Connexin43敲降對血紅素誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡和鐵死亡的影響

陸聰， 桂如林， 呂廣釗， 張志堅(jiān)， 盧小東， 楊勇

(1. 江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013； 2. 廣東省人民醫(yī)院神經(jīng)外科，廣東 廣州 510080)

星形膠質(zhì)細(xì)胞(astrocyte，ASC)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)數(shù)量最多的細(xì)胞，為神經(jīng)元提供營養(yǎng)和機(jī)械支持。中樞神經(jīng)系統(tǒng)在遭受炎癥、腫瘤、損傷等情況下會出現(xiàn)ASC活化，也稱反應(yīng)性膠質(zhì)增生[1-4]。ASC之間存在廣泛的縫隙連接,連接蛋白(Connexin，Cx)是形成縫隙連接的分子基礎(chǔ)，約有20種亞型，ASC、神經(jīng)元和小膠質(zhì)細(xì)胞分別高表達(dá)Cx43、Cx36和Cx32[5]。Cx在細(xì)胞膜上形成的同源或異源六聚體中空結(jié)構(gòu)稱為連接子，具有半通道功能，介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞外液的物質(zhì)交換[6-8]。相鄰細(xì)胞膜上的連接子對接形成縫隙連接通道，允許分子量在1.5 kDa以下的離子、信號分子和神經(jīng)遞質(zhì)等小分子物質(zhì)在相鄰細(xì)胞間傳遞，形成細(xì)胞間離子和代謝物偶聯(lián)，稱為縫隙連接介導(dǎo)的細(xì)胞間通訊(gap junctional intercellular communication，GJIC)[9-10]。此外，Cx43還具有非通道相關(guān)的間接調(diào)控功能：Cx43羧基端可與β-catenin，c-Src，Cyclin E等調(diào)節(jié)蛋白以及細(xì)胞骨架結(jié)合，調(diào)控細(xì)胞的增殖、遷移、分化和細(xì)胞極性[11-13]。

鐵死亡是指一種鐵依賴的程序性細(xì)胞死亡。細(xì)胞外的無機(jī)鐵通常是以無毒的Fe3+的形式與轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合，通過細(xì)胞膜上的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。血紅蛋白降解產(chǎn)生的血紅素是一種強(qiáng)烈的活性氧誘導(dǎo)劑，通過細(xì)胞膜上的轉(zhuǎn)運(yùn)體被轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)，釋放出Fe2+參與芬頓循環(huán)，產(chǎn)生大量自由基引起細(xì)胞鐵死亡[14-15]。

生理狀態(tài)下，ASC之間通過Cx43形成廣泛的細(xì)胞間縫隙連接，形成的合胞體樣結(jié)構(gòu)對維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)具有重要意義[16-19]。前期研究發(fā)現(xiàn)，腦出血后ASC中Cx43表達(dá)下調(diào)，觸發(fā)了Yes相關(guān)蛋白(YAP)核轉(zhuǎn)位，介導(dǎo)了ASC活化過程中的表型轉(zhuǎn)化[20]。但關(guān)于腦出血后ASC中Cx43表達(dá)水平對氧化血紅素(hemin)誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和鐵死亡的影響迄今未見報(bào)道。

本研究通過敲降A(chǔ)SC中Cx43表達(dá)，觀察細(xì)胞對hemin損傷作用的反應(yīng)；通過生信分析，預(yù)測Cx43與鐵死亡的相關(guān)性及可能涉及的信號通路，并進(jìn)行驗(yàn)證，為后續(xù)深入的機(jī)制研究提供線索。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

SD紅皮鼠購自江蘇大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，本研究獲得廣東省人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)(No.GDREC2019173A)。Cx43干擾和對照慢病毒(上海漢恒生物科技公司)，具體堿基序列見表1。一步法Tunel細(xì)胞凋亡檢測試劑盒和活性氧(ROS)、乳酸脫氫酶(LDH)檢測試劑盒(南通碧云天生物技術(shù)公司)；丙二醛(MDA)、還原型谷胱甘肽(GSH)測定試劑盒(南京建成生物技術(shù)研究所)。小鼠抗α微管蛋白抗體(武漢博士德生物公司)，兔抗Cx43、YAP、Bcl-2、Caspase3、c-Caspase3抗體(美國CST公司)；兔抗Bax抗體(英國Abcam公司)；兔抗谷胱甘肽過氧化物酶4(GPX4)抗體(美國Affinity公司)。RIPA裂解液及HPR標(biāo)記的羊抗兔二抗(南通碧云天生物技術(shù)公司)。

