肌肉注射法免疫（200 μg/只），每周免疫1次，連續(xù)免疫3次。首次免疫后的14 d、28 d、42 d，尾端采血且分離血清。采用間接ELⅠSA法將純化的Ag85B蛋白配制成10 μg/mL的溶液包被96孔酶標(biāo)板，0.1 mL/孔，4℃過夜；加入2%BSA封閉液0.1 mL/孔，37℃靜置2 h；TBST洗板4次，加入2倍稀釋（體積分?jǐn)?shù)分別為0.05%、0.025%、0.012 5%、0.006 25%、0.003 125%、1∶640、1∶1 280、1∶2 560、1∶5 120、1∶10 240）的免疫血清，第一列設(shè)為PBS陰性對照，37℃精心孵育l h。

加入HRP標(biāo)記的羊抗鼠ⅠgG（1∶1 000），0.1mL/孔，37℃溫育40 min；PBST洗板，加入底物，0.1 mL/孔，37℃避光孵育15 min后終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀測得OD值為450 nm。實驗孔OD值/陰性對照OD值大于2.1倍的最高樣品稀釋度為抗體的滴度[6]。

1.2.3多克隆抗體的純化

采用pH為7.4的PBS緩沖液稀釋血清樣品，經(jīng)濾膜除去血清中的細(xì)胞殘渣及小顆粒物質(zhì)。將樣品注入預(yù)先平衡好的裝有Protein G填料的結(jié)合柱，結(jié)合2 h后用5倍柱體積PB S洗滌雜質(zhì)。用洗脫緩沖液（0.1 mol/L的Gly，pH為3）進(jìn)行洗脫，再用1 mol/L的Tris-HC（pH為8.5）將抗體pH調(diào)至中性，最后用濃縮管濃縮抗體，定量后在-80℃溫度中保存。

1.2.4 WB檢測Anti-Ag85B抗體與Ag85B特異性結(jié)合情況

取20 μg的Ag85B蛋白，加5×SDS上樣緩沖液混勻，水浴煮沸5 min，經(jīng)12%的SDS-PAGE分離后，半干電轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，以5%脫脂奶粉封閉1 h，TBST洗膜3次，加一抗（純化后的Anti-Ag85B抗體，按1∶1 000稀釋）室溫下孵育1 h，再用TBST緩沖液洗膜3次。加入HRP標(biāo)記的兔抗鼠ⅠgG（1∶2 000），37℃振蕩60 min；加入ECL發(fā)光液，進(jìn)行顯影、定影操作。

2 結(jié)果

2.1 Ag85B蛋白對血清IgG及抗體滴度的影響

抗體滴度的檢測如圖1所示。間接ELⅠSA結(jié)果顯示，一免后第14 d，在免疫組小鼠的血清中檢測到特異性ⅠgG，抗體平均滴度為1∶747；第28 d抗體平均滴度為1∶2 240；第42 d抗體平均滴度為1∶2 667。結(jié)果表明，pcD-Ag85B質(zhì)粒可持續(xù)誘導(dǎo)體液免疫。

圖1 抗體滴度的檢測（ ±s，n=6）

2.2 Anti-Ag85B多克隆抗體的純化

SDS-PAGE凝膠電泳檢測純化前后的Anti-Ag85B多克隆抗體如圖2所示。SDS-PAGE凝膠電泳結(jié)果表明，Ag85B抗血清純化前非特異性雜帶較多，采用Protein G親和層析柱純化后，多數(shù)非特異性抗體被去除，獲得了純度較高的Anti-Ag85B抗體。

圖2 SDS-PAGE凝膠電泳檢測純化前后的Anti-Ag85B多克隆抗體

2.3 WB分析多克隆抗體的特異性

WB檢測Protein G純化后抗體的特異性如圖3所示。純化后的抗血清可與前期[6]制備的Ag85B蛋白特異性結(jié)合，在相對分子質(zhì)量35 kD處出現(xiàn)一條清晰的條帶，且無其他雜帶，說明制備的多隆抗體特異性良好。

圖3 Western blot檢測純化后的Anti-Ag85B多克隆抗體與Ag85B蛋白的特異性結(jié)合

3 討論

目前，用于診斷TB的方法有X光、病原學(xué)檢測法、結(jié)核菌素PPD皮膚試驗及TB特異核酸序列擴(kuò)增法等。其中病原學(xué)檢測是診斷TB的金標(biāo)準(zhǔn)，中國的M.tb病原學(xué)診斷率較低，2020年WHO報告顯示，中國TB病原學(xué)陽性率為47%，低于全世界57%的檢出率，僅靠此法會延誤對患者的治療[7]；PPD皮試具有操作簡單的優(yōu)勢，但難以區(qū)分卡介苗的免疫效果及致病性M.tb的感染，因此診斷價值不高[8]；在TB早期診斷中，核酸擴(kuò)增法是病原學(xué)診斷的重要補(bǔ)充，但因其成本高及對檢測環(huán)境要求嚴(yán)格限制了其在基層醫(yī)院的普及[9]。血清學(xué)檢測具有操作簡便、靈敏度高、適用于肺外結(jié)核和肺結(jié)核等優(yōu)勢[10]，所以篩選靈敏度高、特異性強(qiáng)的M.tb抗原或抗體，并將其應(yīng)用于TB的早期血清學(xué)檢測中，是診斷TB的理想方法。

真核表達(dá)質(zhì)粒將是一種抗原基因重組到真核表達(dá)載體，直接或經(jīng)包裝注入體內(nèi)表達(dá)出相應(yīng)抗原蛋白，此蛋白能刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性體液免疫和細(xì)胞免疫效應(yīng)，從而發(fā)揮免疫保護(hù)作用[11]。真核表達(dá)質(zhì)粒具有制備簡便、成本低廉、穩(wěn)定性及安全性好的優(yōu)勢，越來越受到人們的重視[12]。

本研究采用微針注射法將前期構(gòu)建成功，且證明體外表達(dá)的Ag85B真核表達(dá)質(zhì)粒pcD-Ag85B經(jīng)大腿肌肉免疫SD大鼠，誘導(dǎo)產(chǎn)生并獲得了純度高、特異性強(qiáng)的多克隆抗體，為進(jìn)一步研究Ag85的功能及診斷結(jié)核病奠定了基礎(chǔ)。