1.2 方法

1.2.1 ASC純化培養(yǎng) 參照文獻(xiàn)[21]的方法提取新生SD大鼠的大腦皮層ASC，取出生1～2 d的SD紅皮鼠，采用5%異氟烷吸入麻醉后斷頭處死，75%乙醇浸泡消毒后取腦，顯微鏡下分離大腦皮層，去除腦膜、血管和海馬。剩余的皮層組織轉(zhuǎn)入0.25%的胰蛋白酶溶液中，輕輕吹打，37 ℃消化10 min。采用孔徑70 μm細(xì)胞濾網(wǎng)過濾組織殘?jiān)?，收集濾液，1 000 r/min離心5 min收集細(xì)胞沉淀，重懸于10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液中，接種于多聚賴氨酸包被的培養(yǎng)皿中，置于培養(yǎng)箱內(nèi)37 ℃、95%濕度和5% CO2條件下培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞融合時(shí)，將培養(yǎng)瓶在37 ℃搖床上以220 r/min振蕩1 h，去除小膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)前體細(xì)胞。經(jīng)免疫熒光染色鑒定，通過此法分離培養(yǎng)的ASC純度超過95%，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

表1 Cx43干擾和對照慢病毒堿基序列

1.2.2 慢病毒感染及干擾慢病毒篩選 ASC以5×103/孔的密度接種于96孔板中，待細(xì)胞貼壁。根據(jù)病毒液滴度，分別計(jì)算感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection,MOI)為3，10，60和100時(shí)所需的病毒液用量，用完全培養(yǎng)液稀釋，并加入終濃度為5 μg/mL的聚苯乙烯，每孔加入相應(yīng)MOI值的含慢病毒培養(yǎng)液50 μL，4 h后，每孔再加入50 μL不含病毒液的完全培養(yǎng)液(半體積感染法)。病毒感染24 h后，棄去含有病毒液的培養(yǎng)液，換上新鮮的完全培養(yǎng)液，于37 ℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。感染72 h后，在熒光顯微鏡下觀察綠色熒光細(xì)胞百分比，確定各MOI值的感染效率。選擇合適的MOI值用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

將ASC按照5×105/孔的密度接種于6孔板中，按照上述慢病毒感染方法，使用對應(yīng)的MOI值，進(jìn)行Cx43-shRNA1，Cx43-shRNA2，Cx43-shRNA3和Cx43NC感染。72 h后收集細(xì)胞，提取蛋白用于蛋白質(zhì)印跡檢測Cx43表達(dá)，鑒定各慢病毒的干擾效率，篩選干擾效率最高的慢病毒用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 細(xì)胞分組及處理 將ASC按照5×105/孔的密度接種于6孔板中，分為對照組(Control)、溶劑對照組(Vehicle)、hemin組、Cx43NC+hemin組、Cx43KD+hemin組。待細(xì)胞貼壁后按照上述慢病毒感染操作進(jìn)行Cx43-shRNA1和Cx43NC慢病毒感染，48 h后，向各組細(xì)胞中加入如下處理因素：對照組為無血清DMEM，溶劑對照組為含有同等稀釋度hemin溶劑的無血清DMEM，hemin組、Cx43NC+hemin組和Cx43KD+hemin組加入終濃度為25 μmol/L hemin的無血清DMEM。對于Verteporfin(Vp，YAP抑制劑)干預(yù)實(shí)驗(yàn)分組：Cx43NC+hemin組、Cx43KD+hemin組和Cx43KD+hemin+Vp處理組。Vp的終濃度為5 μmol/L。

1.2.4 ROS,GSH,MDA測定和LDH釋放實(shí)驗(yàn)檢測鐵死亡 上述各組接受處理12 h后的ASC，吸出培養(yǎng)液，加入終濃度為10 μmol/L的DCFH-DA熒光探針，37 ℃孵育20 min后去除DCFH-DA，用無血清細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞3次，以充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA。消化收集細(xì)胞，采用熒光酶標(biāo)儀檢測各孔熒光強(qiáng)度。以對照組為參照，計(jì)算各組細(xì)胞的相對ROS產(chǎn)生量。

收集上述各組接受處理12 h后的ASC，裂解細(xì)胞并提取蛋白，采用BCA試劑盒測定蛋白濃度，取細(xì)胞裂解蛋白樣品，參照試劑盒說明書進(jìn)行MDA和GSH檢測，參照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出單位蛋白含量中MDA和GSH的含量，并以對照組為參照，計(jì)算各處理組細(xì)胞的相對MDA和GSH含量。

收集上述各組接受處理24 h后的ASC，參照LDH檢測試劑盒說明書進(jìn)行檢測。按照以下公式計(jì)算細(xì)胞死亡率。細(xì)胞死亡率(%)=(處理組樣品光密度-無細(xì)胞空白培養(yǎng)液對照組光密度)/(細(xì)胞最大酶活性的光密度-無細(xì)胞空白培養(yǎng)液對照組光密度)×100。

1.2.5 Tunel染色檢測細(xì)胞凋亡 收集上述處理過12 h的細(xì)胞，PBS洗滌3次，加入4%多聚甲醛溶液固定1 h。使用一步法Tunel染色試劑盒檢測細(xì)胞凋亡，參照試劑盒說明書進(jìn)行Tunel染色，熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.6 蛋白質(zhì)印跡檢測細(xì)胞凋亡和鐵死亡相關(guān)蛋白表達(dá) 收集上述處理過的細(xì)胞，采用RIPA蛋白裂解液提取細(xì)胞總蛋白，測定蛋白濃度后，按照每泳道30 μg上樣進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜，依次孵育抗體后加入超敏ECL，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察結(jié)果并拍照，并用ImageJ進(jìn)行灰度分析。使用的一抗和二抗稀釋度：α微管蛋白(1 ∶1 000)，Cx43(1 ∶1 000)，Bax(1 ∶1 000)，Bcl2(1 ∶1 000)，GPX4(1 ∶1 000)，Caspase3(1 ∶1 000)，c-Caspase3(1 ∶1 000)；HPR標(biāo)記的羊抗兔二抗(1 ∶5 000)。

1.2.7 免疫熒光染色檢測YAP表達(dá) 將ASC以每孔5×104的密度接種于24孔板。按照上述加入處理因素后，將細(xì)胞用4%多聚甲醛固定1 h。PBS洗滌3次，室溫下加入0.3% Triton X-100破膜15 min后加入10% BSA溶液封閉1 h。隨后加入兔抗YAP抗體(1 ∶250)并于4 ℃孵育過夜。PBS洗滌后，加入驢抗兔IgG(1 ∶300)，室溫孵育1 h。PBS洗滌后，DAPI染色5 min。激光共聚焦顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.8 生物信息學(xué)分析

1.2.8.1 采用生物信息學(xué)對Cx43相關(guān)性差異基因進(jìn)行分析 為了預(yù)測Cx43在腦組織中的功能，提取了GTEx數(shù)據(jù)庫正常腦組織轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，根據(jù)Cx43表達(dá)量對轉(zhuǎn)錄組表達(dá)矩陣進(jìn)行分組，利用R語言pheatmap包繪制熱圖，當(dāng)兩組樣本有截然不同的基因表達(dá)特征時(shí)，利用R語言limma包進(jìn)行差異基因分析，Log2(差異倍數(shù))的絕對值大于均值+2倍標(biāo)準(zhǔn)差且標(biāo)準(zhǔn)化P值小于0.05被認(rèn)為是顯著差異基因，基于此得出Cx43相關(guān)性差異基因以及其在不同分組中表達(dá)差異倍數(shù)，用R語言ggplot()函數(shù)繪制火山圖。

1.2.8.2 采用生物信息學(xué)對Cx43相關(guān)性差異基因集富集分析 利用上述方法得到的差異表達(dá)基因及其表達(dá)變化倍數(shù)，使用R語言GSEABase包中的GSEA()函數(shù)，選擇“h.all.v7.2.symbols.gmt”作為注釋基因集、設(shè)定置換次數(shù)為1 000次進(jìn)行基因集富集分析。結(jié)果中NES絕對值>1、NomP<0.05且FDRP<0.25被認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。最后選擇顯著富集到的GO基因集，包括Hippo通路基因集，鐵離子通道結(jié)合基因集，脂質(zhì)過氧化基因集，缺氧應(yīng)激基因集等，利用GSEAplot()函數(shù)繪制富集圖。

1.2.8.3 采用生物信息學(xué)構(gòu)建轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)并分析轉(zhuǎn)錄因子 轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)(transcriptional regulatory network,TRN)由轉(zhuǎn)錄因子與其靶基因組成，轉(zhuǎn)錄因子識別特定DNA序列并在基因組層面上調(diào)控基因表達(dá)。基于此，提取GTEx數(shù)據(jù)庫中1 141個(gè)正常腦組織轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，通過sample()函數(shù)隨機(jī)抽取100個(gè)轉(zhuǎn)錄組矩陣，將其作為標(biāo)準(zhǔn)矩陣，使用R語言RTN包tni.constructor()算法構(gòu)建轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)相關(guān)結(jié)構(gòu)域(transcriptional enhanced associate domain，TEAD)轉(zhuǎn)錄因子家族的轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)；然后利用Cx43表達(dá)量作為分組條件對這1 141個(gè)正常腦組織轉(zhuǎn)錄組表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行分組，使用上述步驟構(gòu)建好的轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，利用tni2tna.preprocess()進(jìn)行轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)富集分析，并利用tna.plot.gsea2()函數(shù)繪制富集圖。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 ASC中Cx43敲降效果的驗(yàn)證

Cx43NC和Cx43-shRNA1慢病毒MOI=60時(shí)感染效率最高，Cx43-shRNA2和Cx43-shRNA3慢病毒MOI=100時(shí)感染效率最高。蛋白質(zhì)印跡檢測不同慢病毒感染后ASC中Cx43表達(dá)水平，結(jié)果顯示Cx43-shRNA1的敲降效率最佳(P<0.01)。見圖1。因此選擇Cx43NC(MOI=60)和Cx43-shRNA1(MOI=60)慢病毒進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

A：不同MOI下病毒感染效率(標(biāo)尺為100 μm)；B：不同干擾慢病毒的敲降效率驗(yàn)證。①: Control； ②: NC； ③: shRNA1； ④: shRNA2； ⑤: shRNA3

2.2 敲降A(chǔ)SC中Cx43表達(dá)后，hemin誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡減少，鐵死亡增加

與對照組相比，hemin處理ASC引起細(xì)胞凋亡和鐵死亡比例顯著增加(P<0.01)，細(xì)胞凋亡相關(guān)指標(biāo)Bax/Bcl-2和c-Caspase3/Caspase3顯著升高(P<0.01)，鐵死亡負(fù)相關(guān)指標(biāo)GPX4和GSH含量顯著降低(P<0.01)；與hemin處理組和Cx43NC+hemin組相比，Cx43KD+hemin組凋亡細(xì)胞比例顯著降低(P<0.05)，細(xì)胞凋亡相關(guān)指標(biāo)Bax/Bcl-2，c-Caspase3/Caspase3和鐵死亡負(fù)相關(guān)指標(biāo)GPX4和GSH表達(dá)量顯著降低(P<0.01和P<0.05)，鐵死亡正相關(guān)指標(biāo)ROS和MDA的產(chǎn)生顯著增加(P<0.05)，細(xì)胞鐵死亡比例顯著升高(P<0.05)。見圖2。說明敲降A(chǔ)SC中Cx43表達(dá)后，細(xì)胞對hemin誘導(dǎo)的凋亡具有抵抗作用，而對鐵死亡更敏感。

A： 蛋白印跡檢測細(xì)胞凋亡和鐵死亡相關(guān)蛋白表達(dá)及灰度分析； B： Tunel染色結(jié)果及凋亡細(xì)胞百分比(標(biāo)尺為100 μm)； C： LDH釋放實(shí)驗(yàn)測得細(xì)胞鐵死亡率及鐵死亡相關(guān)指標(biāo)檢測結(jié)果。①： Control； ②： Vehicle； ③： hemin； ④： Cx43NC+hemin； ⑤： Cx43KD+hemin

2.3 生信分析提示Cx43通過TEAD3調(diào)控鐵死亡

熱圖所示GTEx正常人腦組織轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中，Cx43高/低表達(dá)的樣本擁有截然不同的基因特征(圖3A)，因此，利用此分組信息進(jìn)行差異基因表達(dá)分析，發(fā)現(xiàn)有677個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，872個(gè)基因表達(dá)下調(diào)(圖3B)；利用差異表達(dá)基因的倍數(shù)變化信息，并使用基因注釋基因集對其進(jìn)行基因集富集分析(圖3C)，得出Cx43與Hippo信號通路、鐵離子結(jié)合基因集、脂質(zhì)過氧化通路、缺氧應(yīng)激等通路顯著相關(guān)，提示Cx43可能參與調(diào)控脂質(zhì)代謝以及鐵死亡。進(jìn)一步利用R語言RTN包進(jìn)行轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析(圖3D、3E)，得出TEAD轉(zhuǎn)錄因子家族中TEAD3富集結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示TEAD3可能參與調(diào)控Cx43相關(guān)性下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。

2.4 ASC中Cx43敲降引起YAP核轉(zhuǎn)位

對照組中YAP基本均表達(dá)于胞質(zhì)內(nèi)，hemin處理組少部分細(xì)胞出現(xiàn)YAP核轉(zhuǎn)位，在Cx43KD組中可見大量的細(xì)胞存在YAP核轉(zhuǎn)位現(xiàn)象(圖4中白色箭頭)。提示敲降A(chǔ)SC中Cx43會抑制Hippo信號通路，觸發(fā)YAP核轉(zhuǎn)位。

2.5 Verteporfin處理逆轉(zhuǎn)Cx43敲降引起的細(xì)胞凋亡抵抗和鐵死亡增敏

與Cx43KD+hemin處理組相比，Cx43KD+hemin+Vp處理組細(xì)胞凋亡率增高而細(xì)胞鐵死亡率降低(圖5)，提示Cx43敲降對細(xì)胞凋亡和鐵死亡的影響被部分逆轉(zhuǎn)。

A： GTEx正常人腦組織轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中Cx43表達(dá)熱圖； B： Cx43高/低表達(dá)組差異基因表達(dá)分析火山圖； C： 基因集富集分析； D～E： 轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析

①: Control； ②: Vehicle； ③: hemin； ④: Cx43NC+hemin； ⑤: Cx43KD+hemin。標(biāo)尺為75 μm

A： Tunel染色結(jié)果及凋亡細(xì)胞百分比； B： LDH釋放實(shí)驗(yàn)測得細(xì)胞鐵死亡率。①: Cx43NC+hemin； ②: Cx43KD+hemin； ③: Cx43KD+hemin+Vp

3 討論

ASC是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)最重要且數(shù)量最龐大的支持細(xì)胞。ASC之間通過Cx43介導(dǎo)的細(xì)胞間縫隙連接形成離子和代謝物偶聯(lián)，對于維持組織細(xì)胞穩(wěn)態(tài)具有重要作用[16-19]。研究表明，ASC在遭受創(chuàng)傷、炎癥、腫瘤等情況下發(fā)生活化，伴隨著Cx43表達(dá)水平及其通道功能改變。

前期研究發(fā)現(xiàn)，Cx43介導(dǎo)的通道功能對于細(xì)胞凋亡和鐵死亡具有重要影響：腦出血背景下Cx43 GJIC功能下降，Cx43半通道出現(xiàn)異常開放。維持Cx43 GJIC功能有助于緩解細(xì)胞外微環(huán)境中Fe2+負(fù)荷，并通過健康細(xì)胞向受損細(xì)胞輸送GSH以及代謝底物等幫助受損細(xì)胞免于鐵死亡及凋亡。ASC在遭受hemin引起的氧化應(yīng)激損傷后，半通道異常開放會導(dǎo)致細(xì)胞膜通透性增加，細(xì)胞內(nèi)的ATP外溢以及細(xì)胞外Ca2+內(nèi)流，激活一系列炎癥反應(yīng)并引起細(xì)胞凋亡，阻斷半通道有助于保護(hù)細(xì)胞免于凋亡(數(shù)據(jù)未在本文中顯示)。

由于Cx43具有GJIC和半通道功能以及非通道相關(guān)的基因表達(dá)調(diào)控等多種功能，Cx43 GJIC和半通道在腦出血后繼發(fā)損傷中具有截然不同的作用，為了探討Cx43的基因表達(dá)調(diào)控功能在腦出血后繼發(fā)性損傷中的作用及機(jī)制，本研究采用干擾慢病毒敲降A(chǔ)SC中Cx43表達(dá)，從而觀察ASC對hemin誘導(dǎo)的凋亡和鐵死亡的反應(yīng)。結(jié)果顯示敲減ASC中Cx43表達(dá)后，細(xì)胞對hemin誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡抵抗能力增強(qiáng)，而鐵死亡敏感性增高。然而，Yu等[22]在順鉑誘導(dǎo)的急性腎損傷模型中發(fā)現(xiàn)，敲降Cx43表達(dá)可以抑制腎小管上皮細(xì)胞凋亡和鐵死亡，但具體機(jī)制不明。這與本研究關(guān)于敲降Cx43對細(xì)胞鐵死亡的影響存在分歧，可能是由于所研究的組織細(xì)胞類型以及Cx43基礎(chǔ)表達(dá)水平差異有關(guān)。

為了研究Cx43與鐵死亡的相關(guān)性及Cx43調(diào)控鐵死亡的分子機(jī)制，本研究進(jìn)行了GSEA分析，結(jié)果顯示Cx43與鐵代謝、脂氧合酶以及Hippo信號通路密切相關(guān)，并且極有可能通過Hippo通路中的TEAD3調(diào)控細(xì)胞鐵死亡。Hippo通路是感知細(xì)胞外基質(zhì)硬度和介導(dǎo)細(xì)胞接觸抑制的重要信號通路，參與調(diào)控組織器官發(fā)育。YAP是Hippo通路的關(guān)鍵效應(yīng)分子，Hippo通路的失活使原本被磷酸化而錨定于胞質(zhì)中的YAP得以釋放從而進(jìn)入細(xì)胞核，與核內(nèi)的TEAD結(jié)合形成轉(zhuǎn)錄復(fù)合體，調(diào)控間充質(zhì)表型轉(zhuǎn)化、細(xì)胞增殖及抗凋亡相關(guān)基因的表達(dá)[23]。本研究通過YAP免疫熒光染色對生信分析結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)敲降A(chǔ)SC中Cx43表達(dá)后出現(xiàn)YAP核轉(zhuǎn)位，且采用YAP抑制劑可以逆轉(zhuǎn)Cx43敲降對細(xì)胞凋亡和鐵死亡的影響。證實(shí)了Cx43可以通過Hippo通路調(diào)控細(xì)胞凋亡和鐵死亡。

在本課題組前期研究中發(fā)現(xiàn)，Cx43與YAP存在共定位，Cx43敲降可以觸發(fā)YAP核轉(zhuǎn)位，與TEAD結(jié)合啟動ASC間充質(zhì)表型轉(zhuǎn)化[20]。本研究利用Tunel染色發(fā)現(xiàn)敲降Cx43表達(dá)的ASC表現(xiàn)出對hemin誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的抵抗效應(yīng)。然而通過檢測細(xì)胞壞死及GPX4含量發(fā)現(xiàn)，敲降Cx43的表達(dá)增加了ASC對hemin誘導(dǎo)的鐵死亡的敏感性。在腫瘤領(lǐng)域，大量研究表明間充質(zhì)表型轉(zhuǎn)化的腫瘤細(xì)胞增殖、遷移及抗凋亡能力增強(qiáng)。但最新研究表明，間充質(zhì)表型的腫瘤細(xì)胞反而對鐵死亡的耐受性降低，可能與Hippo通路調(diào)控NADH氧化酶NOX以及脂氧合酶LOX表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化損傷有關(guān)[15,24-26]。本研究發(fā)現(xiàn)敲降A(chǔ)SC中Cx43表達(dá)后細(xì)胞對hemin誘導(dǎo)的鐵死亡敏感性增加?；谇捌贑x43敲降觸發(fā)了YAP核轉(zhuǎn)位的研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)合本研究中的生信分析，提示Cx43敲降極有可能通過抑制Hippo通路，促進(jìn)YAP核轉(zhuǎn)位，與TEAD3結(jié)合形成轉(zhuǎn)錄復(fù)合體，調(diào)控細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化、抗凋亡和調(diào)控LOX、NOX等促鐵死亡基因的表達(dá)而實(shí)現(xiàn)。本研究為后續(xù)進(jìn)一步探討Cx43調(diào)控細(xì)胞凋亡和鐵死亡的機(jī)制提供了重要線索。